专利摘要

本发明提出了一种利用PVA－卡拉胶－海藻酸复合载体固定化微生物的新方法。PVA、卡拉胶和海藻酸的含量分别为50～100g/L，2～10g/L和2～20g/L，固定化颗粒中微生物的含量为每克固定化颗粒含有0.1～0.5g菌体，交联剂溶液的成分为硼酸饱和，KCl为10～50g/L，CaCl2为5.0～25g/L。利用注射器或滴管将固定化载体与微生物菌体的混合液滴加到交联剂溶液中，可以形成直径约2mm的球形颗粒，在其中浸泡2～10h使其充分反应，然后将固定化微生物颗粒取出，用生理盐水洗涤，即得到的固定化微生物颗粒。该方法制备的固定化微生物颗粒具有良好的生物活性、化学稳定性合机械稳定性，可用于废水处理、生物检测及食品发酵等领域。

权利要求

1.一种改进PVA固定化微生物的新方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取PVA、卡拉胶和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静置冷却至40～50℃，得到PVA-卡拉胶-海藻酸混合溶液，其中PVA、卡拉胶和海藻酸的含量分别为50～100g/L，2～10g/L和2～20g/L；

(2)将欲固定化的微生物与上述制备的PVA-卡拉胶-海藻酸混合液混合，调节固定化微生物的量为每克固定化细胞颗粒含有0.1～0.5g固定化微生物菌体；

(3)称取硼酸、KCl和CaCl₂，溶解于蒸馏水，使其最终浓度分别为：硼酸饱和，KCl为10～50g/L，CaCl₂为5～25g/L，制备得到交联剂溶液；

(4)用注射器或滴管将步骤(2)制备的混合液滴加到步骤(3)制备的交联剂溶液中，使其形成球形颗粒，并在其中浸泡2～10小时；

(5)将步骤(4)中制备得到的固定化微生物颗粒取出，用生理盐水洗涤，放入冰箱于4℃下保藏，完成整个固定化过程。

说明书

技术领域

本发明涉及到一种利用PVA-卡拉胶-海藻酸复合载体固定化微生物的新方法，属于微生物科学技术领域。

背景技术

固定化技术是使生物催化剂(酶、微生物细胞、动植物细胞、细胞器等)更广泛、更有效应用的一种手段。微生物固定化技术是生物工程领域中的一项新兴技术，广泛应用于医药、食品、化工和环境保护等领域。

微生物细胞的固定化方法有：吸附法、交联法和包埋法。其中以包埋法最为常用，包埋材料可分为天然高分子多糖类和合成高分子化合物。作为包埋载体，天然高分子多糖类的海藻酸钠和卡拉胶应用最多，它们具有固化、成形方便，对微生物毒性小，固定化微生物密度高等优点。但它们抗微生物分解性能较差，机械强度较低。天然卡拉胶中含有λ-卡拉胶，它使凝胶强度降低，除去λ-卡拉胶所需的费用较高，而且凝胶对钠离子比较敏感。海藻酸钙凝胶在磷酸盐溶液中不稳定。这两种载体的凝胶虽然可用交联剂进行稳定化处理，但活力和传质性能又会下降。

海藻酸和卡拉胶作为天然高分子材料，以其安全、环保及优良的工艺性能，是固定化微生物常用的载体。何俊培等(包装与食品机械，2007，25(2)：25—28)利用海藻酸钠和卡拉胶固定化乳糖酶，研究了影响固定化酶的酶活回收率和固定化酶胶粒机械强度的因素。结果发现海藻酸钠浓度、卡拉胶浓度和固定化酶量等因素会影响固定化酶的性能，通过采用三因素二次回归旋转设计得到优化条件为：海藻酸钠浓度为2.0％、卡拉胶浓度为0.81％、乳糖酶的浓度0.23％。由此得到的固定化酶的酶活回收率可达89.19％，固定化酶胶粒的机械强度为74.74％。但颗粒的机械强度和抗微生物分解性有待进一步改善。

