含高能磷酸键的荧光染料

IPC分类号 : C09B57/00,C09K11/06

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CN201610255237.3

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专利摘要

含高能磷酸键的荧光染料，所述荧光染料具有通式I的结构，如附图1。该类荧光染料在活细胞非线粒体内具有较低的荧光背景，在活细胞中线粒体区域内具有较强的荧光信号，且对活细胞内三磷酸腺苷酶具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。

权利要求

1.含高能磷酸键的荧光染料，具有通式I的结构：

通式I中：

所述的R₁和R₂各自独立选自：C_n烷基、-O(CH₂)_nCH₃、-O(CH₂)_nOH、-O(CH₂)_nNH₂、-O(CH₂)_nNHCH₃、-O(CH₂)_nN(CH₃)₂、-OP(O)(CH₂)_nCH₃、-OP(O)(CH₂)_nOH、-OP(O)(CH₂)_nNH₂、-OP(O)(CH₂)_nNHCH₃、-OP(O)(CH₂)_nN(CH₃)₂、-OP(O)(CH₂)_nP(O)CH₃、-OP(O)(CH₂)_nP(O)OH、-OP(O)(CH₂)_nP(O)NH₂、-OP(O)(CH₂)_nP(O)NHCH₃、-OP(O)(CH₂)_nP(O)N(CH₃)₂、HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n、-OH或-H，其中n是1-8的整数；

所述的R₃选自：C_p烷基、-CN、-(CH₂)_pOH、-(CH₂)_pOCH₃、-(CH₂)_pO(CH₂)_qOH、-NH(CH₂)_pCH₃、-NH(CH₂)_pNH₂、-(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-NH(CH₂)_pO(CH₂)_qCH₃、-(CH₂)_pNH₂、-NH(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-N(CH₃)(CH₂)_pCH₃或-(CH₂)_pN(CH₃)(CH₂)_qCH₃，其中p和q各自独立地选自1-8的整数；

所述的L选自：C_x烷基、-O(CH₂)_x-、-(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_y-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yO-、-NH(CH₂)_x-、-(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNHC(O)-、-NH(CH₂)_xC(O)NH-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_y-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH-、-O(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-、-NH(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-或-O(CH₂)_xNH(CH₂)_yO-，其中x和y各自独立地选自1-8的整数；

所述的M选自：

2.根据权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：所述的R₁和R₂各自独立地选自：-OP(O)(CH₂)_nCH₃、-OP(O)(CH₂)_nOH、-OP(O)(CH₂)_nNH₂、-OP(O)(CH₂)_nNHCH₃、-OP(O)(CH₂)_nN(CH₃)₂、-OP(O)(CH₂)_nP(O)CH₃、-OP(O)(CH₂)_nP(O)OH、-OP(O)(CH₂)_nP(O)NH₂、-OP(O)(CH₂)_nP(O)NHCH₃、-OP(O)(CH₂)_nP(O)N(CH₃)₂、HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n、-OH或-H，其中n是1-8的整数。

3.根据权利要求2所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：所述的R₁和R₂各自独立地选自HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n、HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、-OP(O)(CH₂)_nP(O)OH、-OP(O)(CH₂)_nOH、-OH，其中n是1-8的整数。

4.根据权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：所述的R₃选自C_p烷基、-CN、-(CH₂)_pOH、-(CH₂)_pOCH₃、-NH(CH₂)_pCH₃、-NH(CH₂)_pNH₂、-NH(CH₂)_pO(CH₂)_qCH₃、-(CH₂)_pNH₂、-NH(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-N(CH₃)(CH₂)_pCH₃或-(CH₂)_pN(CH₃)(CH₂)_qCH₃,其中p和q各自分别选自1-8的整数。

5.根据权利要求4所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：所述的所述的R₃选自C_p烷基、-CN、-NH(CH₂)_pCH₃、-NH(CH₂)_pO(CH₂)_qCH₃、-NH(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-N(CH₃)(CH₂)_pCH₃,其中p和q各自分别选自1-8的整数。

