一种具有抗油脂氧化功能的活性肽及其制备方法和应用

IPC分类号 : C12P21/06,C07K1/14,C07K1/30,C11B5/00

申请号

CN201910150621.0

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专利摘要

本发明公开了一种具有抗油脂氧化功能的活性肽及其制备方法和应用，属于植物源性的生物活性肽技术领域。本发明选用油料加工副产物即提油后油料作物作为原料，经过蛋白提取、红外预处理、蛋白酶解、冷冻干燥、提取亲脂部分和真空浓缩并干燥等步骤，制备得到了具有清除DPPH自由基、金属离子螯合、抑制脂质过氧化、延长植物油氧化诱导时间、增强乳液稳定性等功能特性的抗油脂氧化肽，可以作为天然抗氧化剂应用在油脂及其他含油脂食品的贮藏和保鲜中，解决油脂氧化致使产品劣变、产生有害产物的问题，延长食品货架期；本发明方法对于遏制油脂氧化、保障食品安全、促进技术进步具有重大的现实意义和社会意义。

权利要求

1.一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)准备蛋白质：从提取了油之后的油料作物中提取蛋白质，干燥得到蛋白干粉，备用；

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(3)蛋白酶酶解处理：将步骤(2)得到的预处理后的蛋白干粉配置成溶液，然后利用蛋白酶进行酶解处理；

(4)冷冻干燥：将酶解产物的上清液进行冷冻干燥得到多肽粉；

(5)提取亲脂性多肽：将冻干后的多肽粉溶于乙醇和正己烷的混合溶液中，温度30～60℃下在10～100Hz的超声波中处理20～120min，随后在0～5℃下离心，收集上清液；

(6)真空浓缩并干燥：将步骤(5)得到的上清液真空浓缩并除去残留有机溶剂，即可得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述油料作物为富含疏水性氨基酸的作物。

3.根据权利要求1或2所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取出蛋白质的方法为碱溶酸沉法，具体为：将提油后的油料作物重悬于pH为7～10的稀碱溶液中0.5～5h，离心取上清液后再用酸将pH调至3～6，经分离后将沉淀重悬于水中并中和至pH为6～8，干燥得到蛋白干粉，备用。

4.根据权利要求1或2所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为能够特异性切割疏水性氨基酸的蛋白酶，包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶中的任一种或几种。

5.根据权利要求3所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为能够特异性切割疏水性氨基酸的蛋白酶，包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶中的任一种或几种。

6.根据权利要求1、2、5任一项所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述蛋白酶的浓度为1.5～2.5wt％；所述蛋白干粉配置成质量体积比g/mL浓度为5～20％的溶液。

7.根据权利要求3项所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述蛋白酶的浓度为1.5～2.5wt％；所述蛋白干粉配置成质量体积比g/mL浓度为5～20％的溶液。

8.根据权利要求4项所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述蛋白酶的浓度为1.5～2.5wt％；所述蛋白干粉配置成质量体积比g/mL浓度为5～20％的溶液。

9.根据权利要求1、2、5、7、8任一项所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：

(1)蛋白提取：将提油后的油料作物重悬于pH为7～10的稀碱溶液中0.5～5h，离心取上清液后再用酸将pH调至3～6，经分离后将沉淀重悬于水中并中和至pH为6～8，干燥得到蛋白干粉；

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(3)蛋白酶解：将步骤(2)得到的预处理后的蛋白干粉配置为浓度为5～20％的溶液，调节溶液至最适pH范围，预热至蛋白酶的最适温度范围并保温5～30min，加入蛋白酶，在最适酶解条件下保温震荡反应0.5～15h，灭酶，冷却，调节浆液pH至6～8，分离得到的酶解上清液；

(4)冷冻干燥：将酶解上清液冷冻干燥得到多肽粉；

(5)提取亲脂多肽：利用超声辅助溶剂法分离亲脂组分，即将冻干后的多肽粉溶于乙醇和正己烷的混合溶液中，温度30～60℃下在10～100Hz的超声波中处理20～120min，随后在0～5℃下分离收集上清液；

