专利摘要

本发明涉及一种添加醇类促进二萜类化合物LibertellenoneH产量的方法，首次提出在发酵过程中通过加入合适量的醇类，可以极大地促进LibertellenoneH的产量。本发明的方法克服了LibertellenoneH发酵产量低的缺陷。

权利要求

1.一种提高Libertellenones H的产量的方法，其特征在于，所述方法包括：培养北极丝状真菌Eutypella sp.，从而生产Libertellenones H；并且，在北极丝状真菌Eutypella sp.的培养基中添加醇类，所述的醇类选自甲醇或乙醇。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，添加所述的醇类的初始时间是发酵起始起算的第48～96小时；较佳地，添加所述的醇类的初始时间是发酵起始起算的第60～84小时。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，添加醇类后，醇类在培养基中的最终浓度为1～10％(v/v)；更佳地为2～6％(v/v)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积0.25～2.5％(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔18～30小时添加1次，共添加2～4次，使醇类最终浓度为1～10％(v/v)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积0.5～1.5％(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔20～28小时添加1次，共添加2～4次，使醇类的最终浓度为2～6％(v/v)，更佳地为3～5％(v/v)。

6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的培养基包含：

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基的pH调至5.8±0.2；较佳地为5.8±0.1。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的北极丝状真菌Eutypella sp.是北极丝状真菌Eutypella sp.D-1。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养北极丝状真菌Eutypella sp.的温度是28±2℃。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：从发酵液中分离纯化出Libertellenone H。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域；更具体地，本发明涉及一种提高二萜类化合物Libertellenone H产量的方法，通过在发酵培养基中添加醇类来大大提高二萜类化合物Libertellenone H的产量。

背景技术

北极弯孢聚壳菌(Eutypella sp.)属于丝状真菌，其是分离自北极高纬度(78°55’N)仙女木根基土壤的一种丝状真菌，该属真菌在全球分布较为广泛，且能够产生许多结构新颖、功能独特的次级代谢物，比如桉烷型倍半萜、海松烷型二萜、三萜、细胞松弛素类、聚酮类和环二肽类化合物。从该菌发酵产物中分离鉴定的两种新型异海松烷型二萜类化合物Libertellenone G和Libertellenone H对人肺癌细胞株H460、人胶质瘤细胞株U251、人胃癌细胞株SG7901、人胰腺癌细胞株SW1990、人子宫颈癌细胞株Hela和人肝癌细胞株Huh-7这7种肿瘤细胞株均有一定抑制活性。其中Libertellenone H对Mcf-7乳腺癌的抑制作用最强，IC₅₀达到了3.31μmol/L，和阳性对照紫杉醇的IC₅₀相当，具有潜在的开发应用前景。

然而，Libertellenone H在Eutypella sp.的原始产量极低，甚至低于HPLC检出限，严重限制了对其进行进一步的体内外活性评价及药代药动力学等药理学研究。

因此，本领域迫切需要找到提高Libertellenone H发酵产量的方法，从而为抗肿瘤研究提供新的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过添加醇类促进二萜类化合物Libertellenone H产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种提高Libertellenones H的产量的方法，所述方法包括：培养北极丝状真菌Eutypella sp.，从而生产Libertellenones H；并且，在北极丝状真菌Eutypella sp.的培养基中添加醇类，所述的醇类选自甲醇或乙醇。

在一个优选例中，所述的醇类为AR级甲醇或乙醇。

在另一优选例中，添加所述的醇类的初始时间是发酵起始起算的第48～96小时；较佳地，添加所述的醇类的初始时间是发酵起始起算的第60～84小时。

在另一优选例中，添加醇类后，醇类在培养基中的最终浓度为1～10％(v/v)；更佳地为2～6％(v/v)，如4％(v/v)，5％(v/v)。

在另一优选例中，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积0.25～2.5％(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔18～30小时添加1次，共添加2～4次，使醇类最终浓度为1～10％(v/v)；更佳地为2～6％(v/v)，如4％(v/v)，5％(v/v)。

在另一优选例中，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积0.5～1.5％(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔20～28小时添加1次，共添加2～4次，使醇类的最终浓度为2～6％(v/v)，更佳地为3～5％(v/v)。