6.根据权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：所述的L选自C_x烷基、-O(CH₂)_x-、-(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_y-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yO-、-NH(CH₂)_x-、-(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNH-、-NH(CH2)_xNHC(O)-、-NH(CH₂)_xC(O)NH-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_y-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH-、-O(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-、-NH(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-或-O(CH₂)_xNH(CH₂)_yO-,其中x和y各自分别选自1-8的整数。

7.权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料，其特征在于：M选自

8.权利要求1所述的含高能磷酸键的荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

1)H-M-Br与R₃-H按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R₃-M-Br；

反应温度为0-200℃，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；

2)化合物R₃-M-Br与化合物H-L-H按摩尔比1:1-1:15反应，制备化合物R₃-M-L-H：

反应温度0-180℃，反应时间1-36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；

3)化合物R₃-M-L-H与化合物B按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物I：

反应温度25-160℃，反应时间1-15小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物；缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)、二环己基碳二亚胺(DCC)；催化剂选用4-二甲氨基吡啶。

9.权利要求1-7中任一权利要求所述的含高能磷酸键的荧光染料在生物检测与标记中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其特征在于所述的生物检测与标记目标物为细胞或组织中的三磷酸腺苷酶。

说明书

技术领域

本发明涉及一类含高能磷酸键的荧光染料、其制备方法，以及利用该类荧光染料对活细胞或组织中三磷酸腺苷酶的识别和定量、动态可视化检测。

背景技术

三磷酸腺苷酶(AdenosineTriphosphatase)即ATP酶，主要存在于细胞质膜和液泡膜中。该酶是一种可催化三磷酸腺苷(ATP)水解生成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子的一种生物活性辅酶。在这个催化水解过程中，ATP酶可使得生物体系释放出大量的能量(Annu.Rev.Biochem.1967,36:727-756)。此能量释放过程广泛存在于所有已知的生命形式中。ATP酶作为一种辅酶具有改善肌体代谢的作用，同时它可广泛参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸、核苷酸等代谢过程。在它催化水解过程中，释放的能量又是体内吸收、分泌、肌肉收缩以及进行生化合成反应等生命过程中所需能量的主要来源。因此，在心肌病、肝炎、进行性肌萎缩、神经性耳聋等疾病的治疗中，常将ATP酶作为研究对象。近些年来，因ATP酶具有广泛用于改善机体代谢功能，其常被看做是心脏病能量合剂中的重要成分之一。所以建立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的、特异性识别和定量、动态监测细胞或组织内的ATP酶以及可对其进行定量成像的技术或方法是一项重要的工作。

现有识别及检测ATP酶的方法种类很多，例如生物发光法、酶联免疫分析法、沉淀色素强度分析法等。但上述方法在实际活细胞或组织成像应用中存在很多缺陷，例如：无法实现活生物样品的检测、无法穿越细胞组织外膜、无法实时动态的监测等等。近些年，荧光染料结合不断发展的显微成像技术为消除上述缺陷提供了一种可行的重要显微监测工具，以荧光染料作为核心的光学分子成像技术为ATP酶的相关基础研究提供了一种潜在的可视化工具。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等荧光染料都已经成为荧光染料研究的核心对象分子。然而，这些染料在ATP酶活性的实时动态监测时具有一些无法改变的缺点。比如：菲啶染料类中的溴化乙锭(EB)作为荧光染料具有很好的光学性质，但其具有较高的生物致癌性。更重要的是，这些传统的荧光染料在荧光稳定性、近红外定靶激发、高分辨率的暗场成像、生物样品的自发荧光干扰等方面具有很大的缺陷(Nature,1999,2:989-996.；Science,1997,275:530.；AngewandteChemieInternationalEdition,2001,40:2098.)。因此，设计合成并制备低/无毒性、高膜通透性、高选择性识别和定量、实时动态监测活生物样品(细胞或组织)中的ATP酶活性的荧光染料仍然存在巨大挑战。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一类含高能磷酸键的荧光染料，具有通式I的结构：