(6)真空浓缩并干燥：将上述溶液在20～50℃下真空离心浓缩0.5～2mL，将浓缩的多肽溶液在20～50℃干燥，除去残留有机溶剂，即可得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

10.根据权利要求3所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(4)冷冻干燥：将酶解上清液冷冻干燥得到多肽粉；

11.根据权利要求4所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(4)冷冻干燥：将酶解上清液冷冻干燥得到多肽粉；

12.根据权利要求6所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(4)冷冻干燥：将酶解上清液冷冻干燥得到多肽粉；

13.根据权利要求1～12任一项所述的一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法制备得到抗油脂氧肽。

14.权利要求13所述的具有抗油脂氧化功能的活性肽在油脂抗氧化中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物源性的生物活性肽技术领域，具体涉及一种具有抗油脂氧化功能的活性肽及其制备方法和应用。

背景技术

油脂在人们日常生活和化学工业上都占有十分重要的地位，而且随着食用油脂生产及加工技术的不断进步，油脂的应用范围已越来越广泛。作为食品工业的主要原料之一，其品质及抗氧化稳定性直接影响到食品质量的好坏。随着人民生活的不断改善，对食品质量的要求也日益提高。因此，深入了解和认识油脂的氧化作用过程，研究和开发延缓油脂氧化作用的方法就显得十分重要。

近年来，抗氧化肽因其来源广且安全性高成为备受瞩目的天然抗氧化剂。自从Pokorn提出“一些肽和蛋白水解物能降低自动氧化速率及脂肪过氧化物含量”后，抗氧化肽的研究引起了食品领域的广泛关注。与具毒副作用而被限量限制添加的合成抗氧化剂(BHA、BHT等)相比，抗氧化肽具有稳定性高、活性强、高营养、易吸收、安全低毒等诸多优势。

目前抗氧化肽在食品系统的应用主要集中于肉质品，通过抑制或延缓脂质过氧化从而达到抗氧化保鲜的目的。目前研究的抗氧化肽由于其低油溶性使得其无法应用于油脂体系，无法解决植物油氧化带来的安全隐患与经济损失。

国内外关于抗氧化肽在油脂中的应用研究较少，抗氧化肽对植物油影响的研究尚停留在抗氧化的初级阶段，通过研究分子供氢能力与金属离子螯合作用表明其抗油脂氧化能力，如何提取能够用于油脂中的抗氧化肽以及抗氧化肽在植物油体系中的作用机制仍有待进一步研究探讨。

发明内容

【技术问题】

为了解决现有技术中的抗氧化肽无法用于油脂抗氧化的问题。

【技术方案】

为解决上述问题，本发明提供了一种具有抗油脂氧化功能的生物活性肽及其制备方法，以富含疏水性蛋白的豆类为主要原料，制备得到的抗氧化肽能够用于油脂抗氧化，且具有较强的抗氧化功能。

首先，本发明提供了一种具有抗油脂氧化功能的活性肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)准备蛋白质：从提取了油之后的油料作物中提取蛋白质，干燥得到蛋白干粉，备用；

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(3)蛋白酶酶解处理：将步骤(2)得到的预处理后的蛋白干粉配置成溶液，然后利用蛋白酶进行酶解处理；

(4)冷冻干燥：将酶解上清液冷冻干燥得到多肽粉；

(5)提取亲脂性多肽：将冻干后的多肽粉溶于有机溶剂中，温度30～60℃下在10～100Hz的超声波中处理20～120min，随后在0～5℃下离心，收集上清液；

(6)真空浓缩并干燥：将步骤(5)得到的上清液真空浓缩并除去残留有机溶剂，即可得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