合成高分子化合物中常用的载体物质有聚丙烯酰胺、光硬化树脂等。它们的突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定。但是聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。适用于细胞固定化的光硬化树脂聚合物一般尚未商品化，且固定化的操作条件也较严格。

从目前的研究看，常用的固定化载体包括琼脂、海藻酸、卡拉胶、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺等。

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，简称PVA)是一种新型的微生物包埋固定化载体，其化学结构式如下：

聚乙烯醇在加热后溶于水，在其水溶液中加入添加剂后发生凝胶化，或在低温(-10℃)下冷冻形成凝胶，从而将微生物包埋固定在凝胶网络中。常用的添加剂有硼酸和硼砂，在聚乙烯醇水溶液中加入硼酸或硼砂，通过化学反应形成凝胶，其反应原理为：

PVA凝胶具有抗微生物分解性能强、价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料，近年来在国内外获得了较广泛的研究。

目前PVA固定化方法中存在的主要问题是：PVA是一种高粘性物质，与H₃BO₃反应较慢，成形能力较差，颗粒易黏附在一起。此外，硼酸上的三个羟基只部分地进行了反应，反应后形成的高分子凝胶上还残留有亲水性的—OH，使得固定化颗粒在实际应用中存在水溶膨胀性问题。也就是说，固定化微生物凝胶颗粒在使用过程中，随着使用时间的延长，其机械强度会因为凝胶颗粒的水溶膨胀性而大大减弱，甚至出现颗粒破碎的现象，缩短了其使用寿命，不利于实际应用。

因此，如何改善PVA凝胶颗粒的成形及水溶膨胀性，是促进PAV固定化微生物向实际应用迈进的关键。近年来，围绕这些问题，人们对完善PVA—H₃BO₃包埋固定化微生物进行了大量的工作，主要有：固定化颗粒成球性能的改进、机械强度的提高、减少固定化过程中的活性损失、调节固定化颗粒的比重、改善水力性能等。

干信等(湖北工业大学学报，2006，21(2)：24—27)利用PVA—卡拉胶混合胶体固定化酿酒酵母，制备出机械强度高、传质效果好的凝胶颗粒。最佳的固定化条件为：聚乙烯醇浓度8％、卡拉胶浓度0.5％、菌体添加量0.1g/mL、固定化时间24h。固定化小球能连续反应60h以上，腺苷三磷酸产量达297.1mg/L，可用作腺苷三磷酸再生体系。但固定化微生物颗粒的综合性能有待提高。

发明内容

本发明提出了一种综合利用PVA-卡拉胶-海藻酸复合载体固定化微生物的新方法，以改进PVA固定化微生物颗粒的性能。其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取PVA、卡拉胶和海藻酸钠并与水混合，水浴加热至完全溶化，然后静置冷却至40～50℃，得到PVA-卡拉胶-海藻酸混合溶液，其中PVA、卡拉胶和海藻酸的含量分别为50～100g/L，2～10g/L和2～20g/L；

(2)将欲固定化的微生物与上述制备的PVA-卡拉胶-海藻酸混合液混合，调节固定化微生物的量为每克固定化细胞颗粒含有0.1～0.5g固定化微生物菌体；

(3)称取硼酸、KCl和CaCl₂，溶解于蒸馏水，使其最终浓度分别为：硼酸饱和，KCl为10～50g/L，CaCl₂为5～25g/L，制备得到交联剂溶液；

(4)用注射器或滴管将步骤(2)制备的混合液滴加到步骤(3)制备的交联剂溶液中，使其形成球形颗粒，并在其中浸泡2～10小时；

(5)将步骤(4)中制备得到的固定化微生物颗粒取出，用生理盐水洗涤，放入冰箱于4℃下保藏，完成整个固定化过程。

本发明的有益效果为：本发明提出的利用PVA-卡拉胶-海藻酸复合载体固定化微生物的新方法，该方法制备的固定化微生物颗粒具有良好的生物活性和机械强度，并且可以根据实际需要，对三种载体的含量进行优化确定。

