专利摘要

本发明涉及一种细胞悬液中死亡细胞分离去除的方法。本申请发明人发现明胶能够极大吸附活性细胞，而对死亡细胞及其碎片和释放的损失因子基本无吸附能力，并基于所述发现，设计一种将细胞悬液中活细胞与明胶吸附后，再采用细胞分离介质通过密度离心方法去除死细胞和细胞碎片及其释放的损伤相关分子的方法。本发明的方法简单、高效，且活细胞得率高，基本无损伤相关因子，得到的活细胞活性也不受影响。

权利要求

1.一种去除细胞悬液中死亡细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）配制明胶溶液，并滤膜过滤除菌；

（2）调整细胞悬液中细胞数量；

（3）将细胞悬液与明胶溶液混匀，并室温下静置；

（4）将细胞分离液和步骤（3）中制备的含明胶细胞悬液加入离心管中，室温下离心；

（5）弃去步骤（4）中离心管中的液体，将离心管管底的细胞沉淀重悬后，再次室温下离心；

（6）弃去步骤（5）中的液体，使用细胞培养液重悬细胞沉淀，即得去除死亡细胞后的活细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中细胞悬液与明胶溶液混合溶液中明胶的终浓度为0.01g/ml-0.05g/ml。

3.据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中细胞悬液与明胶溶液混合溶液中明胶的终浓度为0.02g/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中调整后的细胞数量为106-107个/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的静置为室温下静置8分钟以上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的细胞分离液选自Percoll细胞分离液、含聚蔗糖分离液、含泛影葡胺分离液中任意一种或其组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的离心为350-450g室温离心15-30分钟；所述步骤（5）中的离心为750-850g室温离心3-7分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，使用PBS溶液调整细胞浓度；步骤（5）中，使用PBS溶液重悬细胞沉淀。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，将细胞悬液与明胶溶液1:1混匀。

10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）称取明胶溶于PBS溶液中，待明胶完全溶解后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，明胶浓度为0.02g-0.1g/ml；

（2）用PBS溶液调整细胞悬液中细胞浓度为106-107个/ml；

（3）将细胞悬液与明胶溶液1:1混匀，并室温下静置8分钟以上；

（4）将细胞分离液和步骤（3）中制备的含明胶细胞悬液加入离心管中，两者的体积比为1:2-2:1，350-450g室温离心15-30分钟，所述细胞分离液选自Percoll细胞分离液、含聚蔗糖分离液、含泛影葡胺分离液中任意一种或其组合；

（5）弃去步骤（4）中离心管中的液体，将离心管管底的细胞沉淀用PBS溶液重悬后，750-850g室温离心3-7分钟；

（6）弃去步骤（5）中的液体，使用细胞培养液重悬细胞沉淀，即得去除死亡细胞后的活细胞悬液。

说明书

技术领域

本发明主要涉及生物细胞培养分离纯化技术，特别涉及细胞悬液中死亡细胞分离去除的方法，属于生物细胞培养技术领域。

背景技术

在悬浮细胞的非连续性培养过程中，根据整体细胞生长分裂的状况可以将整个细胞培养周期分为四个时期：潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期。在细胞培养过程中，细胞由于衰老、培养液PH值改变，培养液中不良物质刺激以及操作方式不当等诸多因素，不可避免会出现部分细胞死亡的现象。通常，对数生长期后期开始有一小部分细胞会出现凋亡的迹象，进入稳定期后凋亡的细胞就会越来越多，细胞死亡后由于细胞结构的破坏会释放出损伤相关分子，主要包括HAMGB1、ATP、尿酸、热激蛋白、组氨酸、线粒体蛋白、核苷酸以及各种溶解酶等，这些物质大多能影响活细胞的生长状态，最终导致培养细胞的整体死亡。因此，及时有效去除死亡细胞对于细胞的成功培养以及下游应用至关重要。

对于贴壁生长的细胞来说，这些死亡细胞由于失去贴壁能力而悬浮在培养液中，可以通过更换培养液的方式去除。但对于悬浮生长的细胞来说，死亡细胞与存活细胞共同悬浮存在于培养液中，无法通过更换培养液的方式去除死亡细胞。目前死细胞去除试剂盒其作用机制是通过磁珠偶联特异性抗体，识别并结合暴露在死细胞表面的保守配体后去除死亡细胞。该方法的缺点是：1、去除效果受到死细胞表面配体是否表达以及表达量高低的影响；2、不能去除培养液中的细胞碎片。

专利CN201911107953.7公开了一种悬浮细胞培养中死细胞的去除方法，其直接使用ficoll人淋巴分离液，利用活细胞与死亡细胞及其碎片的密度差异，通过两步离心去除杂质碎片。我们实验发现，该方法活细胞损失率较高，对发酵效率影响较大，且每次仅能处理少量培养液，尤其难以去除死亡细胞释放的损伤相关分子，对得到活细胞的活性有较大影响。