在本发明的一种实施方式中，所述油料作物已经过提油处理。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述油料作物优选富含疏水性氨基酸的作物。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述油料作物为黄豆、黑豆或绿豆中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述提取出蛋白质的方法为碱溶酸沉法，具体的为：将提油后的油料作物重悬于pH为7～10的稀碱溶液中0.5～5h，离心取上清液后再用酸将pH调至3～6，经分离后将沉淀重悬于水中并中和至pH为6～8，干燥得到蛋白干粉，备用。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述用酸调pH优选调节至蛋白质的等电点附近。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述稀碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠等中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述酸为盐酸、醋酸、柠檬酸或乳酸等。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述离心为8000～12000rpm下离心8～15min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述干燥优选为冷冻干燥，温度为-100～-50℃，真空度为1～15Pa，干燥时间为1～5d；具体的冷冻干燥的操作为：将调回中性的蛋白溶液于-100～-50℃冷冻成固态，进行真空冷冻干燥，真空1～15Pa，温度-100～-50℃，干燥1～5d。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述预处理的条件优选温度为90～120℃，时间15～25min；与传统热处理利用热传导与热对流加热样品不同，红外热处理过程中，电磁波碰撞物料表面后，物料吸收能量而使内部分子发生机械振动，由内向外产热，从而达到加热的目的，热量分布均匀。通过红外预处理，使得球状蛋白变性，肽链展开有利于增大其与蛋白酶的接触面积，其次，红外预处理使得蛋白质的功能特性得到明显改善，且有利于生物活性物质的释放。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述蛋白干粉配置成溶液，其质量体积比浓度为5～20％(w/v，g/mL)，优选为5～13％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述酶解处理在蛋白酶的最适酶解条件下，保温震荡反应0.5～15h，灭酶，冷却，调节浆液pH至6～8，分离得到的酶解上清液。

在本发明的一种实施方式中，所述灭酶为热水浴、红外等灭酶方法，优选70～100℃水浴灭酶。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述分离为5000～10000rpm条件下离心5～20min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述蛋白酶为能够特异性切割疏水性氨基酸的蛋白酶，优选为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶中的任一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述蛋白酶的浓度为1.5～2.5wt％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，针对不同的蛋白酶，其最适酶解条件为：碱性蛋白酶的最佳酶解条件为温度40～60℃，pH 8.0～11.0，反应时间1～7h；菠萝蛋白酶的最佳酶解条件是温度40～60℃，pH6.0～8.0，反应时间2～8h；无花果蛋白酶的最佳酶解条件为温度40～60℃，pH 4.0～7.0，反应时间2～8h；胰蛋白酶的最佳酶解条件为温度25～45℃，pH 7.0～9.0，反应时间0～5h；胰凝乳蛋白酶的最佳酶解条件为温度20～50℃，pH7.0～10.0，反应时间0～5h；弹性蛋白酶的最佳酶解条件为温度15～50℃，pH 6.0～9.0，反应时间0～5h；木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为温度40～60℃，pH 6.0～8.0，反应时间1～8h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述酶解上清液于0～9℃暂存；此外，酶解上清液若不能及时使用，则需进行冷冻保存，冷冻温度为-50～0℃，冷冻原料液在使用时，需进行低温解冻，尽量减少冷冻解冻过程对蛋白的破坏。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述冷却优选为快速冷却。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述冷冻干燥的具体操作为：将酶解上清液置于-100～0℃冷冻成固态，进行真空冷冻干燥，真空度为1～15Pa，温度为-100～-50℃，干燥1～5d，得到的多肽粉。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述有机溶剂为正己烷、石油醚、甲醇、乙醇、正丁醇或二氯甲烷中的任一种或两种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述离心为5000～10000rpm下离心5～20min。

在本发明的一种实施方式中，所述真空浓缩为20～50℃下真空离心浓缩，将浓缩的多肽溶液在20～50℃干燥，除去残留有机溶剂。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：

(2)红外预处理：将步骤(1)得到的蛋白干粉进行红外预处理，预处理的温度为50～150℃，时间为5～45min；

(3)蛋白酶解：将步骤(2)得到的预处理后的蛋白干粉配置为浓度为5～20％的溶液，调节溶液至最适pH范围，预热至蛋白酶的最适温度范围并保温5～30min，加入蛋白酶，在最适酶解条件下保温震荡反应0.5～15h，灭酶，冷却，调节浆液pH至6～8，5000～10000rpm条件下离心5～20min，得到的酶解上清液；

