专利摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽pH适应性木聚糖酶XYNA4及其基因和应用。本发明提供了一种来源于脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidumA4(CGMCC No.3147)的木聚糖酶XYNA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因xynA4。本发明的木聚糖酶具有以下性质：最适pH7.0，最适温度55℃，比活为420.2U/mg；极宽范围的pH稳定性，较高的pH适应性和较好的热稳定性。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物饲料、食品、造纸、能源工业等。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽pH适应性木聚糖酶XYNA4及其基因和应用。

背景技术

木聚糖(xylan)是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于自然界中，其含量仅次于纤维素是第二丰富的多聚糖(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews.2005，29：3-23.)。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称。目前木聚糖酶在饲料，面包，啤酒、造纸、纺织、医药及能源等领域得到了日益广泛的应用。在造纸工业中，木聚糖酶可以应用于生物制浆、纸浆漂白、废纸脱墨处理处理等，特别是其在纸浆生物漂白中，木聚糖酶与传统的氯漂白配合，促使纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能，而且可以降低后续漂序化学物质的用量，减少富含氯化物的工业废水的排放，从而降低纸浆漂白对环境产生的污染(Polizeli et al.AppliedMicrobiology and Biotechnology.2005，67：577-591.)。

脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)是一类嗜热耐酸菌。由于脂环酸芽孢杆菌(A.acidocaldarius)等可以引起巴氏灭菌果汁的腐败，产生难以接受的气味，加上其独特的生存能力。目前已引起全球食品工业和学术界的极大关注。目前关于来源于脂环酸芽孢杆菌来源的木聚糖酶基因及其克隆与表达还没有相关的报导。

由于在饲料和造纸工业中，动物胃肠道和漂白纸浆的pH值出现较大的波动。因此，获得新型具有优良pH稳定性和适用性的木聚糖酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有高pH稳定性和适应性的的木聚糖酶可以更好的应用于饲料和造纸工业，而且可以降低生产成本，都是木聚糖酶应用于工业化生产所必需的。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的宽pH适应性木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述宽pH适应性木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述宽pH适应性性木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述宽pH适应性木聚糖酶的应用。

本发明的另一目的是提供一种脂环酸芽孢杆菌。

本发明从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4，(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3147，保藏日期：2009年6月29号)中分离得到一种新的宽pH适用性木聚糖酶XYNA4。

本发明提供了一种宽pH适应性木聚糖酶XYNA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MTDTYRNIPSLSERYRPYFRIGAAVNAKSLNTHRDLLVTHFNSVTAENEMKWEEIHPEQDRYEFAKADALVNFAREHGMFVRGHTLVWHNQTPAAVFLDDLGQTATAAVVERRLEEHVATVLGRYHNDIYDWDVANEAVVDAGTGFLRDSRWLQTLGDDYIAKAFRIAHQAAPDALLFYNDYNETKPDKSERIYKLVAGLLDEGVPIHGIGMQGHWMLDDPALDEIERAIDRYASLGVHLHITELDVCVYGNVHGTGGQSQEVLPYDDELAKRLAERYRSLFSSLRARKDVIESVTFWGVADDDTWRDNFPVRGRKDWPLLFDVNHGPKQAFWSVVEF

该酶基因编码338个氨基酸，因此成熟的木聚糖酶XYNA4的理论分子量为38.6kDa。

本发明的木聚糖酶XYNA4在中性及酸碱性范围内均具有较高活性。本发明筛选到一种脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCCNo.3147)所产生的木聚糖酶，其在大肠杆菌的重组酶最适pH值为7.0，在pH3.8～9.4的范围内维持40％以上的酶活性；在pH6.2～9.4的范围内维持60％以上的酶活性；在pH2.6～12.0的范围内37℃保温60分钟，能够保持90％以上的酶活性。最适温度为55℃，在45℃-65℃间均具有60％以上的酶活力；在60℃保温60分钟，剩余酶活达到90％以上。这种性质的木聚糖酶还未曾有过报道。

本发明提供了编码上述宽pH适应性木聚糖酶XYNA4的基因。具体地，该基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