在另一优选例中，所述的醇类的添加方式为：每次添加按照体积1～2％(如1.333％)(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔24小时添加1次，共添加3次，使醇类的最终浓度为4％(v/v)。

在另一优选例中，所述的培养基包含：

在另一优选例中，所述的培养基的pH调至5.8±0.2；较佳地pH调至为5.8±0.1。

在另一优选例中，所述的北极丝状真菌是北极丝状真菌Eutypella sp.D-1。

在另一优选例中，培养北极丝状真菌Eutypella sp.的温度是28±2℃。

在另一优选例中，所述的方法还包括：从发酵液中分离纯化出Libertellenone H。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、发酵培养基中添加甲醇对弯孢聚壳菌D-1菌体生长及Libertellenone H合成的影响。

图2、发酵培养基中添加乙醇对弯孢聚壳菌D-1菌体生长及Libertellenone H合成的影响。

图3、发酵培养基中终浓度4％的乙醇不同添加时间对弯孢聚壳菌D-1菌体生长及Libertellenone H合成的影响。

具体实施方式

本发明人致力于提高北极丝状真菌Eutypella sp.生产二萜类化合物Libertellenone H的产量的研究，通过深入而广泛的研究，意外地发现：在发酵过程中通过加入醇类，特别是甲醇或乙醇，可以极大地促进Libertellenone H的产量。并且，本发明还优化了醇类的添加时间和添加量。在此基础上完成了本发明。

除非另外说明，本发明中所提到的发酵培养基组成中各组分的量(g/L)是相对于培养基的体积而言，添加的甲醇或乙醇的浓度百分比(v/v)及甲醇或乙醇的最终浓度百分比(v/v)均为相对于培养基的体积而言。

除非另外说明，本发明所述的接种量的百分比是相对于培养基的体积百分比。

本发明人首次提出了以醇类提高北极丝状真菌Eutypella sp.生产Libertellenone H的产量的策略。所述的醇类包括：甲醇或乙醇；较佳地，为AR级的甲醇或乙醇。

适用于本发明方法的生产Libertellenone H的菌株没有特别限制，可以是野生型北极丝状真菌Eutypella sp.，也可以是基于该菌株、通过常规方法改造或诱变而获得的工程菌，也可以是转化有外源基因的重组的菌株，也可以是其自然突变体。

利用上述的菌株，可在常规的、适合表达Libertellenone H的条件下培养，从而生产Libertellenone H，并且在培养过程中添加醇类。

本发明人在研究中发现，浓度不当的醇类的添加对于菌株的生长有极大的影响，使得菌体量减少。因此，本发明人还优化了醇类的添加量，以醇类在培养基中的最终浓度计(如多次添加，以添加后的总量计)，添加量为1～10％(v/v)；更佳地为2～6％(v/v)；进一步更佳地为3～5％(v/v)。

本发明人在研究中发现，在不同的发酵时间点添加醇类，菌株生长的状态也将受到影响。因此，本发明人还优化了醇类的添加时间，较佳的添加方式为：每次添加按照体积0.25～2.5％(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔18～30小时添加1次，共添加2～4次，使醇类最终浓度为1～10％(v/v)；更佳的添加方式为：每次添加按照体积0.5～1.5％(v/v)的醇类，从第一次添加起每隔20～28小时添加1次，共添加2～4次，使醇类的最终浓度为2～6％(v/v)，更佳地为3～5％(v/v)。

应理解，在本发明的提示下，本领域人员也可适当地对于添加次数以及每次添加量进行适当的调整，例如调整为进行更多次且每次更少量的添加方式，这种改变是本领域技术人员已于联想到的，且易于操作，也应包含在本发明的保护范围内。

多种已知的可被应用于北极丝状真菌Eutypella sp.的培养基均应被包含在本发明中，并且在其中添加醇类。还可在培养基中添加有益于菌株生长的微量元素。作为本发明的优选方式，所述的培养基包含：

更优选地的，所述培养基包含：

在本发明中，对于发酵生产的Libertellenone H，可以用常规方法进行纯化，随后制成药剂。一种可选的方法是对发酵样品用常规方法酸化后进行离心、过滤等方式去除菌体，获得含Libertellenone H的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行离子层析纯化。应理解，其它各种适用于化合物纯化的方法均可被应用于进行Libertellenone H的纯化。