通式I中：

所述的M选自：

上述基团的结构式中，“---”用以表示该基团与化合物其它部分连接的游离键。

本发明另一方面的目的在于提供上述含高能磷酸键的荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

1)H-M-Br与R₃-H按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R₃-M-Br；

反应温度为0-200℃，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；

2)化合物R₃-M-Br与化合物H-L-H按摩尔比1:1-1:15反应，制备化合物R₃-M-L-H：

反应温度0-180℃，反应时间1-36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；

3)化合物R₃-M-L-H与化合物B按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物I：

上述关于本发明的含高能磷酸键荧光染料的制备方法的描述中，各个取代基的定义，即对R₁、R₂、R₃、L、和M的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。

本发明所述的含高能磷酸键荧光染料可以近红外定靶激发，在细胞和组织内对三磷酸腺苷酶有强的荧光响应信号，可用于特异专一性的比例标记和定量、实时动态检测活细胞活组织中三磷酸腺苷酶活性的小分子荧光染料。并且这类荧光染料具有良好的水溶性，以及优秀的细胞膜通透性。同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异，可以避免生物自发荧光的产生。

因此，本发明再一方面的目的在于提供上述含高能磷酸键荧光染料在生物检测与标记中的应用。尤其优选应用于目标物为活细胞或肿瘤组织中的三磷酸腺苷酶活动的实时动态监测与标记。

附图说明

本发明附图14幅：

图1是本发明的含高能磷酸键的荧光染料的结构通式I。

图2是化合物A₁的水溶性检测试验结果。

图3是化合物A₁活细胞内成像试验的测定结果。

图4是化合物A₁在活细胞内对三磷酸腺苷酶比例识别成像结果。

图5是化合物A₁在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验结果。

图6是化合物A₂对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别试验结果。

图7是荧光染料化合物A₂在水溶液中对光的稳定性的检测试验结果。

图8是化合物A₂在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验结果。

图9是化合物A₃对活细胞中线粒体共定位成像结果。

图10是化合物A₃在水溶液中对三磷酸腺苷酶的检测试验结果。

图11是化合物A₃对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别试验结果。

图12是化合物A₄对活细胞的细胞毒性测试结果。

图13是化合物A₄的水溶解性表征结果。

图14是化合物A₄对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别试验结果。

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基、支链烷基和环烷基。如提及具体烷基名称，如“丙基”、“异丙基”或“环丙基”，特指具体碳原子数目的直连烷基、支链烷基和环烷基。如概括形式的描述，如“C_1-8烷基”，则包括碳原子数满足要求的所有基团，“C_1-8烷基”包括但不限于C_1-6烷基、C_1-5烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环丁基、甲基环丙基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本发明首先提供一类含高能磷酸键的荧光染料，具有通式I的结构：

通式I中：R₁、R₂和R₃为不同取代基；M为荧光团；L为连接臂。

优选的实施方式中，所述的R₁和R₂各自独立地选自：-OP(O)(CH₂)_nCH₃、-OP(O)(CH₂)_nOH、-OP(O)(CH₂)_nNH₂、-OP(O)(CH₂)_nNHCH₃、-OP(O)(CH₂)_nN(CH₃)₂、-OP(O)(CH₂)_nP(O)CH₃、-OP(O)(CH₂)_nP(O)OH、-OP(O)(CH₂)_nP(O)NH₂、-OP(O)(CH₂)_nP(O)NHCH₃、-OP(O)(CH₂)_nP(O)N(CH₃)₂、HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n、-OH或-H。

更为优选地，所述的R₁和R₂各自独立地选自HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n、HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、-OP(O)(CH₂)_nP(O)OH、-OP(O)(CH₂)_nOH、-OH。

进一步优选的实施方式中，所述的R₁和R₂各自独立地选自HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n和CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n。

再进一步的优选实施方式中，所述的R₁和R₂各自独立地选自HO[P(O)(OH)O-]_n或HO[P(O)(CH₃)O-]_n。

上述对取代基R₁和R₂的描述中，所述及的P(O)代表磷氧双键，HO[P(O)(OH)O-]_n、HO[P(O)(CH₃)O-]_n、CH₃[P(O)(CH₃)O-]_n分别表示为式i、ii和iii:

上述对取代基R₁和R₂的描述中，n是1-8的整数，优选1-4的整数。

上述通式I中，R₃选自：C_p烷基、-CN、-(CH₂)_pOH、-(CH₂)_pOCH₃、-(CH₂)_pO(CH₂)_qOH、-NH(CH₂)_pCH₃、-NH(CH₂)_pNH₂、-(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-NH(CH₂)_pO(CH₂)_qCH₃、-(CH₂)_pNH₂、-NH(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-N(CH₃)(CH₂)_pCH₃或-(CH₂)_pN(CH₃)(CH₂)_qCH₃；优选所述的R₃选自C_p烷基、-CN、-(CH₂)_pOH、-(CH₂)_pOCH₃、-NH(CH₂)_pCH₃、-NH(CH₂)_pNH₂、-NH(CH₂)_pO(CH₂)_qCH₃、-(CH₂)_pNH₂、-NH(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-N(CH₃)(CH₂)_pCH₃或-(CH₂)_pN(CH₃)(CH₂)_qCH₃；更优选所述的R₃选自C_p烷基、-CN、-NH(CH₂)_pCH₃、-NH(CH₂)_pO(CH₂)_qCH₃、-NH(CH₂)_pNH(CH₂)_qCH₃、-N(CH₃)(CH₂)_pCH₃；最为优选的，所述的R₃优选C_p烷基和-CN。

上述对取代基R₃的描述中，p和q各自分别选自1-8的整数，优选各自独立地选自1-4的整数。

上述通式I中，所述的L选自：C_x烷基、-O(CH₂)_x-、-(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_y-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yO-、-NH(CH₂)_x-、-(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNHC(O)-、-NH(CH₂)_xC(O)NH-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_y-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH-、-O(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-、-NH(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-或-O(CH₂)_xNH(CH₂)_yO-；优选所述的L选自C_x烷基、-O(CH₂)_x-、-(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_y-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yO-、-NH(CH₂)_x-、-(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNH-、-NH(CH2)_xNHC(O)-、-NH(CH₂)_xC(O)NH-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_y-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH-、-O(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xO-、-O(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-、-NH(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-或-O(CH₂)_xNH(CH₂)_yO-；更为优选的，所述的L选自-NH(CH₂)_xNH-、-NH(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH-、-NH(CH₂)_xO(CH₂)_yNH-或-NH(CH₂)_xC(O)NH-、。所述的L尤其优选-NH(CH₂)_xNH-或-NH(CH₂)_xC(O)NH-。

上述对L的描述中，所述的x和y各自独立地选自1-8的整数；优选1-4的整数。

上述通式I中，所述的M选自：

优选的技术方案中，M选自M₁、M₂、M₃或M₅

最为优选地，所述的M选自M₂或M₅。

以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于本发明所述及的范围。

优选技术特征的组合之实例，为本发明具体的实施方案是之一，所述的高能磷酸键的荧光染料，选自化合物A₁-A₄：

另一方面，本发明提供了上述本发明含高能磷酸键的荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

1)H-M-Br与R₃-H按摩尔比1:1-1:5反应，制备化合物R₃-M-Br；

反应温度为0-200℃，反应时间为1-24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；

具体实施方式中，所述步骤1)的反应温度优选25-180℃，更优选50-180℃，最优选60-150℃；所述的反应时间优选1-23小时，更优选1-22小时，最优选1-20小时；所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，最优选乙醇、甲醇、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；

2)化合物R₃-M-Br与化合物H-L-H按摩尔比1:1-1:15反应，制备化合物R₃-M-L-H：

反应温度0-180℃，反应时间1-36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；

具体实施方式中，所述步骤2)的反应温度优选30-180℃，更优选30-160℃，最优选30-140℃；所述的反应时间优选1-30小时，更优选1-28小时，最优选2-24小时；所述的反应溶剂优选乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物，更优选乙醇、甲醇、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物，最优选乙醇、乙酸乙酯、醋酸、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚或其混合物；化合物R₃-M-Br与化合物H-L-H进行反应优选摩尔比1:1-1:4.5，更优选1:1-1:4，最优选1:2-1:4。