(4)冷冻干燥：将酶解上清液冷冻干燥得到多肽粉；

(5)提取亲脂多肽：利用超声辅助溶剂法分离亲脂组分，即将冻干后的多肽粉溶于有机溶剂中，温度30～60℃下在10～100Hz的超声波中处理20～120min，随后在5000～10000rpm、0～5℃下离心5～20min，收集上清液；

(6)真空浓缩并干燥：将上述溶液在20～50℃下真空离心浓缩，将浓缩的多肽溶液在20～50℃干燥，除去残留有机溶剂，即可得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

本发明还提供了上述方法制备得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽。

最后，本发明还提供了上述具有抗油脂氧化功能的活性肽在油脂抗氧化中的应用，以及包含上述具有抗油脂氧化功能的活性肽的油脂。

本发明取得的有益技术效果：

(1)本发明所得的天然抗氧化剂(抗氧化肽)具有清除DPPH自由基、金属离子螯合、抑制脂质过氧化、延长植物油氧化诱导时间、增强水包油乳液稳定性等功能特性，能代替具有安全隐患的合成抗氧化剂而被广泛应用于食品工业，本发明得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽还具有稳定性高、安全性高、活性强的优点，对保障食品安全具有重要意义。

(2)本发明制备的肽产品可很好地溶于油脂体系，可以作为天然抗氧化剂应用在油脂及其他含油脂食品的贮藏和保鲜中。少量添加本发明的抗油脂氧化肽，即可使得植物油等油脂达到延长氧化诱导时间8％～50％的效果，解决油脂氧化致使产品劣变、产生有害产物的问题，延长食品货架期。

(3)我国油料加工过程中副产物多，加工和再利用少，本发明选用油料加工副产物(即提油后的油料作物)作为原料生产高附加值的抗油脂氧化肽产品，对粮油企业技术进步，加强竞争力具有重大意义，有较高的经济效益和社会效益。

(4)本发明反应条件温和，可连续大批量生产，为开发新型抗油脂氧化剂奠定了夯实的基础。本发明提供的抗油脂氧化肽的开发与研制，对于遏制油脂氧化、保障食品安全、促进技术进步具有重大的现实意义和社会意义。

附图说明

图1黑豆多肽对水包油乳液过氧化值的影响。

图2黑豆多肽对TBARS值的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、无花果蛋白酶均购自诺维信公司。

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶均购自Sigma公司。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

1、测定酶解上清液的DH、DPPH自由基清除能力和金属离子螯合能力

(1)DH的测定方法为邻苯二甲醛法(o-Phthalaldehyde,OPA)，所述方法如下：

①OPA试剂(现配现用)：首先完全溶解7.620g十水合四硼酸钠和200mg十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)至150mL去离子水中，之后将160mgOPA(≥97％)溶于4mL无水乙醇中，然后将OPA溶液转移到上述溶液中，再将176mg的二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)加入溶液中，最后用去离子水定容到200mL；

