专利摘要

本发明涉及萜类化合物技术领域，提供了一种抗炎活性化合物peniroquesineA，其结构如式I所示。该化合物属于二倍半萜类化合物，具有显著的抗炎活性。本发明提供的抗炎活性化合物peniroquesineA是一种具有新颖的5/6/5/6/5五环系新骨架结构的二倍半萜类化合物，丰富了二倍半萜类化合物的多样性。本发明还提供了一种所述抗炎活性化合物peniroquesineA的制备方法，由娄地青霉发酵制备得到，该方法简单、快速、成本低，适宜大规模工业化生产。

权利要求

1.一种抗炎活性化合物peniroquesineA，具有式I所示的结构：

2.权利要求1所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，包括以下步骤：

(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物；

所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；

(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇混合后超声提取，得到peniroquesineA粗提物；

(3)将peniroquesine A粗提物经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesineA。

3.根据权利要求2所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养基的制作原料中含有马铃薯或大米，所述发酵方式为固体发酵。

4.根据权利要求2或3所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵温度为20～28℃，发酵时间为25～32d。

5.根据权利要求2或3所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，娄地青霉发酵物与醇的质量体积比为(30～80)g:(50～150)mL。

6.根据权利要求2或3所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述色谱纯化为：

以体积比为100:0～20:1的氯仿-甲醇溶液为洗脱溶剂，硅胶柱色谱洗脱所述步骤(2)得到的peniroquesineA粗提物，得到的洗脱液再经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesineA。

7.根据权利要求6所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱色谱洗脱为：

用氯仿-甲醇溶液将所述粗提物溶解，得到粗提物溶液；

将所述粗提物溶液与粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分；

取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1～80:1的石油醚-丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到洗脱液。

8.根据权利要求6所述抗炎化合物peniroquesineA的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中凝胶柱色谱纯化以甲醇为溶剂。

9.权利要求1所述的抗炎化合物peniroquesineA或权利要求2～8任意一项所述制备方法得到的抗炎化合物peniroquesineA在制备抗炎药物中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及萜类化合物技术领域，特别涉及一种抗炎活性化合物peniroquesineA及其制备方法和应用。

背景技术

萜类化合物(terpenes)——分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧衍生物，是具有高度多样性的一大类天然产物，包括单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜等等。许多萜类衍生物已被发展为治疗癌症、细菌感染、疟疾和其他各种人类疾病的重要药物，因此萜类的合成就显得非常的重要。但由于生源合成途径仍未完全阐明、萜类化合物具有非模块化的结构、没有普适的统一的合成策略等因素，因而萜类化合物的来源途径依赖于天然产物的提取。

二倍半萜类化合物(sesterterpenes)大部分属于海洋中各种海绵和藻类植物及其内生真菌的次级代谢产物，在陆生植物中极为罕见，以往的研究发现有极少数的微生物能够产生此类化合物。据文献报道，二倍半萜类化合物具有抗炎、抗细胞毒、抗肿瘤以及抗菌等多种生物活性。

由于从海洋生物中提取二倍半萜化合物的成本高、周期长，使得二倍半萜类化合物的抗炎活性难以被充分利用，为了进一步推广二倍半萜化合物，提供一种新的抗炎策略，对解决目前抗生素滥用的现状具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以通过微生物发酵得到的、新的二倍半萜类化合物。

本发明提供了一种抗炎活性化合物peniroquesine A，具有式I所示的结构：

本发明还提供了上述技术方案所述抗炎化合物peniroquesine A的制备方法，包括以下步骤：

(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物；

所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；

(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇混合后超声提取，得到peniroquesine A粗提物；

(3)将peniroquesine A粗提物经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesineA。