3)化合物R₃-M-L-H与化合物B按照摩尔比1:1-1:6反应，制备化合物I：

具体实施方式中，所述步骤3)的反应温度优选30-160℃，更优选30-150℃，最优选30-140℃；所述的反应时间优选1-14小时，更优选4-13小时，最优选5-12小时；所述的反应溶剂优选乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物，更优选乙醇、丙三醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、水、醋酸或其混合物，最优选乙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、醋酸或其混合物；R₃-M-L-H与化合物B进行反应优选摩尔比1:1-1:5.5，更优选1:1-1:5，最优选1:1-1:4.5。

对本发明采用上述方法合成的含高能磷酸键的荧光染料化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构。

本发明所述的含高能磷酸键的荧光染料具备以下优点：

所述染料化合物引入了与三磷酸腺苷酶特异性结合位点，提高了染料对活细胞和组织中三磷酸腺苷酶检测和识别的专一性、特异性。

所述染料化合物具有优异的光学性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性。

所述染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化。

鉴于此，本发明所述的荧光染料可用于活细胞中三磷酸腺苷酶的标记。除了以本文中所述的形式直接用于活细胞中三磷酸腺苷酶的标记，含有本发明的荧光染料化合物的组合物也可以用于活细胞中三磷酸腺苷酶的标记和实时动态监测。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。

本发明还提供使用上述本发明的荧光染料化合物标记和动态实时监测活细胞中三磷酸腺苷酶的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

制备荧光染料化合物A₁，采用如下合成路线：

(1)化合物1-2的合成

将20mmol化合物1-1和30mmolα-氨基丙酸加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应16h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得紫色固体粉末粗产品，化合物1-2，收率93％。

(2)化合物A₁的合成

将20mmol化合物1-2和120mmol化合物B加入到含有20mmolEDCl及少量DMAP20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应12h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得深红色固体粉末化合物A₁，收率42％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.11(m,6H),7.87-7.89(m,2H),7.75(s,1H),7.73(s,1H),7.47(s,1H),7.40(s,1H),6.65(s，1H),6.03(s,1H),4.53(s,1H),4.23-4.02(m,3H),3.89(s,1H),3.71-3.69(s,2H),3.31(m,2H),2.42(m,2H).

实施例2

荧光染料化合物A₁的水溶性检测试验

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₁加入到水中，测定在不同浓度(0.6，2.0,2.7,3.3,5.0,6.6,9.0μM)A₁水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果为图2，结果显示：当化合物A₁浓度为9.0μM时，吸光度值未发生偏移，即荧光染料化合物A₁在水中的溶解度为9.0μM。图2为不同探针A₁浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent8453紫外分光光度计。

实施例3

荧光染料化合物A₁活细胞内成像试验

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₁，以终浓度为10.0μM的A₁分别孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40×)观察，重复三次。实验结果表明：荧光染料化合物A₁在HepG2细胞胞质中的有强荧光信号。图3的荧光采集波段为560-650nm。

实施例4

荧光染料化合物A₁在活细胞内对三磷酸腺苷酶比例识别成像的试验

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₁，以终浓度为10.0μM的A₁孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育30分钟。实验组内再加入ATP酶抑制剂孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40×)观察，重复三次。荧光采集波段为550-580nm和585-620nm。激发波长为515nm。

实验结果如图4所示，表明：荧光染料化合物A₁对照组HepG2细胞胞质中在585-620nm(对照组图4a)处有明显而且强荧光信号，而在550-580nm处基本没有荧光信号(对照组图4b)。当实验组内加入三磷酸腺苷酶抑制剂后，三磷酸腺苷酶含量减少，荧光染料化合物A₁在585-620nm(实验组图4c)处的荧光信号明显减弱，而在550-580nm处的荧光明显减弱(实验组图4d)。因此，550-580nm处荧光强度与585-620nm的荧光强度比例值逐渐降低。此实验结果表明荧光染料化合物A₁在活细胞内可对三磷酸腺苷酶进行比例识别成像。

实施例5

荧光染料化合物A₁在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验

使用上述实施例中合成的荧光染料化合物A₁加入到水中，对不同浓度三磷酸腺苷酶的识别。测试结果如图5所示，显示：当化合物A₁浓度为5.0μM时，随着三磷酸腺苷酶的增加，化合物A₁的荧光在540nm的强度逐渐减弱。下图为不同浓度三磷酸腺苷酶作用下A₁荧光光谱变化。