在本发明的具体实施例中，利用北极丝状真菌Eutypella sp.D-1(菌种保藏编号：CCTCC M2013144)为生产菌株，当发酵至72h时，在发酵培养基中添加甲醇或乙醇来促进Libertellenone H产量的提高。在发酵培养基中添加甲醇最高产量可达到0.473mg/l，比不加甲醇的对照组提高了72.3％；在发酵培养基中添加乙醇最高产量可达到4.36mg/l，比不加乙醇的对照组提高了14.9倍，实现了极其优异的技术效果。

本发明的有益效果具体如下：

本发明提供了一种通过在发酵培养基中添加醇类提高Libertellenone H产量的方法，克服了Libertellenone H发酵产量低的缺陷。

本发明对于北极丝状真菌Eutypella sp.发酵研究及Libertellenone H的代谢调控研究具有重要意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

1、实验菌株及保藏方法

弯孢聚壳菌D-1(Eutypella sp.D-1，菌种保藏编号：CCTCC M2013144)由中国人民解放军第二军医大学提供。

菌株接种于种子培养液中，培养3.5天后获得新鲜种子液，50％甘油与新鲜种子液按2:3比例混合于保种管，置于-80℃冷冻保藏，并取新鲜种子液于安瓿管中经冷冻真空干燥保存。

2、培养基

固体平板及种子液体培养基：

固体平板培养基则是在此基础上添加2％的琼脂粉，于121℃条件下灭菌20min。

发酵培养基：

pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。

3、培养方法

固体平板培养：用接种环挑取保种管中的菌丝垂直插入固体培养基中央，于28℃条件下培养7～8d。

种子培养：种子液均采用500ml普通锥形瓶培养，8层纱布保证无菌透气。用直径1cm的打孔器在固体平板上打孔，用接种铲将琼脂圆块均匀切割成4块，接种于装有100ml种子培养基的锥形瓶中，置于28℃、180r/min摇床中培养3.5d(视种子的具体生长情况而定)，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养2.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养。

摇瓶发酵培养：发酵培养均采用250ml的普通锥形瓶培养，在装液量为50ml的锥形瓶中按照5％(v/v)的接种量接入新鲜种子液，置于20℃、180r/min摇床培养10d。

4、分析方法

4.1菌体干重的测定

Eutypella sp.D-1属于丝状真菌，生物量的测定多用干重法(DCW)。干重具体测定方法如下：

将发酵液摇晃均匀后取10ml置于布氏漏斗中，同时加入250ml去离子水冲洗，用真空抽滤泵抽滤，水分抽滤干后将滤纸置于60℃烘箱中24h烘干，之后置于干燥器中恒重24h并称重，计算菌体干重。

4.2 Libertellenone H的分离萃取

摇瓶发酵结束后，取发酵液10ml，加入等体积乙酸乙酯，并加入30颗玻璃珠(直径为3-5mm)，封口后，于摇床20℃、180r/min条件下萃取36h，将其全部转移到50ml离心管中，4500r/min离心10min后，取上层有机相进行真空旋转蒸发(37℃)，旋干后，在茄形烧瓶中加入1.5ml的甲醇，超声助溶，将洗涤液转移至1.5ml离心管中，于13400g离心10min后取上清，置于4℃保存，并用HPLC进行产物的检测。

4.3 Libertellenone H含量的测定

HPLC检测条件：高效液相色谱仪(Agilent 1200)，液相色谱柱为Kromasil-C18(250mm×4.6mm， )，柱温25℃，检测波长332nm，流速1ml/min，进样量为20μl，流动相为0.1％乙酸(A相)和乙腈(B相)，洗脱梯度为：0～10min，5～60％B相；10～30min，60％B相；30.1～35min，100％B相。Libertellenone H标准品的停留时间为26-27min。对所得液相峰积分并计算峰面积，然后根据标准曲线(y＝24.369x+1.6144，R²＝0.9999)换算得到产物产量，其中y为峰面积，x为进样浓度(mg/L)。

II.实施例

实施例1、发酵培养基中添加甲醇对弯孢聚壳菌D-1菌体生长及Libertellenone H合成的影响

利用发酵培养基，采用前述的培养方法培养弯孢聚壳菌D-1。甲醇的添加的方式为：在发酵起始的第72小时首次添加，每隔24小时加1次，连续加3次后，使甲醇在发酵培养基中的最终浓度分别达1％、2％、4％、6％，以不添加甲醇的发酵培养基作为对照。观察在发酵培养基中添加甲醇对于弯孢聚壳菌D-1菌体的生长及Libertellenone H合成的影响。实验中，每个取样点设三个平行。