②丝氨酸标准溶液的制备：50mg丝氨酸溶于500mL的去离子水(0.9516meqv/L)；

③样品溶液的制备：用去离子水将酶解上清液稀释5～50倍(使测得的吸光度在0.2～0.8之间)，混合均匀；

④标准测定：400μL丝氨酸标准液加入含有3mL OPA试剂的具塞试管中，摇匀，室温下精确反应2min，然后用紫外分光光度计在340nm下测其吸光度；

⑤空白测定：向含有3mL OPA试剂的具塞试管中加入400μL去离子水，摇匀，室温下精确反应2min，然后在340nm下测其吸光度；

⑥样品检测：400μL的待测样品中加入3mL OPA试剂混合均匀，在室温下放置2min，然后在340nm下测其吸光度。

⑦计算：

式中，丝氨酸-NH2：每克蛋白质含有的丝氨酸-NH2的毫克当量；

X：稀释倍数；P：蛋白粉末的蛋白质含量(％)；

豆类的α、β分别为常数0.970和0.342，htot为常数7.8；典型的OD标准值为0.8；OD空白值为0.07。

(2)DPPH自由基清除能力测定，所述方法如下：

用95％乙醇溶液配置0.1mMDPPH，在96孔板中每孔加入50μL酶解液和50μLDPPH，震摇10s后在室温下反应30min，于517nm波长下测定得到的吸光值为Asample；以50μL酶解液和50μL95％乙醇作为对照组，同条件测定其吸光值为Asample blank；以50μLDPPH和50μL去离子水作为空白组，同条件下测定其吸光值为Acontrol，每个样品作3个平行，震摇30s后在室温下反应30min，于517nm波长下测定样品的吸光度。利用等比倍比稀释法梯度稀释酶解液测定DPPH清除率，计算IC50。

(3)金属离子螯合能力测定，所述方法如下：

取50μL酶解液于96孔板，依次加入100μL 20μM氯化亚铁溶液，100μL0.5 mM菲洛嗪溶液混匀，室温静置10min后，于562nm处测定吸光值Asample；以50μL去离子水代替酶解液作为参比，同条件下测得吸光值Asample blank；以50μL酶解液与200μL去离子水作为空白，同条件下测得吸光值Acontrol，每个样品作3个平行。利用等比倍比稀释法梯度稀释酶解液并测其金属离子螯合能力，计算IC50。

2、对步骤(4)中得到多肽粉测定其对亚油酸过氧化抑制能力和对氧化诱导时间的影响，对步骤(6)中得到的脂溶性多肽粉末测定其对氧化诱导时间的影响

亚油酸过氧化分析，所述方法如下：

①样品溶液的制备：1.5mg多肽粗溶1mL去离子水，加入2mL 50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)，加入1mL 2.5％亚油酸，再加入1mL去离子水，在混匀器上混合均匀，加盖密封，放在60℃恒温培养箱中避光保温，每24h测定吸光度。

②空白试剂的制备：用1mL去离子水代替酶解液

③阳性对照：用0.1mg/mLα-生育酚溶液代替酶解液

④吸光度的测定：取反应液5μL，依次加入235μL75％的乙醇溶液，5μL 30％硫氰酸铵溶液和5μL硫酸亚铁溶液(含3.5％HCl)，混合均匀3min后在500nm处测定吸光度(Asample)，每天测定一次吸光度，以不添加酶解物的为空白对照(Asample blank)。

氧化诱导时间的测定，所述方法如下：

Rancimat油脂氧化稳定仪测定氧化诱导时间，以葵花籽油为实验对象。参数设定：100～150℃，气流速度0.5～1.5L/h，肽添加量为0.05～2％。

3、测定多肽粉在水包油乳液体系中的抗油脂氧化能力

测定脂质氧化的初级氧化产物(过氧化值，PV)和次级氧化产物含量(TBARS法)。

过氧化值(PV)测定，所述方法如下：

①乳液的制备：30％(v/v，mL/mL)菜籽油、1％(mL/mL)吐温80与69％(mL/mL)超纯水制备乳液，磁力搅拌30min，剪切2min，均质。

②PV值的测定：通过添加氯仿(1:2，w/v，g/mL，下同)和硫酸钠使乳液失稳。剧烈振荡2分钟后，将去稳定化的乳液离心(3000g/5min，4℃)，向脂质组分中加入乙酸(3:2，v/vmL/mL，下同)和0.5mL碘化钾饱和溶液后，重复以下步骤三次：剧烈摇晃20s，在黑暗中静置10s。以淀粉(1％w/v溶液)为指示剂，用硫代硫酸钠滴定法测定PV。

PV(meq/kg)＝M×V×1000/m

其中，PV：过氧化值(meq/kg)；M：硫代硫酸钠溶液的摩尔浓度(mol/L)；V：硫代硫酸钠溶液的体积(mL)；m：样品质量(g)

TBARS法测定，所述方法如下：

取1.5mL乳液，加入1mL1％硫代巴比妥酸溶液、2.5mL10％三氯醋酸溶液(TCA)，混匀后沸水浴中反应30min，取出于冰水浴中冷却5min，移取2.5mL样液加入等体积三氯甲烷，4500rpm下离心10min，取上清于532nm下测定吸光度。

