专利摘要
本发明提供了一种木霉厚垣孢子的生产方法，其包括如下步骤：S1、制备木霉菌孢子悬液；S2、将所述木霉菌孢子悬液进行稀释后，接种于玉米粉培养基中，在28℃下进行培养，得到木霉厚垣孢子。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、获得的发酵液中木霉两类孢子含量较高，其中厚垣孢子占比可达40％以上，显著提高了木霉制剂中有效成分和产品货架期；2、补料技术所用原料无昂贵试剂，成本低，适合于不同规模生产，市场前景广阔；3、操作简单，本技术共有两次补料，操作简便，一般生产设备即可进行本技术发酵补料实验，适用性广。
权利要求
1.一种木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备木霉菌孢子悬液；
S2、将所述木霉菌孢子悬液进行稀释后，接种于玉米粉培养基中，在28℃下进行培养，得到木霉厚垣孢子；
步骤S2中，还包括补料的操作：在培养48h后，进行葡萄糖溶液的匀速补料，补料48h后，进行腐殖酸钾溶液的补料，然后再发酵48h；腐殖酸钾溶液的添加量为木霉菌孢子悬液体积的2％；所述腐殖酸钾溶液采用体积百分比数为4％的美邦腐殖酸液或体积百分比数为3％的一加十腐殖酸液配置获得。
2.如权利要求1所述的木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，步骤S1所述木霉菌孢子悬液的制备方法为：
将木霉菌株接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养3天后，洗下孢子，配制为木霉菌孢子悬液。
3.如权利要求2所述的木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，所述木霉菌株为棘孢木霉GDSF1009。
4.如权利要求1所述的木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，步骤S2中所述的玉米粉培养基包括按浓度计的如下组分：50g/L玉米粉、3.82g/L磷酸二氢钾、1.42g/L硝酸钠、1.1g/L硫酸铵、1g/L氯化钠、0.5g/L七水硫酸镁、0.0075g/L七水硫酸亚铁、0.0025g/L硫酸锰和0.002g/L硫酸锌，且pH由氢氧化钠标定至6.8～7.2。
5.如权利要求1所述的木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，步骤S2中所述的木霉菌孢子悬液经稀释后的菌落数为3×10
6.如权利要求1或5所述的木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，所述木霉菌孢子悬液在玉米粉培养基的接种量为0.3％。
7.如权利要求1所述的木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的浓度为500g/L，添加量为木霉菌孢子悬液体积的10％。
说明书
技术领域
本发明涉及一种木霉菌补料发酵诱导厚垣孢子高效生产技术，重点通过特异补料种类和工艺，提高木霉菌液体发酵过程中抗逆性厚垣孢子的产量。
背景技术
木霉菌是国际上公认的生物防治植物病害、促进作物生长和修复土壤的有益真菌，尤其在防治植物土传病害和修复农化污染土壤方面具有明显的优势。目前国际上70％的生物农药和生物肥料均含有木霉菌成分，产值年增长率15％以上，已成为农作物病害绿色防控的关键技术产品。然而，木霉菌菌剂在实际应用中经常受到诸多逆境等因素的影响，如高温、干旱、农药、盐渍化、紫外线等。因此木霉菌产品的货架期长短是制约产品应用效果的稳定性的关键。木霉菌主要通过分身孢子、厚垣孢子和菌丝体进行繁殖。其中分生孢子和菌丝对逆境因子很敏感，耐受能力很差，而厚垣孢子是一种厚壁型繁殖体，具有很强抗逆境因子胁迫的功能，因此如何通过发酵工艺提高木霉菌厚垣孢子含量，以延长木霉菌产品的货架期具有重要意义。
目前国内外木霉菌产品的有效成分主要是以分生孢子为主，对环境因子较敏感，常温下产品货架期大多数为3～6个月，严重影响了产品的商品性和推广应用价值，虽然国内外可通过微胶囊化技术延长分生孢子产品的货架期，但成本高，实用性差。关于厚垣孢子诱导技术国内外仅报道通过调节培养基酸度、减少培养基钙离子含量等方法提高厚垣孢子含量，但提高厚垣孢子产量的水平仍有限，因此急需筛选出液体发酵条件诱导厚垣孢子形成的新技术，并用于中式水平和大规模发酵生产过程中。
发明内容
本发明的目的是提供一种木霉菌补料发酵技术为核心的高产厚垣孢子转化的液体发酵技术。本发明技术重点是筛选获得了可诱导厚垣孢子高效产生的腐殖酸，并通过补料方式加入液体发酵培养基，从而提高发酵液中厚垣孢子比例。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种木霉厚垣孢子的生产方法，其包括如下步骤：
S1、制备木霉菌孢子悬液；
S2、将所述木霉菌孢子悬液进行稀释后，接种于玉米粉培养基中，在28℃下进行培养，得到木霉厚垣孢子。
作为优选方案，步骤S2中，还包括补料的操作：