实施例6

制备探针化合物A₂：

(1)化合物2-2的合成

将20mmol化合物1-1和30mmol溴乙胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应3h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得紫色固体粉末粗产品，化合物2-2，收率87％。

(2)化合物A₂的合成

将20mmol化合物2-2和120mmol化合物B加入到含有20mmolEDCl及少量DMAP20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应16h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得紫色固体粉末化合物A₂，收率53％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.14(m,6H),7.87-7.89(m,2H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),7.49(s,1H),7.39(s,1H),6.66(s，1H),6.05(s,1H),4.54(s,1H),4.23-4.02(m,3H),3.89(s,1H),3.29(m,4H),2.42(m,2H).

实施例7

荧光染料化合物A₂对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₂，以终浓度为10.0μM的A₂分别孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育30分钟。然后，加入三磷酸腺苷酶抑制剂，孵育1h，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40×)观察，重复三次。实验结果如图6所示，表明：荧光染料化合物A₂在HepG2细胞中随着三磷酸腺苷酶抑制剂孵育时间增长，其荧光信号减弱。图6中：(a)为对照组，未加入三磷酸腺苷酶抑制剂；(b)为实验组，加入100.0μM的三磷酸腺苷酶抑制剂；图6的荧光采集波段为560-650nm。

实施例8

荧光染料化合物A₂在水溶液中对光的稳定性的检测试验

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₂加入到水中，测定在其在不同时间(5.0、10.0和15min，以及7.0h)下的A₂荧光光谱变化。测试结果为图7，结果显示：当化合物A₂浓度为5.0μM时，随着照射时间的逐渐延长，化合物A₂的荧光强度在560-650nm保持不变，时间可持续7.0h。图7为其在不同时间下的A₂荧光强度变化。所用仪器分别是Agilent荧光分光光度计。

实施例9

荧光染料化合物A₂在水溶液中对三磷酸腺苷酶的识别试验

使用上述实施例中合成的荧光染料化合物A₂加入到水中，对不同浓度(2.0，4.0，6.0，8.0and10.0μM)三磷酸腺苷酶的识别。测试结果如图8，显示：当化合物A₂浓度为5.0μM时，随着三磷酸腺苷酶的增加，化合物A₂的荧光在540nm的强度逐渐减弱。下图为不同浓度三磷酸腺苷酶作用下A₂荧光光谱变化。

实施例10

制备荧光染料化合物A₃

(1)化合物3-1的合成

将20mmol4-溴-1，8-萘酐和25mmol丁胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应10h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物3-1，收率92％。

(2)化合物3-2的合成

将20mmol化合物3-1和200mmol溴乙胺加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热回流持续反应12h后停止。混合物倒入冰水中，沉淀析出，抽滤得黄色固体粉末粗产品，化合物3-2，收率87％。

(3)荧光染料化合物A₃的合成

将20mmol化合物3-2和120mmol化合物B加入到含有20mmolEDCl及少量DMAP20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热125℃回流持续反应16h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得紫色固体粉末化合物A₃，收率33％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.14(m,6H),7.87-7.89(m,2H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),7.54(s,1H),7.50(s,1H),7.49(s,1H),7.39(s,1H),6.66(s，1H),6.05(s,1H),4.54(s,1H),4.23-4.02(m,3H),3.89(s,1H),3.29(m,4H),2.42(m,2H),1.13-1.02(m,7H).