优选的，所述步骤(1)中发酵培养基的制作原料中含有马铃薯或大米，所述发酵方式为固体发酵。

优选的，所述步骤(1)中的发酵温度为20～28℃，发酵时间为25～32d。

优选的，所述步骤(2)中，娄地青霉发酵物与醇的质量体积比为(30～80)g:(50～150)mL。

优选的，步骤(3)所述纯化peniroquesine A粗提物的步骤为：

以体积比为100:0～20:1的氯仿-甲醇溶液为洗脱溶剂，硅胶柱色谱洗脱步骤(2)得到的peniroquesine A粗提物，洗脱液经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesineA。

优选的，所述步骤(3)中对粗提物进行硅胶柱色谱洗脱的步骤为：

用氯仿-甲醇溶液将所述粗提物溶解，得到粗提物溶液；将所述粗提物溶液与粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分；

取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱分，以体积比200:1～80:1的石油醚:丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到洗脱液。

优选的，所述步骤(3)中凝胶柱色谱纯化以甲醇为溶剂。

本发明还提供了前述技术方案所述的抗炎化合物peniroquesineApeniroquesine A或上述技术方案所述制备方法得到的抗炎化合物peniroquesine A在制备抗炎药物中应用。

本发明提供的抗炎活性化合物peniroquesine A属于二倍半萜类化合物，其结构如式I所示。本发明提供的抗炎活性化合物peniroquesine A是一种具有新颖的5/6/5/6/5五环系新骨架结构的二倍半萜类化合物，丰富了二倍半萜类化合物的多样性。同时，抗炎活性化合物peniroquesine A具有显著的抗炎活性，抗炎活性化合物peniroquesine A的NO(一氧化氮)抑制活性筛选试验表明，抗炎活性化合物peniroquesine A对NO的生成表现出了明显的抑制活性，其半数抑制浓度(IC₅₀值)为20.69±1.61μM，而阳性对照L-NMMA(总NOS抑制剂)的半数抑制浓度(IC₅₀值)为32.88±2.59μM。

本发明提供的抗炎活性化合物peniroquesine A为娄地青霉的代谢产物，可以通过微生物发酵制备得到，制备方法周期短、培养条件温和、副产物少、立体选择性强、成本低。本发明提供的抗炎活性化合物peniroquesine A制备方法简单易行，易于实现工业化，不仅符合现代环保和低碳经济的需求，还能够为二倍半萜类化合物的量产提供新途径。

本发明提供的抗炎活性化合物peniroquesine A能够应用于制备抗炎药物，为开发抗炎药物提供新的选择。

生物保藏说明：

娄地青霉(Penicillium roqueforti)，于2017年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；生物保藏编号为CGMCC No.14140。

附图说明

图1为本发明所述抗炎活性化合物peniroquesine A的HR-ESI-MS谱；

图2为本发明所述抗炎活性化合物peniroquesine A的HR-ESI-MS谱检测结果；

图3为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的¹H-NMR谱；

图4为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的¹³C-NMR和DEPT谱；

图5为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的HMBC谱；

图6为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的HSQC谱；

图7为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的¹H-¹H COSY谱。

具体实施方式

本发明提供了一种抗炎活性化合物peniroquesine A，具有式I所示的结构：

式I所示的抗炎活性化合物peniroquesine A是一种二倍半萜类化合物，具有一个新颖的5/6/5/6/5五环系新骨架结构。

所述抗炎活性化合物peniroquesine A分子式为C₂₅H₄₀O₂，如附图1所示的抗炎活性化合物peniroquesine A的HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)谱图，m/z 395.2923[M+Na]⁺。本发明通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS对抗炎活性化合物peniroquesine A结构进行鉴定，¹H、¹³C、HMBC、HSQC和¹H-¹H COSY核磁数据见附图3～7，可以确定其结构如式I所示，其化学名称为：

(1S,4R,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-hexamethyl-2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-hexadecahydro-1H-dicyclopenta[a,g]fluorene-4,10-diol；

即：(1S,4R,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-六甲基-2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-4,10-二醇。

本发明所述抗炎活性化合物peniroquesine A优选的由娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)发酵得到。

