专利摘要

本发明公开了甲基法尼酯在促进冬虫夏草菌产芽生孢子中的应用。本发明针对冬虫夏草菌液体发酵过程中如何快速获得大量感染用芽生孢子的问题，在冬虫夏草菌培养基中添加甲基法尼酯，诱导冬虫夏草菌产生芽生孢子，在添加甲基法尼酯的培养基中接种冬虫夏草菌母液培养30d后产生的芽生孢子数量是未添加组的2.35～5.56倍，培养45d后的芽生孢子数量是未添加组的44.4～79.2倍。本发明能获得芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾人工培养虫菌结合冬虫夏草，缩短冬虫夏草人工培养的时间，节约人工培养成本。

权利要求

1.甲基法尼酯在促进冬虫夏草菌产芽生孢子中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是在接种冬虫夏草菌的培养基中加入甲基法尼酯，然后进行培养。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的甲基法尼酯其在液体培养基中的浓度为10 mg/L-1 g/L。

4.甲基法尼酯在制备提高冬虫夏草菌芽生孢子数量制剂中的应用。

5.一种提高冬虫夏草菌芽生孢子数量的方法，其特征在于，将冬虫夏草菌接种至添加有甲基法尼酯的液体培养基中培养，获得冬虫夏草菌芽生孢子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的甲基法尼酯，其在液体培养基中的浓度为10 mg/L-1 g/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的冬虫夏草菌为冬虫夏草菌接种菌丝块培养30 d的培养液作为接种母液。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基为每150 mL含有30g去皮土豆的煮熟过滤液、1.5 g蛋白胨、3 g麦芽糖、0.08 g硫酸镁、0.25 g磷酸二氢钾、3mg维生素B1，1.5~150mg甲基法尼酯，余量为水。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培养，其培养条件为：12±2℃，100转/分，黑暗培养。

说明书

技术领域：

本发明属于真菌培养技术领域，具体涉及甲基法尼酯在促进冬虫夏草菌产芽生孢子中的应用。

背景技术：

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis是我国传统的名贵中药材，与人参、鹿茸被誉为中华医学三大宝。冬虫夏草是由冬虫夏草菌(又名中华被毛孢，中国被毛孢)侵染蝙蝠蛾科Hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体。冬虫夏草自然资源非常有限，人工培养冬虫夏草是保护这一珍稀生物资源及其栖息地生态环境和满足国民和市场发展的需要。

我国自20世纪70年代后期就开始冬虫夏草菌人工培养技术，通过对冬虫夏草菌无性型菌丝体的发酵培养已开发生产出多种替代产品，如冬虫夏草菌发酵菌丝体制成的“百令胶囊”已作为国家重要一类新药。另外，通过模拟青藏高原生态环境，在低海拔环境，通过冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫人工培养冬虫夏草近年也获得成功。研究发现，冬虫夏草菌在蝙蝠蛾幼虫血腔以芽生孢子形态存在。相比体表感染，通过注射芽生孢子至蝙蝠蛾幼虫血腔，由于减少了附着蝙蝠蛾幼虫体表和穿透体壁的环节，缩短了人工培养冬虫夏草的周期，而且，注射高浓度芽生孢子可以缩短芽生孢子在蝙蝠蛾血腔内的增殖时间。因此，如何快速获得大量用于感染用的芽生孢子是冬虫夏草人工培养过程中亟待解决的问题，解决该问题有利于节约冬虫夏草人工培养成本。

甲基法尼酯(CAS:10485-70-8)，其结构式如下：

发明内容：

基于上述问题，本发明的目的是提供一种甲基法尼酯在促进冬虫夏草菌产芽生孢子中的应用。在冬虫夏草菌培养基中加入甲基法尼酯能提高培养液中冬虫夏草菌芽生孢子数量，为冬虫夏草人工培养产业提供重要的技术支撑。