结果如图1所示，甲醇对弯孢聚壳菌D-1菌丝体的损伤较小，当添加甲醇浓度为6％时，菌体干重只降低了21.1％。随着甲醇添加浓度的增加，发酵终止pH也不断增加，产量和产率也有一定的增加。当添加6％甲醇时，产量达到最大0.473mg/L，与对照相比提高了72.3％。与添加4％甲醇相比，添加6％甲醇产量略有提高，但产率却达到最大，为0.055mg/g DCW。

实施例2、发酵培养基中添加乙醇对弯孢聚壳菌D-1菌体生长及Libertellenone H合成的影响

结合实施例1的研究结果，本发明人考虑研究甲醇以外其它的醇类对于Libertellenone H合成是否也产生促进作用，以期找到更为理想的促进物，进一步提高Libertellenone H产量。

利用发酵培养基，采用前述的培养方法培养弯孢聚壳菌D-1。乙醇的添加的方式为：在发酵起始的第72小时首次添加，每隔24小时加1次，连续加3次后，使乙醇在发酵培养基中的最终浓度分别达1％、2％、4％、6％，以不添加乙醇的发酵培养基作为对照。观察在发酵培养基中添加乙醇对于菌体生长及Libertellenone H合成的影响。每个取样点设三个平行。

发酵过程中发现，随着乙醇添加浓度的增加，弯孢聚壳菌D-1菌体的生长受到不同程度的抑制，观察菌体形态可以发现菌丝簇比对照组小，且菌丝片段增多。由图2可以看出当添加6％乙醇时，与对照组相比，菌体干重降低了45.6％。当添加4％乙醇时，产量达到最大4.36mg/L，产率为0.545mg/g DCW，与对照组相比，分别提高了14.9倍和20.6倍。而添加乙醇过量时，菌体会受到较大损伤，产量和产率均大幅降低。

因此，本发明人认为，选择终浓度为4％(v/v)乙醇为较为优选的添加浓度，使得Libertellenone H产量和产率均较为理想。

实施例3、发酵培养基中终浓度4％的乙醇不同添加时间对弯孢聚壳菌D-1菌体生长及Libertellenone H合成的影响

根据实施例2的结果，添加乙醇对于Libertellenone H合成的促进效果是较为理想的。为了进一步地优化Libertellenone H合成体系，本发明人考察了发酵培养过程中的一系列条件对于产物合成、菌体生长的影响。经过对一系列发酵条件的研究，发现乙醇的添加时间对于Libertellenone H产物的产量和产量也有影响。

利用发酵培养基，采用前述的培养方法培养弯孢聚壳菌D-1。并且，在发酵起始后第24、72、120或168小时的时候，在发酵培养基中分别添加按照体积比4％终浓度的乙醇，自第1次添加乙醇后，每隔24小时再添加1次，使终浓度为4％，共添加3次；以不添加乙醇的发酵培养基作为对照。观察在发酵的不同时间点添加乙醇对于菌体生长及Libertellenone H合成的影响。每个取样点设三个平行。

乙醇的不同添加时间对弯孢聚壳菌D-1菌体生长和产物合成的影响如图3所示。由于乙醇对菌丝有一定的损伤作用，因此在任何时间点添加乙醇均使菌体干重比对照组低。当从72小时开始等量添加乙醇时，产量和产率达到最大，分别为4.88mg/L和0.618mg/g DCW，与对照相比，分别提高了16.4倍和19.8倍。添加时间过早或过晚均对产物合成不利，分析原因可能是菌体在生长早期较脆弱，添加乙醇会对菌丝的伤害相对较大，从而对发酵后期产物合成不利。在菌体生长中后期，与产物合成相关的基因可能已经大量转录及表达，添加乙醇对代谢的调控可能会相对较弱。

因此，本发明人认为，乙醇的较佳添加方式为：当发酵培养至72h、96h、120h分三次等量添加乙醇，添加终浓度为4％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

添加醇类促进二萜类化合物LibertellenoneH产量的方法专利购买费用说明

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