实施例1制备黑豆抗油脂氧化肽AOP1

黑豆富含疏水性氨基酸，其疏水性氨基酸比例高达45％，而含疏水性氨基酸的肽段更易与脂溶性物质反应，而且疏水性氨基酸增大了肽在油脂体系的溶解度，故选择黑豆作为原料。

(1)蛋白提取：提油后的黑豆粉以1:8(w/v，g/mL，下同)重悬于去离子水，搅拌60min，用0.015M的NaOH将pH调至8.0左右，搅拌2h，8000rpm离心15min，取上清后再用2MHCl调节至pH 4.5左右，8000rpm离心15min左右的蛋白沉淀，重悬于去离子水后用用0.015MNaOH将pH调回中性，最后冷冻干燥即可得到黑豆蛋白；

(2)红外预处理：将冻干得到的黑豆蛋白粉进行红外加热处理，处理温度100℃，时间20min；

(3)蛋白酶解：取步骤(2)得到的蛋白粉，按照1:10(w/v)的比例加入去离子水，震荡混合，调节溶液pH 7.0左右，预热至55℃并保温10min，加入所选菠萝蛋白酶(浓度为2％，w/v，g/mL，下同)，调节溶液pH 7.0，在55℃保温震荡反应4h，95℃水浴钝化灭酶15min，迅速冷却，调节浆液pH 7.0左右，8000rpm条件下离心15min，过滤得到酶解上清液，酶解上清液于4℃暂存；

(4)冷冻干燥：将酶解液置于-80℃冷冻成固态，进行真空冷冻干燥，真空1Pa，温度-70℃，干燥3d，得到的多肽粉干燥保存；

(5)提取亲脂多肽：利用超声辅助溶剂法分离亲脂组分，将冻干后的多肽粉末溶于乙醇和正己烷混合溶液，超声波80Hz且温度45℃处理30min，随后8000rpm，4℃条件下离心15min，收集上清液；

(6)真空浓缩并干燥：将上述溶液在45℃下真空离心浓缩至一定体积，将浓缩的多肽溶液在45℃真空干燥，除去残留有机溶剂，即可得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

其中，测定步骤(3)中得到的酶解上清液的DH、DPPH自由基清除能力和金属离子螯合能力，测定的结果为：DH为21.74％，DPPH自由基清除能力的IC50值为21.23μg/mL，金属离子螯合能力的IC50值为14.12μg/mL，由实验结果可知，此多肽捕捉过氧化自由基以及螯合金属离子的能力极强，具有很高的抗氧化能力，是极佳的天然抗氧化剂。

测定步骤(4)中得到的多肽粉(即未对脂溶性多肽粉末进行提取的多肽粉)在纯油体系中的抗油脂氧化能力。测定其对亚油酸过氧化抑制能力和在葵花籽油体系中的氧化诱导时间。添加纯油质量的0.5％的多肽粉，测定结果为：前5d，亚油酸过氧化抑制率在80％～95％(以0.1mg/mLα-生育酚为对照，前5d，其抑制率在80％～95％左右)，在葵花籽油体系中的氧化诱导时间延长了10.40％，延长约26天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，延长约37天)。

测定步骤(6)中得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，仅添加纯油质量的0.5％具有抗油脂氧化功能的活性肽即可延长氧化诱导时间49.25％，约123天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

测定步骤(4)中得到的多肽粉在水包油乳液体系中的抗油脂氧化能力，测定结果见图1和图2，可见，前7d，黑豆肽明显抑制脂质初级氧化产物和次级氧化产物的生成量，本发明指标得到的多肽粉在水包油乳液体系中的有效成分主要为脂溶性多肽，见解证明了本发明的脂溶性多肽也具有良好的抗脂质氧化功能。