本发明通过实验发现，在冬虫夏草菌培养基中加入甲基法尼酯可以提高冬虫夏草菌芽生孢子的数量。

因此，本发明的第一个目的是提供甲基法尼酯在促进冬虫夏草菌产芽生孢子中的应用。

所述的应用是在接种冬虫夏草菌的培养基中加入甲基法尼酯，然后进行培养。

所述的甲基法尼酯，其在液体培养基中的浓度为10mg/L-1g/L。

本发明的第二个目的是提供甲基法尼酯在制备提高冬虫夏草菌芽生孢子数量制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种提高冬虫夏草菌芽生孢子数量的培养方法，将冬虫夏草菌接种至添加有甲基法尼酯的培养基中培养，获得冬虫夏草菌芽生孢子。

所述的培养基优选为液体培养基。

所述的甲基法尼酯，其在液体培养基中的浓度为10mg/L-1g/L。

所述的冬虫夏草菌优选为冬虫夏草菌接种菌丝块培养30d后的培养液作为接种母液。

所述的液体培养基优选为每150mL含有30g土豆、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1，余量为水。

所述的培养，其培养条件优选为：12±2℃，100转/分，黑暗培养。

本发明针对人工培养虫菌结合冬虫夏草过程中如何快速得到大量感染用芽生孢子的问题，在冬虫夏草菌培养基中添加甲基法尼酯，诱导冬虫夏草菌产生芽生孢子，在添加甲基法尼酯的培养基中接入冬虫夏草菌接种母液培养30d后产生的芽生孢子数量是未添加组的2.35～5.56倍，培养45d后的芽生孢子数量是未添加组的44.4～79.2倍。本发明能获得芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾人工培养虫菌结合冬虫夏草，缩短冬虫夏草人工培养的时间，节约人工培养成本。

附图说明：

图1是本发明接种培养获得的冬虫夏草菌芽生孢子(400×)。

图2是本发明冬虫夏草菌液体培养。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例接种母液主要是接种冬虫夏草菌菌丝块培养30d后的培养液。

所述的接种母液是通过以下方法制备：

在150mL液体培养基中接种1cm2大小的冬虫夏草菌气生菌丝块，于12±2℃培养室,100转/分，黑暗培养30d的冬虫夏草菌培养液作为接种母液，接种母液中含少量芽生孢子(浓度为15个/mL)。所述的150mL液体培养基是将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

实施例1：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在预冷的培养基中加入37.5mg甲基法尼酯(终浓度为250mg/L，以不加甲基法尼酯作为对照)，再在每瓶培养基接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液(图2)，血球计数板计数芽生孢子数量达到3.88×106个/mL，是未添加甲基法尼酯组的4.85倍；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到3.55×108个/mL，是未添加甲基法尼酯组的71倍。显微镜下观察培养菌液，能够清晰的看到芽生孢子，具体如图1所示。

实施例2：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在预冷的培养基中加入18.75mg甲基法尼酯(终浓度为125mg/L，以不加甲基法尼酯作为对照)，再在每瓶培养基接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到3.02×106个/mL，是未添加甲基法尼酯组的3.78倍；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到2.89×108个/mL，是未添加甲基法尼酯组的57.8倍。

实施例3：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在预冷的培养基中加入150mg甲基法尼酯(终浓度为1g/L，以不加甲基法尼酯作为对照)，再在每瓶培养基中接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到4.45×106个/mL，是未添加甲基法尼酯组的5.56倍；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到3.96×108个/mL，是未添加甲基法尼酯组的79.2倍。

实施例4：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在预冷的培养基中加入1.5mg甲基法尼酯(终浓度为10mg/L，以不加甲基法尼酯作为对照)，再在每瓶培养基中接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到1.88×106个/mL，是未添加甲基法尼酯组的2.35倍；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到2.22×108个/mL，是未添加甲基法尼酯组的44.4倍。

对照例1：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在每瓶预冷的培养基中接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到8×105个/mL；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到5×106个/mL。

对照例2：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在每瓶预冷的培养基中接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到7.75×105个/mL；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到4.88×106个/mL。

对照例3：

冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入250mL三角瓶中，加水定容至150mL，经高压灭菌，置于12±2℃培养室预冷备用。

在每瓶预冷的培养基中接入1mL接种母液，其中每瓶培养基中含约15个芽生孢子，将三角瓶放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培养第30d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到7.22×105个/mL；培养第45d，取出1mL培养菌液，血球计数板计数芽生孢子数量达到4.93×106个/mL。

甲基法尼酯在促进冬虫夏草菌产芽生孢子中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。