专利摘要

本发明公开了一种壬烯内酯类化合物及其制备和应用，化学名为(6S，7S，9R)-6，7-二羟基-9-丙基-4-壬烯-9-内酯，从拟茎点霉属菌株(Phomosissp.)CGMCCNo.4054的次级代谢产物中分离获得，对苜蓿和杂三叶种子的萌发和根茎的生长有较强的抑制作用，可以作为苗前除草剂的一个前体化合物，在农业领域具有潜在应用价值。 CGMCCNo.4054 2010.07.20

权利要求

1.一种壬烯内酯化合物，其特征在于，具有如下结构：

2.如权利要求1所述的壬烯内酯化合物的制备方法，其特征在于，包括：

(a)、采用大米培养基固体发酵拟茎点霉属菌株(Phomosissp.)CGMCC No.4054；

(b)、采用有机溶剂提取发酵产物，减压蒸馏得到提取物；

(c)、将所述提取物采用减压硅胶柱层析分离后减压蒸馏；

(d)、将减压蒸馏得到的产物采用Sephadex LH20柱分离；

(e)、将所述Sephadex LH20柱分离得到的馏分浓缩后，采用半制备液相色谱制得所述壬烯内酯化合物；

所述发酵的温度为27-30℃，时间为28-35天；所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述减压硅胶柱层析分离采用石油醚/乙酸乙酯混合物进行洗脱，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为75∶25；所述Sephadex LH20柱分离采用二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比为1∶1；所述步骤e的制备条件为：采用ODS半制备柱，所述半制备柱粒径为5μm，柱尺寸为9.4mm×250mm；采用25∶75(体积比)的甲醇：水等度洗脱20min后，采用25-100％甲醇梯度洗脱20min；所述壬烯内酯化合物的保留时间为36.479min。

3.如权利要求1所述的壬烯内酯化合物的应用，其特征在于，用作微生物来源的除草剂。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有植物生长抑制活性的壬烯内酯类化合物及其制备和应用。 

背景技术

全世界约有1800种杂草能够对农林生产造成不同程度的危害，全球每年因杂草造成的农作物减产高达9.70％，损失超过400亿美元。随着化学除草剂的长年施用，抗药性杂草生物型大量出现。发展微生物除草剂或微生物来源的除草剂，减少化学除草剂的用量有利于农业可持续发展。 

近年来的研究发现，很多植物病原真菌分泌的毒素具有杀草活性。利用微生物代谢产物，特别是植物病原真菌毒素开发微生物来源除草剂，具有多靶标作用位点和方式，不容易引起杂草抗性的产生，具有靶标针对性强、开发成功率高，对人、畜、天敌等非靶标生物安全等特性，已成为微生物源除草剂研究的热点之一，并显示出良好的开发应用前景。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种微生物来源的除草剂，具体为一种壬烯内酯类化合物。 

本发明的第二个目的在于提供该化合物的制备方法。 

本发明的第三个目的在于提供该化合物的应用。 

本发明提供的壬烯内酯化合物，化学名为(6S，7S，9R)-6，7-二羟基-9-丙基-4-壬烯-9-内酯，通用名为herbarumin IV，具有如下结构： 

本发明提供的该壬烯内酯化合物的制备方法，包括： 

(a)、采用大米培养基固体发酵拟茎点霉属菌株(Phomosis sp.)CGMCCNo.4054； 

(b)、采用有机溶剂提取发酵产物，减压蒸馏得到提取物； 

(c)、将所述提取物采用减压硅胶柱层析分离后减压蒸馏； 

(d)、将减压蒸馏得到的产物采用Sephadex LH20柱分离； 

(e)、半制备液相色谱制得所述壬烯内酯化合物。 

根据本发明，所述发酵的温度为27-30℃，时间为28-35天。所述有机溶剂为乙酸乙酯。所述减压硅胶柱层析分离采用石油醚/乙酸乙酯混合物进行洗脱，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为75∶25。所述Sephadex LH20柱分离采用二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比为1∶1。所述步骤e的制备条件为：采用Agilent 1100色谱系统，半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm，9.4mm*250mm，条件为25％甲醇(75％水)等度洗脱20min，采用25-100％甲醇(75％-0％水)梯度洗脱20min，该化合物的保留时间t_R为36.479min。本发明提供的该壬烯内酯化合物，用作微生物来源的除草剂。 

本发明为研究开发新型除草剂提供了一个新的先导化合物，在农业领域具有潜在应用价值。 

附图说明

图1为高分辨质谱谱图。 

图2为氢谱谱图。 

图3为碳谱谱图。 

图4为HSQC谱谱图。 

图5为H-H COSY谱谱图。 

图6为HMBC谱谱图。 

图7为NOESY谱谱图。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。 

本发明所用的菌种是从安徽丫山牛膝植物的茎中分离得到的一株植物内生菌，属拟茎点霉属(Phomosis sp.)，内部编号CPCC480809，已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4054。 

