专利摘要

本发明涉及一种利用角蛋白酶生产菌株高效降解羽毛的方法，属于发酵工程领域。本发明将能够分泌角蛋白酶的地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisBBE11‑1)和嗜麦芽窄食单胞菌(StenotrophomonasmaltophiliaBBE11‑1)进行混合培养用于大量羽毛的降解并基于发酵工程策略对混菌降解羽毛过程进行优化控制，获得了一种利用微生物高效降解羽毛的方法，羽毛水解率达82％。

权利要求

1.一种高效降解羽毛的方法，所述方法采用地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌进行混合培养发酵酶解羽毛；

所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BBE11-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC NO.M2011319；所述嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia) BBE11-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCCNO.M2011193；

所述方法为分阶段控制混菌发酵酶解羽毛；

第一阶段的搅拌转速450-550r/min，培养温度为35-39℃，通气量为1.5-3.0vvm，培养10-14h；第二阶段的培养温度降低至28-32℃，增加通气量至1.8-2.3vvm，搅拌转速提高至550-600r/min，培养10-14h；第三阶段的加通气量至2.8-3.2vvm，搅拌转速提高至700-800r/min，培养40-60h。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：

(1)将地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌进行混合培养，得到种子液；

(2)预处理含鸡毛的培养基，接入种子液；

(3)第一阶段是菌体生长阶段；

(4)第二阶段是快速产酶阶段；

(5)第三阶段是维持酶活水平和鸡毛快速降解阶段。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)混合培养是将地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌接种于LB培养基，37℃下摇瓶培养获得种子液。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(2)是将含质量分数为3-8％鸡毛的基础培养基，121℃处理15min，冷却至室温后，接入质量分数8-12％的种子培养液。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用角蛋白酶生产菌株高效降解羽毛的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

角蛋白酶是一种由微生物产生，可以降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，牛羊角等) 的特异性蛋白酶，主要由某些细菌、真菌、放线菌以羽毛或羊毛为单一碳氮源生长时获得。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，在工业化生产中具有较大的应用潜力，可以替代传统蛋白酶，用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等领域。

动物的大量消费产生许多羽毛废弃物，利用家禽羽毛制备动物饲料等副产品的研究较早，已经取得一定规模的应用发展，但羽毛中90％的角蛋白未被高效利用，造成可利用资源的浪费。角蛋白作为羽毛的主要成分因大量二硫键的交联成为复杂的三维网状结构，具有良好的稳定性和难溶性，一般方法很难将其水解。

目前常用途径有物理、化学和酶法降解。尽管物理、化学方法研究较早，但存在破坏氨基酸结构、产物单一以及产物稳定性差等缺点。酶法反应条件温和，环境污染小，产物营养丰富，但是目前基于酶法的羽毛降解的效率较低，这是阻碍其发展的最大问题。

发明内容

本发明将能够分泌角蛋白酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BBE11-1)和嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1)进行混合培养用于大量羽毛的降解并基于发酵工程策略对混菌降解羽毛过程进行优化控制，获得了一种利用微生物高效降解羽毛的方法。

本发明的第一个目的是，提供一种高效降解羽毛的方法，所述方法采用地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌进行混合培养发酵酶解羽毛。

在本发明的一种实施方式中，所述衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BBE11-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC NO.M2011319；所述嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号 CCTCCNO.M2011193。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为分阶段控制混菌发酵酶解羽毛过程。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体步骤如下：

(1)将地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌进行混合培养，得到种子液；

(2)预处理含鸡毛的培养基，接入种子液；

(3)第一阶段是菌体生长阶段；

(4)第二阶段是快速产酶阶段；

(5)第三阶段是维持酶活水平和鸡毛快速降解阶段。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)混合培养是将地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌接种于LB培养基，37℃下摇瓶培养获得种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)是将含质量分数为3-8％鸡毛的基础培养基， 121℃处理15min，后冷却至室温后，接入质量分数8-12％的种子培养液