在培养48h后，进行葡萄糖溶液的匀速补料，补料48h后，进行腐殖酸溶液的补料，然后再发酵48h。
作为优选方案，步骤S1所述木霉菌孢子悬液的制备方法为：
将木霉菌株接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养3天后，洗下孢子，配制为孢子悬液。
作为优选方案，所述木霉菌株为棘孢木霉GDSF1009。
作为优选方案，步骤S2中所述的玉米粉培养基包括按浓度计的如下组分：50g/L玉米粉、3.82g/L磷酸二氢钾、1.42g/L硝酸钠、1.1g/L硫酸铵、1g/L氯化钠、0.5g/L七水硫酸镁、0.0075g/L七水硫酸亚铁、0.0025g/L硫酸锰和0.002g/L硫酸锌，且pH由氢氧化钠标定至6.8～7.2。
作为优选方案，步骤S2中所述的木霉菌孢子悬液经稀释后的菌落数为3×10
作为优选方案，所述木霉菌孢子悬液在玉米粉培养基的接种量为3％。
作为优选方案，所述葡萄糖溶液的浓度为50m/v％，添加量为木霉菌孢子悬液体积的10％，腐殖酸钾溶液的添加量为木霉菌孢子悬液体积的2％。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、获得的发酵液中木霉两类孢子含量较高，其中厚垣孢子占比可达40％以上，显著提高了木霉制剂中有效成分和产品货架期；
2、补料技术所用原料无昂贵试剂，成本低，适合于不同规模生产，市场前景广阔；
3、操作简单，本技术共有两次补料，操作简便，一般生产设备即可进行本技术发酵补料实验，适用性广。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
1、平板培养：将棘孢木霉GDSF1009接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养3天。
PDA培养基：200g马铃薯去皮切块后蒸煮，取上层清液，加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，去离子水定容至1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌30min。
2、玉米粉培养基：按照浓度50g/L玉米粉、3.82g/L磷酸二氢钾、1.42g/L硝酸钠、1.1g/L硫酸铵、1g/L氯化钠、0.5g/L七水硫酸镁、0.0075g/L七水硫酸亚铁、0.0025g/L硫酸锰、0.002g/L硫酸锌配制1.5L玉米粉培养基，使用氢氧化钠将pH标定至6.8～7.2。分装至500mL挡板三角瓶，装液量100mL，在121℃下灭菌30min。
3、使用纯净水将培养好的PDA培养皿中的木霉菌冲洗为孢子悬浮液，稀释至3×10
4、将接种木霉菌的三角瓶在摇床中培养，温度28℃，转速180rpm，设置5个处理，3个重复。
5、结果与分析，在培养6天之后调查各处理孢子含量和厚垣孢子占比，取平均值，从数据可以看出采取该补料工艺之后，木霉孢子含量及厚垣孢子占比都明显提高，而第组孢子含量和厚垣孢子占比都明显高于其他处理，说明该工艺能够明显提升木霉孢子含量和有效的刺激分生孢子向厚垣孢子转化。
表1
1、平板培养：将棘孢木霉GDSF1009接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养3天。
PDA培养基：200g马铃薯去皮切块后蒸煮，取上层清液，加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，去离子水定容至1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌30min。
2、玉米粉培养基：按照浓度50g/L玉米粉、3.82g/L磷酸二氢钾、1.42g/L硝酸钠、1.1g/L硫酸铵、1g/L氯化钠、0.5g/L七水硫酸镁、0.0075g/L七水硫酸亚铁、0.0025g/L硫酸锰、0.002g/L硫酸锌配制1.5L玉米粉培养基，使用氢氧化钠将pH标定至6.8～7.2。分装至500mL挡板三角瓶，装液量200mL，在121℃下灭菌30min。
3、使用纯净水将培养好的PDA培养皿中的木霉菌冲洗为孢子悬浮液，稀释至3×10
4、将接种木霉菌的三角瓶在摇床中培养，温度28℃，转速180rpm，设置5个处理，3个重复。
5、结果与分析，在培养6天之后调查各处理孢子含量和厚垣孢子占比，取平均值，从数据可以看出在采用了一加十腐殖酸之后，木霉孢子含量及厚垣孢子占比同样都明显提高，说明该工艺能够明显提升木霉孢子含量和有效的刺激分生孢子向厚垣孢子转化，在实际生产过程能够稳定提升木霉厚垣孢子产生。
表2
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
一种木霉厚垣孢子的生产方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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