具体实施方式

本发明提供了一种改进PVA固定化微生物的新方法，下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。

实施例1

(1)称取5.0gPVA，0.5g卡拉胶，0.2g海藻酸钠，与75mL去离子水相混合，水浴加热至溶化，然后冷却至常温；

(2)接种假单胞菌(Pseudomonas sp.，购自中国科学院微生物研究所)进行培养，然后称取10g菌体(湿重)，悬浮于20mL浓度为0.9％的NaCl溶液中，制备成微生物悬浮液；

(3)将第(2)步制得的微生物悬浮液与第(1)步制得的溶液相混合；

(4)称取一定量的硼酸、KCl和CaCl₂，溶解于去离子水中，使其最终浓度分别为：硼酸饱和，KCl为10g/L，CaCl₂为10g/L，制备得到交联剂溶液；

(5)用0.40mm ID的注射器将(3)步中的混合液滴加到第(4)步制得的交联剂溶液中，使其形成2mm直径的球形颗粒，并在其中浸泡2h；

(6)取出微生物颗粒，用生理盐水洗涤。

利用该固定化微生物颗粒进行苯酚降解试验时取得了较好的效果，连续使用50批次，固定化颗粒的微生物活性和机械强度均保持良好。

实施例2

(1)称取10.0gPVA，0.5g卡拉胶，0.2g海藻酸钠与75mL去离子水相混合，水浴加热至溶化，冷却至45℃左右；

(2)称取10g活性污泥菌体(湿重，取自北京市高碑店污水处理厂)，悬浮于20mL去离子水中，制备成微生物悬浮液；

(3)将第(2)步制得的微生物悬浮液与第(1)步制得的混合溶液相混合；

(4)称取硼酸、KCl和CaCl₂，溶解于去离子水中，使其最终浓度分别为：硼酸饱和，KCl为4.0％，CaCl₂为2.0％(w/v)，制备得到交联剂溶液；

(5)用0.40mm ID的注射器将(3)步中的混合液滴加到第(4)步制得的交联剂溶液中，使其形成直径约2mm的球形颗粒，并在其中浸泡5h；

(6)取出固定化微生物颗粒，生理盐水洗涤，记为样品1。

分别称取0.5g、1.0g、1.5g和2.0g海藻酸钠，其他材料比例相同，并采用相同的制备方法和条件，制备得到样品2、样品3、样品4、样品5。

利用这种固定化活性污泥颗粒作为BOD生物传感器快速测定仪(专利号：ZL00132125.0)的生物敏感元件。下面以50mg/L的BOD标准溶液为例，给出了测量值及结果分析。

表1 50mg/L的BOD标准溶液的测量值及结果分析

结果表明，固定化活性污泥颗粒的生物活性良好，满足了测定要求，并且该颗粒机械强度较好，连续使用3个月未出现颗粒破碎现象。

实施例3

(1)称取5.0gPVA，0.5g海藻酸钠与75mL去离子水相混合，水浴加热至溶化，然后冷却至常温；

(2)接种酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae，购自中国科学院微生物研究所)进行培养，离心收集菌体；

(3)称取10g菌体(湿重)，悬浮于20mL生理盐水中，制备成微生物悬浮液；

(4)将第(3)步制得的微生物悬浮液与第(1)步制得的溶液相混合；

(5)称取一定量的硼酸、KCl和CaCl₂，溶解于去离子水中，使其最终浓度分别为：硼酸饱和，KCl为10g/L，CaCl₂为25g/L，制备得到交联剂溶液；

(6)用滴管将(4)步中的混合液滴加到第(5)步制得的交联剂溶液中，使其形成约2mm直径的球形颗粒，并在其中浸泡10h；

(7)取出固定化微生物颗粒，用生理盐水洗涤，记为样品1。

分别称取0.5g、1.0g、1.5g、2.0g和2.5g卡拉胶，加入到步骤(1)制备的混合溶液中，其他材料比例相同，并采用相同的制备方法和条件，制备得到样品2、样品3、样品4、样品5和样品6。

测定上述固定化微生物颗粒的抗压强度，结果如表2所示。

表2 卡拉胶浓度对固定化微生物颗粒抗压强度的影响

一种改进PVA固定化微生物的新方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。