因此，寻找一种能够简便快捷去除死亡细胞及其释放的损伤相关分子、且活细胞损失少、活性高、得率高的去除细胞悬液中死亡细胞的方法仍是迫切的，而本发明正是提供一种高效去除死亡细胞的方法。

发明内容

本申请发明人，在研究中意外发现，一定浓度的明胶能够极大的吸附活细胞，而对死亡细胞及其碎片和释放的损失因子基本无吸附能力。因此，发明人利用该特性，再采用细胞分离介质通过密度离心方法去除死细胞和细胞碎片及其释放的损伤相关分子。该方法简单、高效，且活细胞得率高，基本无损伤相关因子，得到的活细胞活性不受影响。

为实现上述目的，本发明提供如下方法：明胶溶液的制备：按每毫升PBS溶液中加入0.02g-0.1g明胶的比例，称取明胶溶于PBS溶液中，40℃水浴，待明胶完全溶解后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌；明胶浓度为0.02g-0.1g/ml。

血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数量，用PBS溶液调整细胞浓度为106-107个/ml。

将细胞悬液与0.02g-0.1g/ml明胶溶液按体积比1：1混匀，明胶终浓度为0.01g/ml-0.05g/ml。室温静置8分钟以上；离心管中先加入1.051-1.059 g/ml 的 Percoll细胞分离液后，再缓慢加入上述方法制备的细胞悬液。细胞悬液与Percoll细胞分离液的体积比为1:2-2:1。350-450g室温离心15-30分钟。此时，活细胞被离心沉淀至管底，死细胞及细胞碎片存在于液体中。倒掉所有液体后，用适量PBS重悬离心管管底的细胞沉淀， 750-850g室温离心3-7分钟，细胞培养液重悬细胞后即收获活细胞。

本发明方法中，使用的细胞分离液不仅限于Percoll，还可以使用包含聚蔗糖、泛影葡胺中任意一种或其组合的细胞分离液。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中。

图1：使用本发明方法细胞分离前后对比图，其中，A为U937细胞，B为S180细胞，C为Molt-4细胞。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

称取4g明胶溶于100ml PBS溶液中，40℃水浴，待明胶完全溶解后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，明胶浓度为0.04g/ml;

用台盼蓝染色方法分别检测悬浮培养的U937细胞、S180细胞和Molt-4细胞中的死细胞数量，计算死亡细胞比例。

血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数量后，将细胞浓度调整为107个/ml；

分别吸取3ml上述细胞悬液与3ml 上述明胶溶液混匀，明胶终浓度为0.02g/ml，室温静置10分钟。15ml离心管中先加入3ml 1.056 g/ml 的 Percoll细胞分离液，再缓慢加入3ml细胞悬液。400g室温离心20分钟。倒掉所有液体后，用3ml PBS重悬离心管管底的细胞沉淀，800g室温离心5分钟，用3ml细胞培养液重悬细胞后即收获活细胞。

用台盼蓝染色方法分别检测收获细胞中的死细胞数量，计算死亡细胞比例。

实验结果：分离前、后的细胞悬液经台盼蓝染色后，可见分离前细胞悬液中存在大量染色阳性细胞（细胞蓝染）和细胞碎片，表明细胞悬液中含有较多的死亡细胞；经分离后，仅存在少量染色阳性细胞（见图1），几乎去除掉细胞碎片。计数各组细胞在分离前后的细胞总数和死亡细胞数量，计算分离前、后的死亡细胞比例以及分离后活细胞的获得率，可见该方法在有效去除细胞悬液中的死细胞同时，避免了分离过程中活细胞的丢失，具有较高的活细胞获得率（见表1）。

同时，按照上述专利CN201911107953.7中的方法进行相同的实验，结果虽然能取得类似的死细胞去除率，但其活细胞得率仅为70%多，细胞损失较大，且损伤相关分子含量较高。

表1：实验结果表

实施例2

按照实施例1的方法，使用不同终浓度的明胶进行对比实验，测得的活细胞得率结果比较如下表2所示。也就是说，明胶的浓度对活细胞得率存在明显的影响，推测可能是由于浓度升高时，明胶溶液逐渐粘稠，明胶分子间的相互作用，影响到其与活细胞的结合。

表2：活细胞得率比较

实施例3

按照实施例1的方法，使用不同Percoll与ficoll细胞分离液进行对比实验，测得的活细胞得率和死亡细胞去除效果如下表3所示。可见，本申请的方法中，明胶吸附活细胞更适于使用Percoll细胞分离液。

一种去除细胞悬液中死亡细胞的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。