在本发明的一种实施方式中，所述第一阶段的搅拌转速450-550r/min，培养温度为 35-39℃，通气量为1.5-3.0vvm，培养10-14h。

在本发明的一种实施方式中，所述第二阶段的培养温度降低至28-32℃，增加通气量至 1.8-2.3vm，搅拌转速提高至550-600r/min，培养10-14h。

在本发明的一种实施方式中，所述第三阶段的加通气量至2.8-3.2vvm，搅拌转速提高至 700-800r/min，培养40-60h。

本发明的有益效果：

(1)通过两种角蛋白酶生产菌株进行混合培养的方式，实现了大量羽毛的快速降解，羽毛降解率得到了巨大的提高；

(2)经过72h水解，总氨基酸含量达到155±10mg/g，鸡毛水解液中酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)含量逐步积累并达到较高水平；

(3)水解液中多肽成分主要为1.3KDa附近的短肽和小于1KDa的寡肽，表明水解程度较大，这些具有生物活性的短肽和寡肽具有良好的应用价值。

附图说明

图1嗜麦芽窄食单胞菌发酵酶解羽毛过程中角蛋白酶活力、蛋白酶活力和菌体密度的关系

图2地衣芽胞杆菌发酵酶解羽毛过程中角蛋白酶活力、蛋白酶活力和菌体密度的关系

图3混菌发酵酶解羽毛过程中角蛋白酶活力、蛋白酶活力和菌体密度的关系

图4酶解前后羽毛干重的变化

图5水解液多肽分析

图6 3L发酵罐中单独培养和混菌培养降解羽毛效果

具体实施方式

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L。

基础培养基：大豆蛋白胨1.45g/L，葡萄糖4.25g/L，K2HPO41g/L，KH2PO41g/L，NaCl1g/L。

多肽检测方法

(1)将酶解过程中所取的水解液样品在8000r/min下离心5min，取上清并用0.22μm的滤膜过滤，滤液备用；

(2)使用凝胶柱TSK gel G2000SWXL(7.8×300mm)和安捷伦高效液相色谱系统，按照国标(GB/T22492-2008)的多肽检测方法对不同时间取样的鸡毛水解液进行多肽分析。

氨基酸检测方法

(1)将酶解过程中所取的水解液样品在8000r/min下离心5min，取上清并加入等体积的5％(w/v)的三氯乙酸，4℃下沉淀1h，8000r/min离心5min，再次取出上清并用0.22μm的滤膜过滤，滤液备用；

(2)使用色谱柱Hypersil ODS-2(250×4.6mm 5μm)和安捷伦高效液相色谱系统，采用 OPAFMOC柱前衍生法对不同时间取样的鸡毛水解液进行氨基酸分析。

角蛋白酶酶活的测定方法

(1)原理：角蛋白酶水解可溶性角蛋白底物释放出酪氨酸，再根据福林酚法测定酪氨酸含量，酪氨酸含量与角蛋白酶活力成正比。定义一个酶活单位为50℃下每分钟转化角蛋白底物释放1μmol酪氨酸。

(2)测定步骤：取50μL适当稀释的酶液，加入150μL50mMGly/NaOH缓冲液和100 μL2.5％的可溶性角蛋白底物，混匀后于50℃下反应20min。加入200μL 4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r/min离心3min。取上清200μL，加入1mL 4％(w/v) 的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于 660nm下测定清液吸光值。实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂 TCA，其余操作同上。

蛋白酶酶活的测定方法

蛋白酶酶活的测定方法与中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T10317-1999)相似，仅在反应体系上进行了一定的缩小。具体为：200μL适当稀释的酶液加入200μL溶解于磷酸盐缓冲液的酪蛋白底物，40℃下反应30min，加入400μL 0.4mol/L的 TCA终止反应，离心取出上清液150μL，加入750μL0.4mol/L的Na2CO3和150μL的福林酚试剂，混匀后40℃下显色20min，使用0.5cm石英比色皿于680nm下测定清液吸光值。实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。