ATGACTGACACTTATCGGAATATTCCTTCCTTGAGTGAGCGCTACCGCCCGTACTTTCGCATTGGTGCTGCCGTCAATGCCAAGTCCCTGAATACCCACCGTGACTTGTTGGTCACGCATTTTAACAGCGTGACCGCAGAGAACGAAATGAAGTGGGAAGAGATTCATCCAGAACAGGATCGATACGAGTTCGCAAAGGCGGATGCACTCGTGAATTTTGCCCGCGAGCACGGTATGTTTGTCCGCGGCCACACGTTGGTCTGGCACAATCAAACGCCAGCCGCAGTGTTTCTGGACGATCTCGGTCAAACAGCGACAGCGGCCGTTGTCGAGCGTCGACTCGAAGAGCATGTGGCAACAGTGCTTGGTCGATACCACAACGACATCTACGACTGGGATGTTGCCAACGAGGCAGTCGTCGATGCGGGTACAGGATTTTTACGGGACAGTCGCTGGCTGCAGACCCTTGGCGATGATTACATTGCGAAGGCTTTTCGCATCGCACATCAAGCGGCACCAGACGCACTGCTCTTCTACAACGACTACAATGAAACCAAACCCGATAAATCGGAGCGCATTTACAAACTTGTTGCAGGTCTGCTCGATGAAGGTGTCCCCATCCATGGGATTGGTATGCAGGGGCACTGGATGTTGGACGATCCGGCGCTGGACGAAATTGAACGAGCTATCGACCGCTACGCGTCACTCGGTGTGCACCTTCACATCACAGAACTCGACGTGTGTGTTTATGGCAATGTCCACGGAACGGGCGGCCAATCCCAAGAAGTTCTACCCTACGACGATGAACTTGCCAAACGTTTGGCCGAGCGTTATCGTTCTCTGTTTTCATCGTTGCGCGCTCGCAAGGATGTCATCGAAAGCGTCACGTTCTGGGGGGTTGCTGATGATGATACCTGGCGGGACAACTTCCCTGTTCGCGGACGCAAAGACTGGCCACTTCTGTTTGACGTGAACCACGGGCCGAAACAGGCGTTTTGGAGCGTGGTTGAATTTTGA

本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因XYNA4，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYNA4结构基因XYNA4全长1017bp，含有一个终止子TGA。木聚糖酶XYNA4的成熟蛋白理论分子量为38.6kDa。将木聚糖酶基因XYNA4序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。该基因与来源于Alicyclobacillusacidocaldarius的木聚糖酶(ACV59335.1)氨基酸序列一致性为62％。与来源于Geobacillus stearothermophilus的已知活性木聚糖酶(ABI49937.2)氨基酸序列一致性为53％，说明XYNA4是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因XYNA4的重组载体，优选为载体pET-22b(+)。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET-22b(+)上的EcoR I和Hind III限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET-22b(+)-XYNA4。

本发明还提供了包含上述宽pH适应性的木聚糖酶基因XYNA4的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种制备宽pH适应性的木聚糖酶XYNA4的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNA4。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、啤酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组表达质粒转化大肠杆菌细胞(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/XYNA4。

本发明还提供了上述宽pH适应性的木聚糖酶XYNA4的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料，食品和造纸工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为7.0，在pH 6.2～9.4都有较高的酶活性(60％以上)；pH稳定性好；比活力为420.2U/mg；具有较好的耐热的能力。其较高耐热性能，可以有效降低在饲料加工过程中酶活力的损失，降低木聚糖酶的应用成本。较高pH适应范围提高饲料中非淀粉性多糖的转化率，降低配方成本，减少环境污染；改善面包加工过程的外观品质；可应用于啤酒工业，降低麦芽汁的粘度，提高过滤效率，增加麦芽汁产率；还可以用于生物能源中，如将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖转化为D-木糖单体，进而被大多数微生物代谢，转化成有价值的燃料。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在保健食品行业；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。

附图说明

图1在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：纯化的重组木聚糖酶。

图2重组木聚糖酶的最适pH。

图3重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4重组木聚糖酶的最适温度。

图5重组木聚糖酶的热稳定性。

脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4CGMCC3147，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3147，保藏日期：2009年06月29号。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4CGMCC3147，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3147。大肠杆菌表达载体pET-22b(+)及菌株BL21(DE3)购自于Merch公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4CGMCC3147培养基组成为：

生长培养基：0.2％蛋白胨、0.1％酵母提取物、0.2％葡萄糖，pH3.0.

产酶培养基：0.2％蛋白胨、0.1％酵母提取物、0.5％木聚糖，pH3.0.