实施例11

荧光染料化合物A₃对活细胞中线粒体共定位成像

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₃，以终浓度为10.0μM的A₃分别孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40×)观察，重复三次。通过数据分析，得出图9的散点分析结果。如图9所示，结果显示：荧光染料化合物A₃在HepG2细胞中线粒体有强荧光信号。

实施例12

荧光染料化合物A₃在水溶液中对三磷酸腺苷酶的检测试验

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₃加入到水中，测定在不同浓度(2.0，4.0，6.0，8.0and10.0μM)三磷酸腺苷酶作用下A₃紫外光谱变化。测试结果为图10，结果显示：当化合物A₃浓度为5.0μM时，随着三磷酸腺苷酶的增加，化合物A₃的紫外强度逐渐减弱。图10为不同浓度三磷酸腺苷酶作用下A₃紫外光谱变化。所用仪器分别是Agilent8453紫外分光光度计。

实施例13

荧光染料化合物A₃对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₃，以终浓度为10.0μM的A₃孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育30分钟。实验组内再加入三磷酸腺苷酶抑制剂孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40×)观察，重复三次。荧光采集波段为550-580nm和585-620nm。激发波长为515nm。

实验结果如图11所示，表明：荧光染料化合物A₃对照组HepG2细胞胞质中在585-620nm(对照组图11a)处有明显而且强荧光信号，而在550-580nm处基本没有荧光信号(对照组图11b)。当实验组内加入三磷酸腺苷酶抑制剂后，三磷酸腺苷酶含量减少，荧光染料化合物A₃在585-620nm(实验组图11c)处的荧光信号明显减弱，而在550-580nm处的荧光明显减弱(实验组图11d)。因此，550-580nm处荧光强度与585-620nm的荧光强度比例值逐渐降低。此实验结果表明荧光染料化合物A₃在活细胞内可对三磷酸腺苷酶进行比例识别成像。

实施例14

制备荧光染料化合物A₄

(1)荧光染料化合物A₄的合成

将20mmol化合物3-2和120mmol化合物B加入到含有20mmolEDCl及少量DMAP20ml乙酸乙酯溶液的圆底烧瓶中，氮气保护。反应加热120℃回流持续反应14h后停止。减压蒸出溶剂，柱色谱分离得紫色固体粉末化合物A₃，收率33％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.14(m,3H),7.87-7.89(m,2H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),7.54(s,1H),7.50(s,1H),7.49(s,1H),7.39(s,1H),6.66(s，1H),6.05(s,1H),4.54(s,1H),4.23-4.02(m,3H),3.89(s,1H),3.29(m,4H),2.42(m,2H),1.43-1.39(m,9H),1.13-1.02(m,7H).

实施例15

荧光染料化合物A₄对活细胞的细胞毒性

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₄，以不同终浓度(3.0和10μM)的A₄分别孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育24h。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入MTT用酶标仪测定，重复三次。测试结果如图12所示，显示：不同浓度的荧光染料化合物A₄孵育对HepG2细胞24小时之后，仍有90％细胞存活。

实施例16

荧光染料化合物A₄的水溶解性检测试验

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₄加入到水中，测定在不同浓度(2.0，4.0，6.0，8.0and10.0μM)荧光染料化合物A₄水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果如图13所示，显示当荧光染料化合物A₂浓度为6.0μM时，吸光度值未发生偏移，即化合物A₄在水中的溶解度为6.0μM。所用仪器分别是Agilent8453紫外分光光度计。

实施例17

荧光染料化合物A₄对活细胞中三磷酸腺苷酶的识别

使用上述实施例合成的荧光染料化合物A₄，以终浓度为10.0μM的A₄孵育HepG2细胞，在37℃，5％CO₂孵育30分钟。实验组内再加入三磷酸腺苷酶抑制剂孵育30分钟。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦成像。选取代表性区域，用干镜(40×)观察，重复三次。荧光采集波段为550-580nm和585-620nm。激发波长为515nm。

实验结果如图14所示，表明：荧光染料化合物A₄对照组HepG2细胞胞质中在585-620nm(对照组图14a)处有明显而且强荧光信号，而在550-580nm处基本没有荧光信号(对照组图14b)。当实验组内加入三磷酸腺苷酶抑制剂后，三磷酸腺苷酶含量减少，荧光染料化合物A₄在585-620nm(实验组图14c)处的荧光信号明显减弱，而在550-580nm处的荧光明显减弱(实验组图14d)。因此，550-580nm处荧光强度与585-620nm的荧光强度比例值逐渐降低。此实验结果表明荧光染料化合物A₄在活细胞内可对三磷酸腺苷酶进行比例识别成像。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

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