实施例2制备绿豆抗油脂氧化肽AOP2

(1)蛋白提取：脱脂的绿豆粉以1:8(w/v)重悬于去离子水，搅拌60min，用0.015M的NaOH将pH调至9.0左右，搅拌2h，8000rpm离心15min，取上清后再用2M HCl调节至pH 4.0左右，8000rpm离心15min左右的蛋白沉淀，重悬于去离子水后用用0.015M NaOH将pH调回中性，最后冷冻干燥即可得到绿豆蛋白；

(2)红外预处理：将冻干得到的绿豆蛋白粉进行红外加热处理，处理温度100℃，时间20min；

(3)蛋白酶解：取步骤(2)得到的蛋白粉，按照1:10(w/v)的比例加入去离子水，震荡混合，调节溶液pH 7.0左右，预热至55℃并保温10min，加入所选菠萝蛋白酶(浓度为2％)，调节溶液pH 7.0，在55℃保温震荡反应5h，95℃水浴钝化灭酶15min，迅速冷却，调节浆液pH 7.0左右，8000rpm条件下离心15min，过滤得到酶解上清液，酶解上清液于4℃暂存；

(4)冷冻干燥：将酶解液置于-80℃冷冻成固态，进行真空冷冻干燥，真空1Pa，温度-70℃，干燥3d，得到的多肽粉干燥保存；

其中，对步骤(3)中得到的酶解上清液测定DH、DPPH自由基清除能力和金属离子螯合能力，测定的结果为：DH为19.22％，DPPH自由基清除能力的IC50值为8.67μg/mL，金属离子螯合能力的IC50值为15.33μg/mL。由实验结果可知，此多肽捕捉过氧化自由基以及螯合金属离子的能力极强，具有很高的抗氧化能力，是极佳的天然抗氧化剂。

测定步骤(4)中得到的多肽粉末在纯油体系中的抗油脂氧化能力。测定亚油酸过氧化抑制能力、葵花籽油体系中的氧化诱导时间。测定结果为：前5d，亚油酸过氧化抑制率均维持在90％左右(以0.1mg/mLα-生育酚为对照，其抑制率在80％～95％左右)，氧化诱导时间延长10.37％，约26天。

测定步骤(6)中得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，仅添加纯油质量的0.5％的具有抗油脂氧化功能的活性肽即可延长43.30％的氧化诱导时间，约108天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

实施例3

选择绿豆作为原料

(1)蛋白提取：提油后的绿豆以1:8(w/v，g/mL，下同)重悬于去离子水，搅拌60min，用0.015M的NaOH将pH调至9.0左右，搅拌2h，8000rpm离心15min，取上清后再用2MHCl调节至pH 4左右，8000rpm离心15min左右的蛋白沉淀，重悬于去离子水后用用0.015M NaOH将pH调回中性，最后冷冻干燥即可得到绿豆蛋白。

(2)红外预处理：将冻干得到的绿豆蛋白粉进行红外加热处理，处理温度100℃，时间20min；

(3)蛋白酶解：取步骤(2)得到的蛋白粉，按照1:10(w/v)的比例加入去离子水，震荡混合，调节溶液pH 5.7左右，预热至65℃并保温10min，加入所选无花果蛋白酶(浓度为2％)，调节溶液pH 5.7，在65℃保温震荡反应2h，95℃水浴钝化灭酶15min，迅速冷却，调节浆液pH 7.0左右，8000rpm条件下离心15min，过滤得到酶解上清液，酶解上清液于4℃暂存；

(4)冷冻干燥：将酶解液置于-80℃冷冻成固态，进行真空冷冻干燥，真空1Pa，温度-70℃，干燥3d，得到的多肽粉干燥保存；

其中，测定步骤(3)中得到的酶解上清液测定DH、DPPH自由基清除能力和金属离子螯合能力，测定的结果为：水解度(DH)为6.47％，DPPH自由基清除能力的IC50值为9.45μg/mL，金属离子螯合能力的IC50值为7.63μg/mL。由实验结果可知，此多肽捕捉过氧化自由基以及螯合金属离子的能力极强，具有很高的抗氧化能力，是极佳的天然抗氧化剂。

