专利摘要

本发明涉及一种中国酱香型白酒的芽孢杆菌高温大曲制备方法。其技术方案是：选用5株芽孢杆菌菌株分别经过一级种子培养、二级种子培养、扩大培养，5株芽孢杆菌扩大培养液以腊状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌（1：1：1：0.5：0.5）比例混合成芽孢杆菌混合液；5种芽孢杆菌混合液、水、和经蒸汽杀菌后曲料粉（由小麦粉和豌豆粉组成）按比率拌料、踩曲、曲块入曲房、第一次升温培菌发酵、翻曲、发酵成熟曲块经通风晾干粉碎成粉，与小麦粉和高粱粉按比例加水拌料、调pH值、踩曲、曲块入曲房、第二次升温培菌发酵、翻曲、经入曲库贮存后为新成的芽孢杆菌高温大曲，可作为酿造酱香型白酒增香作用的高温大曲。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酿酒大曲的制备方法，具体说涉及一种酿造中国酱香型白酒的高温大曲的制备方法。

背景技术

中国酱香型白酒（以茅台酒为代表）所使用的高温大曲是自然接种、开放式固态发酵培养，制曲过程培养温度高达60-65℃。由于高温大曲本身制曲温度高，酵母等大部分不耐高温的微生物被淘汰，高温大曲中微生物菌群结构以嗜热性芽孢杆菌为主，高温大曲中嗜热性芽孢杆菌及其产生酶类在制曲过程中的作用机理与酱香型白酒的酱香特征物质构成是密切相关，成品曲的香气物质是酱香型白酒的酱香的主要来源之一。本发明通过多年对国内多家酱香型白酒的高温大曲研究认识到：可以用某些种类芽孢杆菌经纯种培养后加入在制曲原料中制成芽孢杆菌的高温大曲，这种芽孢杆菌高温大曲外观黄褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，酱香型白酒的酱香的前提物质如酚类、吡嗪等含量比较大，可以作为酿造酱香型白酒增香作用的高温大曲。因此，利用芽孢杆菌高温大曲与原有传统高温大曲搭配，以一定的比例酿造酱香型白酒，可以提高酱香型白酒的质量和产酒率，对于发展高档酱香型白酒，提高企业经济效益具有现实意义和应用前景。

发明内容

本发明拟将芽孢杆菌培养液与制曲原料按一定比例进行混合，通过二次培菌发酵技术制备芽孢杆菌高温大曲。利用这种芽孢杆菌高温大曲与原有传统高温大曲搭配比例进行酿造酱香型白酒可以提升酱香型白酒的质量，提高优质酒产酒率，增加高档酱香型白酒产量。

为实现本发明的目的而采用技术方案如下：

取ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCC11090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌各1株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37℃培养18～24h，制成5种芽孢杆菌一级种子。

将5种芽孢杆菌斜面培养基的一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，分别制成均匀的菌悬液。菌悬液经80℃水浴加热10min后，以占液体培养基5%体积的接种量，分别接入液体培养基中，在37℃、pH值7.0条件下，以200r/min，培养20～48h制成5种芽孢杆菌二级种子液。

将5种芽孢杆菌二级种子液分别经80℃水浴加热10min后，按占自动控温发酵罐中液体培养基10%体积的接种量，分别接入5个自动控温发酵罐，罐装液量50～75％(v/v)，以150r/min，37℃培养20～25h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液。

分别取出5罐中的芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，配制成芽孢杆菌混合液备用。芽孢杆菌扩大培养种子液混合的体积量比例为腊状芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：纳豆芽孢杆菌=1：1：1：0.5：0.5。

以小麦和豌豆为原料，分别将小麦和豌豆进行粉碎成粉，按重量计，豌豆粉：小麦粉=1：4～5比例混合后经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有小麦表皮65%，小麦细粉35%，豌豆粉碎成细粉为佳。

    将备用的芽孢杆菌混合液按照1 ：15～20的体积比加水稀释，按1kg曲料粉加入0.04kg芽孢杆菌稀释液混合拌匀成带菌的曲料，将带菌的曲料装入曲模踩曲、出模曲块放置阴干1.5小时后搬入曲房。

在曲房里曲块进行第一次自然升温培菌发酵培养，曲块自然升温培菌发酵5～6天后，待中间曲块温度上升至56～58℃时进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过翻曲时最高曲温，经9～10天左右进行再次翻曲，再经过15～20天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一步工序备用。

将小麦和高粱分别进行粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%。高粱粉要求过40目筛子的碎粒30%，细粉70%。将曲块粉、高粱粉和小麦粉进行混合拌匀成曲料干粉，按重量计曲块粉：高粱粉：小麦粉=3：1：6；按照曲料干粉的重量加35%水拌成湿曲料，用稀氨水调整pH为7.2～7.5。将湿曲料装入曲模踩曲，出模曲块放置1.5小时后搬入曲房。

在曲房进行第二次自然升温培菌发酵培养。培养5～6天后中间曲块温度上升至65～68℃时进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过翻曲时最高曲温，经9～10天左右进行再次翻曲，30～40天后将曲块搬入库房贮存。

在曲库房贮存3～4个月后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。芽孢杆菌高温大曲外观黄褐色兼有棕褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，理化指标检测糖化酶活力：100-300（mg葡萄糖 / h.g曲）、水分：10～12%、酸度：1.6～2.2（NaOH mL/g）、酯化力：≥6.0（mg/g·100h）。

所述的营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为：蛋白胨5g 、牛肉膏30g、NaCl 5g 、琼脂15g、1L蒸馏水，调自pH值7.0。所述的液体培养基组成为：1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0.5g牛肉膏，pH值7.0。所用菌株ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCC11090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌购自中国微生物菌种网（http://www.mum800.com）。