以下实施例中所述斜面培养基、所述种子培养基、所述大米培养基的配方(重量百分比)如下： 

斜面培养基：土豆(20％)、生物素(0.01％)、葡萄糖(2％)、蛋白胨(0.2％)、琼脂(0.2％)，其余为水。 

种子培养基：葡萄糖(1.0％)、黄豆粉(2.0％)、玉米粉(1.0％)、KH₂PO₄(0.1％)，其余为水。 

大米固体发酵培养基：大米800g、纯水1000ml。 

实施例1壬烯内酯类化合物的制备及鉴定 

将菌株CGMCC No.4054从冻干管中接种到斜面培养基上进行活化培养，于28℃恒温培养箱内培养5天后，将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基的四个250ml三角瓶中进行种子培养，其中，每个三角瓶内装有50ml种子培养基，于28℃、转速为220rmp摇床上恒温培养2天后，将四个三角瓶内的种子培养液混匀后接种到经115℃高压灭菌20min的含有800g大米、1000ml纯水的容器内，于28℃培养30天，进行发酵。 

发酵结束后，将容器内的大米和菌体机械粉碎，用乙酸乙酯浸泡提取3次， 在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将提取物用300目硅胶拌样后，装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中，其中样品高2cm，分离硅胶高5cm；用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为80∶20)洗涤，然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为75∶25)洗脱，得样品馏分。 

将样品馏分减压蒸干后，用2ml二氯甲烷∶甲醇＝1∶1溶解，上样于用二氯甲烷∶甲醇＝1∶1平衡好的凝胶sephadex LH20柱(2.0*60cm)中，用二氯甲烷∶甲醇＝1∶1洗脱，分布收集，每3ml收一管，其中18～25管为所要的馏分。 

将馏分浓缩干后，用半制备液相色谱分离得到白色油状物，条件为：采用Agilent 1100色谱系统，半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm，9.4mm*250mm，条件为0～20min用25％甲醇(75％水)等度洗脱，20～40min用25-100％甲醇(75％-0％水)梯度洗脱。该化合物的保留时间t_R为36.479min。 

经正离子电喷雾质谱检测，图谱如图1所示，显示其准分子离子峰为：m/z251.1261(M+Na)⁺，分子式为C₁₂H₂₀O₄。采用BrukerAvance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图2)、碳谱(图3)及相关二维谱(HMQC谱(图4)、H-H COSY谱(图5)、HMBC谱(图6)、Noesy谱(图7))，其核磁数据见表1。 

通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了该化合物的结构如下： 

可见该化合物为一种壬烯内酯类化合物，化学名为(6S，7S，9R)-6，7-二羟基-9-丙基-4-壬烯-9-内酯，通用名为herbarumin IV。 

表1核磁数据表(400MHZ，d-Actone) 

实施例2、化合物herbarumin IV抑制活性测定 

2.1、种子萌发抑制作用测定 

选取饱满、经过低温层积处理的苜蓿和杂三叶种子，先用0.1％升汞进行表面消毒3min，然后用无菌水冲洗干净。将herbarumin IV溶于丙酮中作为样品，在每个底部垫有滤纸的培养皿内加入10mL不同浓度的样品，放置30min使丙酮挥发。然后消毒过的苜蓿、杂三叶种子分别被摆放到不同的培养皿内的滤纸上，各摆放5个培养皿，每皿摆放50粒，然后置于(28±1)℃培养箱中。对照组采用无菌蒸馏水。6d后统计种子的萌发数，计算萌芽抑制率。 

2.2、胚根和芽伸长抑制作用测定 

将herbarumin IV溶于丙酮中作为样品，将10mL不同浓度的样品加入垫有 滤纸的培养皿内，丙酮挥发后，将胚根长约1mm的苜蓿、杂三叶种子分别摆放到不同的培养皿内的滤纸上，各摆放5个培养皿，每皿30粒，以无菌蒸馏水为对照，置于(28±1)℃光照培养箱中。3d后测量苜蓿和杂三叶种子的胚根长和芽长，计算萌芽抑制率。 

表2HerbaruminIV对苜蓿种子萌发及胚根和芽伸长的抑制作用 

表3HerbaruminIV对杂三叶种子萌发及胚根和芽伸长的抑制作用 

由表2和表3所示的结果可知，herbarumin IV对苜蓿和杂三叶有较强的苗前抑制活性，可作为苗前除草剂的一个前体化合物。 

一种壬烯内酯类化合物及其制备和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。