实施例1嗜麦芽窄食单胞菌发酵酶解羽毛

嗜麦芽窄食单胞菌发酵酶解羽毛，步骤如下：

(1)将嗜麦芽窄食单胞菌的甘油菌按1/1000的比例接种到LB液体培养基，37℃，220rpm 培养12h得到一级种子液，再按1/100的比例转接LB液体培养基37℃，220rpm培养3h得到二级种子液；

(2)在3L发酵罐中加入1.5L基础培养基和5％(75g)的鸡毛，121℃处理15min后冷却至室温。按照20％的接种量接入二级种子液，初始pH为9.0，搅拌转速为500r/min，通气量为2.0vvm，发酵温度为23℃，控制溶氧值(DO)在25-35。

实验结果：3L发酵罐中，嗜麦芽窄食单胞菌分泌的蛋白酶活力较低，75g鸡毛酶解72h 后，剩余鸡毛干重为65.32g，降解率仅为13％。

实施例2地衣芽孢杆菌发酵酶解羽毛

地衣芽孢杆菌发酵酶解羽毛，步骤如下：

(1)将地衣芽孢杆菌的甘油菌按1/1000的比例接种到LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h得到一级种子液，再按1/100的比例转接LB液体培养基37℃，220rpm培养3h得到二级种子液；

(2)在3L发酵罐中加入1.5L基础培养基和5％(75g)的鸡毛，121℃处理15min后冷却至室温。按照20％的接种量接入二级种子液，初始pH为7.2，搅拌转速为500r/min，通气量为2.0vvm，发酵温度为23℃，控制溶氧值(DO)在25-35。

实验结果：3L发酵罐中，地衣芽孢杆菌分泌的角蛋白酶活力较低，75g鸡毛酶解72h后，剩余鸡毛干重为50.76g，降解率为32％。

实施例3地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌进行混合培养发酵酶解羽毛及过程控制

地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌进行混合培养发酵酶解羽毛及过程控制，具体步骤如下：

(1)将两种菌的甘油菌按1/1000的比例接种到LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h得到一级种子液，再按1/100的比例转接LB液体培养基37℃，220rpm培养3h得到二级种子液；

(2)在3L发酵罐中加入1.5L基础培养基和5％(75g)的鸡毛，121℃处理15min后冷却至室温。按照10％的接种量分别接入两种菌的二级种子液，初始pH为8.0，37℃。

(3)第一阶段(0-12h)为菌体生长阶段，初始搅拌转速500r/min，培养温度为37℃，通气量为2.0vvm；

(4)第二阶段(12-24h)为快速产酶阶段，在分批发酵12h后培养温度由37℃降低至30℃，开始增加通气量为2.5vvm，搅拌转速提高至600r/min。此阶段角蛋白酶酶活和蛋白酶酶活最高分别为500U/mL和600U/mL；

(5)第三阶段(24-72h)为维持酶活水平和鸡毛快速降解阶段，24h后温度维持在30℃，通气量增加到3vvm，根据DO变化的需要调整搅拌转速，最大转速不超过800r/min。此阶段角蛋白酶酶活和蛋白酶酶活最高分别为600U/mL和650U/mL。

实验结果：3L发酵罐中体系中角蛋白酶活力和蛋白酶活力都保持了较高的水平，75g 鸡毛酶解72h后，剩余鸡毛干重为13.89g，水解率达到82％(图4)。

根据图6可以看出，地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌单菌发酵72h后，还有大量鸡毛没有降解，以固态呈现；而地衣芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌混合发酵72h后，鸡毛基本降解完全，仅存在少量的固体。

实施例4羽毛降解液中氨基酸的含量

羽毛降解液中氨基酸的种类及含量如表1所示：，

表1水解液氨基酸分析

根据表3可知，经过72h水解后，水解液中总氨基酸含量达到155±10mg/g，鸡毛水解液中酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)含量逐步积累并达到较高水平。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一种利用角蛋白酶生产菌株高效降解羽毛的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。