具体实施方式

实施例1。

芽孢杆菌混合液制备：选择ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCC11090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌各1株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37℃培养20h，制成5种芽孢杆菌一级种子。

分别将5种芽孢杆菌斜面培养基一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，制成均匀的菌悬液，菌悬液在80℃水浴加热10min后，再分别取15ml的菌悬液接种在装有300ml液体培养基的1000ml三角瓶中，在37℃、pH值7.0条件下，以200r/min培养30 h制成5种芽孢杆菌二级种子液。

分别将5种芽孢杆菌二级种子液经80℃水浴加热10min后，再分别取250ml的芽孢杆菌二级种子液接种在装有2500ml液体培养基的5个5L自动控温发酵罐中，以150r/min，37℃培养20h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液。

分别取出5罐中的2000ml腊状芽孢杆菌，2000ml份地衣芽孢杆菌，2000ml份短小芽孢杆菌，1000ml份枯草芽孢杆菌和1000ml纳豆芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，配制成芽孢杆菌混合液备用。

取小麦和豌豆分别粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%，豌豆粉碎成细粉为佳。160kg小麦粉与40kg豌豆粉混合经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用。

取备用的芽孢杆菌混合液6L，加入90L水进行稀释，取稀释后的80kg芽孢杆菌稀释液与200kg的曲料粉混合拌匀成带菌的曲料；将曲料装入曲模踩曲、出模曲块放置1.5小时后将曲块搬入曲房。

在曲房里进行第一次自然升温培菌发酵培养，曲块自然升温培菌发酵6天后，待中间曲块温度上升至56℃后进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过56℃，经10天左右进行再次翻曲，再经过18天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一步工序备用。

将小麦和高粱进行粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%。高粱粉要求过40目筛子的碎粒30%，细粉70%。按重量份计将150kg曲块粉、50kg高粱粉和300kg小麦粉进行混合拌匀成曲料干粉，按照曲料干粉的重量份加175kg水拌成湿曲料，用稀氨水调整pH为7.2。将湿曲料装入曲模踩紧，出模曲块自然放置1.5小时后搬入曲房。

在曲房进行第二次自然升温堆曲发酵培养。培养5天后中间曲块温度上升至65℃后进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过65℃，经9天左右进行再次翻曲，40天后将曲块搬入库房贮存。

在库房贮存4个月后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。成品曲外观黄褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，理化指标检测糖化酶活力240（mg葡萄糖 / h.g曲）、水分10.8 %、酸度2.0（NaOH mL/g）、酯化力6.5（mg/g·100h）。

上述的营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为：蛋白胨5g 、牛肉膏30g、NaCl 5g 、琼脂15g、1L蒸馏水，调自pH值7.0。上述的液体培养基组成为：1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0.5g牛肉膏，pH值7.0。本实施例所用的芽孢杆菌菌种，购自中国微生物菌种网（http://www.mum800.com）。

实施例2。

选择ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCC11090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌各1株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37℃培养24h，制成5种芽孢杆菌一级种子。

    分别将5种芽孢杆菌一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，制成均匀的菌悬液，80℃水浴加热10min制成，再分别取20ml的孢子悬液接种在装有400ml液体培养基的1000ml三角瓶中，在37℃、pH值7.0条件下，以200r/min培养40 h制成5种芽孢杆菌二级种子液。

分别将5种芽孢杆菌二级种子液经80℃水浴加热10min后，再分别取300ml的芽孢杆菌二级种子液接种在装有3000ml液体培养基的5个5L自动控温发酵罐中，以150r/min，37℃培养25h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液。

分别取出5罐中的2000ml腊状芽孢杆菌，2000ml份地衣芽孢杆菌，2000ml份短小芽孢杆菌， 1000ml份枯草芽孢杆菌和1000ml纳豆芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，配制成芽孢杆菌混合液备用。

取小麦和豌豆分别粉碎成粉，小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%，豌豆粉碎成细粉为佳。200kg小麦粉与40kg豌豆粉混合经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用。

取备用的芽孢杆菌混合液5L，加入100L水进行稀释，以96kg芽孢杆菌稀释液与240kg曲料粉进行混合拌匀成带菌的曲料；将曲料装入曲模踩曲、出模曲块放置1.5小时后搬入曲房，在曲房里进行第一次自然升温培菌发酵培养，曲块自然升温培菌发酵6天后，待中间曲块温度上升至58℃后进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过58℃，经9天进行再次翻曲，再经过20天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一步工序备用。

将小麦和高粱进行粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%。高粱粉要求过40目筛子的碎粒30%，细粉70%。按重量份计将180kg曲块粉、60 kg高粱粉和360kg小麦粉进行混合拌匀成曲料干粉，按照曲料干粉的重量份加210kg水拌成湿曲料，用稀氨水调整pH为7.3。将湿曲料装入曲模踩曲，出模曲块放置1.5小时后搬入曲房。

在曲房进行第二次自然升温培菌发酵培养。培养6天，待中间曲块温度上升至68 ℃后进行翻曲，翻曲后控制曲温不得超过68℃，经10天左右进行再次翻曲，35天后将曲块搬入库房贮存。

在库房贮存100天后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。成品曲外观黄褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，理化指标检测糖化酶活力213（mg葡萄糖 / h.g曲）、水分11.6 %、酸度2.2（NaOH mL/g）、酯化力6.8（mg/g·100h）。

上述的营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为：蛋白胨5g 、牛肉膏30g、NaCl 5g 、琼脂15g、1L蒸馏水，调自pH值7.0。上述的液体培养基组成为：1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0.5g牛肉膏，pH值7.0。本实施例所用的芽孢杆菌菌种，购自中国微生物菌种网（http://www.mum800.com）。

一种芽孢杆菌高温大曲的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。