测定步骤(4)中得到的多肽粉(即未对脂溶性多肽粉末进行提取)在纯油体系中的抗油脂氧化能力，并测定亚油酸过氧化抑制能力、葵花籽油体系中的氧化诱导时间。添加纯油质量的0.5％的多肽粉，测定结果为：前5d，亚油酸过氧化抑制率在90％左右(以0.1mg/mLα-生育酚为对照，其抑制率80％～95％左右)，氧化诱导时间延长12.10％，约30天。

对步骤(6)中得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽，测定其在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，仅添加纯油质量的0.5％的具有抗油脂氧化功能的活性肽即可延长氧化诱导时间45.50％，约113天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

对比例1

当删除步骤(2)，即不进行红外预处理时，其余步骤和条件和实施例1相同，制备得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

对其性能进行测定，酶解上清液水解度(DH)为14.37％，DPPH自由基清除能力的IC50值为108.05μg/mL，金属离子螯合能力的IC50值为235.80μg/mL；

测定对比例1得到的多肽粉对亚油酸过氧化的抑制能力、在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响(添加纯油质量的0.5％的多肽粉)，测定结果为：前5d，亚油酸过氧化抑制率均维持在60％左右(以0.1mg/mLα-生育酚为对照，其抑制率在80％～95％左右)，氧化诱导时间延长2.95％，约7天；

测定对比例1得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，添加纯油质量的0.5％的具有抗油脂氧化功能的活性肽可延长氧化诱导时间10.23％，约25天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

对比例2

步骤(2)中预处理为微波(600W，2min)时，其余步骤和条件与实施例1相同，制备得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

对其性能进行测定，酶解上清液水解度(DH)为16.21％，DPPH自由基清除能力的IC50值为83.41μg/mL，金属离子螯合能力的IC50值为135.48μg/mL；

测定对比例2步骤(4)中得到的多肽粉末对亚油酸过氧化的抑制能力、在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响(添加纯油质量的0.5％的多肽粉)，测定结果为：前5d，亚油酸过氧化抑制率均维持在80％左右(以0.1mg/mLα-生育酚为对照，其抑制率在80％～95％左右)，氧化诱导时间延长4.65％，约11天；

测定对比例2步骤(6)中得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，添加纯油质量的0.5％的具有抗油脂氧化功能的活性肽可延长氧化诱导时间28.46％，约71天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

对比例3

步骤(2)红外预处理改为烘箱加热，处理温度100℃，时间20min，其余步骤和条件和实施例1相同，制备得到具有抗油脂氧化功能的活性肽。

对其性能进行测定，酶解上清液水解度(DH)为14.05％，DPPH自由基清除能力的IC50值为85.44μg/mL，金属离子螯合能力的IC50值为205.41μg/mL；

测定对比例3步骤(4)中得到的多肽粉末对亚油酸过氧化的抑制能力、在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响(添加纯油质量的0.5％的多肽粉)，测定结果为：前5d，亚油酸过氧化抑制率在60％～75％(以0.1mg/mLα-生育酚为对照，其抑制率80％～95％左右)，氧化诱导时间延长3.43％，约9天；

测定对比例3步骤(6)中得到的具有抗油脂氧化功能的活性肽在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，添加纯油质量的0.5％的具有抗油脂氧化功能的活性肽可延长氧化诱导时间15.67％，约39天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

对比例4

步骤(5)中的提取亲脂方法改变，将冻干后的多肽粉末溶于80％乙醇溶液，加热溶解，温度45℃处理30min，随后8000rpm，4℃条件下离心15min，收集上清液；真空浓缩干燥后制得脂溶性多肽粉末。

测定对比例4步骤(6)中得到的的具有抗油脂氧化功能的活性肽在葵花籽油体系中对氧化诱导时间的影响，发现该粉末在葵花籽油体系中无法稳定分散且抗油脂氧化能力较低。添加纯油质量的0.5％的具有抗油脂氧化功能的活性肽即可延长氧化诱导时间18.55％约46天(以0.5％α-生育酚为对照，其延长氧化诱导时间14.92％，约37天)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一种具有抗油脂氧化功能的活性肽及其制备方法和应用专利购买费用说明