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)的分离纯化及其产酶特性

采自云南高温泉流淌物土样转接到富集培养基(酵母提取物1.0g、胰蛋白胨2.0g用盐酸调pH2.0)，60℃培养72小时后，稀释涂板至分离培养基(酵母提取物1.0g、胰蛋白胨2.0g、燕麦木聚糖5.0g，琼脂30，刚果红0.5g，用盐酸调pH3.0)60℃培养72小时后，根据透明圈的有无和大小挑取到一株产酶菌株，编号为A4，根据16SRNA和菌株特性鉴定为脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4。将脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4然后转接生长培养基(酵母提取物1.0g、胰蛋白胨2.0g用盐酸调pH3.0)，测试其最适生长温度和pH值。结果表明其最适生长温度为60℃和pH3.5。将脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4经产酶培养基(酵母提取物1.0g、胰蛋白胨2.0g燕麦木聚糖5.0g，用盐酸调pH3.0)60℃培养48小时后，测定上清液的木聚糖酶活性。证明其具有木聚糖酶活性。

实施例2脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)木聚糖酶编码基因XYNA4的克隆

提取脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)基因组DNA：

将液体培养2天的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，65℃水浴锅裂解30min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守(YDWDV和HGIGM)序列设计合成了简并引物XYN10F，XYN10R如表1

以脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；前10个循环，94℃变性30sec，48℃-53℃touchdown(0.5℃/循环)退火30sec，72℃延伸1min，然后25个循环条件为后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸1min。最后72℃保温10min。得到一约258bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性嵌套引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYNA4TAIL-PCR特异性引物

N代表A，G，C或T；M代表A或C；S代表C或G；W代表A或T；D代表A，G或T；Y代表C或T

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后测序。通过比较木聚糖酶的基因组序列后发现该基因全长1017bp，编码338个氨基酸和一个终止密码子，N端没有预测的信号肽序列。所测出的基因XYNA4的核苷酸序列与GeneBank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较，最高一致性为65％，氨基酸序列最高一致性为62％。与已知活性木聚糖酶氨基酸序列一致性为53％，说明XYNA4是一种新的木聚糖酶，表明从Alicyclobacillus hesperidumA4(CGMCC No.3147)中分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。

实施例3重组木聚糖酶的制备。

将表达载体PET-22B(+)进行双酶切(EcoRI+Hind III)，同时将编码木聚糖酶的基因XYNA4双酶切(EcoRI+Hind III)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPET-22B(+)连接，获得含有Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)木聚糖酶基因XYNA4的重组质粒PET-22b(+)-XYNA4并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XYNA4。

取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株，接种于200mL LB培养液中(1000ml三角瓶)，37℃250rpm振荡培养3～4h后，添加IPTG诱导。30℃250rpm振荡培养10～12h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为0.38U/mL。所表达的木聚糖酶经过镍柱纯化之后，经过SDS-PAGE电泳分析，结果(图1)表明，重组木聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达。

实施例4重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH7.0(0.1M磷酸二氢钠-柠檬酸)，55℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液和900μL(1％，w/v)底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5重组木聚糖酶XYNA4的性质测定

1、重组木聚糖酶XYNA4的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的缓冲液(0.1M甘氨酸-盐酸pH2.2-5.4；0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠pH5.4-7.8；0.1M Tris-HCl pH7.4-8.6；0.1M甘氨酸-氢氧化钠pH8.6-12.0)、在55℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，XYNA4的最适pH为7.0，在pH6.2～9.4的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中55℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明木聚糖酶在pH2.6-12.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在90％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在55℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为55℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在60℃时稳定性非常好。65℃下保温60min，剩余酶活性为31.6％。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From birchwood)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系中，55℃下测定酶活性，计算出其在50℃下的k_m值。经测定，此木聚糖酶在55℃下以木聚糖为底物的k_m值为1.90mg/mL，最大反应速度V_max为417.93μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYLA4酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和10mmol/L。在55℃、pH7.0条件下测定酶活性。结果(表2)表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。Zn²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Ag⁺可以部分抑制其活力，但是Hg²⁺和SDS几乎强烈抑制其活力。当浓度为10mmo时Zn²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Ag⁺，Hg²⁺，和SDS均强烈抑制其活力。β-巯基乙醇在1mmol和10mmol时能分别使重组酶活力增加到原来的1.13和1.32倍。

表2.各种化学试剂对木聚糖酶XYNA4活力的影响

注：“ND”代表无法检测。

5、木聚糖酶降解燕麦木聚糖产物的分析如下：

在200μL2％的木聚糖中加入200μL纯化的酶液(约4.0U)，37℃下保温12h。12000rpm离心后用3k的超滤膜高速离心后，用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶XYNA4降解燕麦木聚糖的产物主要是木糖，木二糖和少量木三糖和木四糖。产物中木糖含量为51.50％，木二糖含量为34.30％，木三糖的含量为7.53％，木四糖含量为6.65％。

一种宽pH适用性的木聚糖酶XYNA4及其基因和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。