本发明还提供了上述技术方案所述抗炎化合物peniroquesine A的制备方法，包括以下步骤：

(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物；

所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；

(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇溶液混合后超声提取，得到peniroquesine A粗提物；

(3)将peniroquesine A粗提物经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesineA。

本发明将保藏编号为CGMCC NO.14140的娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物。所述发酵温度优选为20～28℃，更优选为25～27℃。在本发明中，所述发酵时间为25～32d，优选为30d。

本发明所述的娄地青霉(Penicillium roqueforti)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14140。该娄地青霉来源于黄草乌，是黄草乌(Aconitum vilmorinianum Kom.)的内生真菌，更具体来说所述娄地青霉从黄草乌根部分离得到。

在本发明中，所述发酵培养基的制作原料中优选的包括马铃薯或大米，更优选为以马铃薯为原料制作的发酵培养基。本发明所述发酵培养基能够使娄地青霉生长繁殖即可。

在本发明中，所述娄地青霉的发酵方式优选为固体发酵，娄地青霉在液体发酵中的代谢时间较长，本发明采用固体发酵方式能够缩短发酵时间。在本发明中，所述固体发酵温度为20～30℃，优选为26～28℃；所述固体发酵时间优选为25～35d，优选为28～30d。

得到所述娄地青霉发酵物后，本发明将娄地青霉发酵物与醇溶液混合后超声提取，过滤，取滤液并去除其中的溶剂，得到peniroquesine A粗提物。

在本发明中，娄地青霉发酵物与醇的质量体积比为(30～80)g:(50～150)mL，更优选为40～60g:80～120mL，最优选为50g:100mL。本发明所述的醇优选为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。本发明采用醇为溶剂将抗炎化合物peniroquesine A从娄地青霉发酵物中分离出来。

在本发明中，所述超声时间优选为20～40min，更优选为30min；所述超声功率优选为250W～350W，更优选为300W。

本发明优选的采用减压蒸馏的方式去除滤液中的溶剂；具体的，本发明将滤液减压浓缩至无醇味。所述减压浓缩的压力为10～15kPa，优选为13kPa；所述减压浓缩的温度为48～55℃，优选为50℃。

得到所述peniroquesine A粗提物后，本发明将peniroquesine A粗提物纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesine A。具体的，本发明以硅胶柱色谱洗脱peniroquesine A粗提物，洗脱液经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesine A。优选的，本发明采用凝胶柱色谱对洗脱液进行纯化。

本发明优选的采用梯度洗脱法洗脱peniroquesine A粗提物，所述洗脱剂优选为体积比100:0～20:1的氯仿-甲醇溶液。

具体的，本发明用氯仿-甲醇溶液将peniroquesine A粗提物溶解，与peniroquesine A粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分；取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1～80:1的石油醚:丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到洗脱液。化合物peniroquesine A主要集中于选取的洗脱部分。

在本发明中，所述去除溶剂的方法为减压蒸馏法；所述减压浓缩的温度为48～55℃，优选为50℃。

在本发明中，所述用于溶解peniroquesine A粗提物的氯仿-乙醇溶液为任意体积比的洗脱剂。本发明优选的采用200-300目硅胶进行洗脱。

本发明对所获得的100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分进行硅胶柱层析洗脱时，所述洗脱时的洗脱溶剂流速优选为2～4mL/min，更优选为3mL/min；所述洗脱溶剂优选为氯仿-甲醇体系或石油醚-丙酮体系，更优选为石油醚-丙酮体系。具体的，本发明采用硅胶柱层析对洗脱时，先用石油醚：丙酮(200:1)洗脱300mL以除去硅胶杂质，再用石油醚：丙酮(120:1)洗脱300mL以除去主点上方量较少的杂质，最后用石油醚：丙酮(80:1)洗脱约200mL目标化合物开始流出，继续用石油醚：丙酮(80:1)冲洗至目标化合物消失为止，将含目标化合物较纯的洗脱液合并。

得到所述洗脱液后，发明对所述洗脱液进行凝胶柱色谱纯化，得到抗炎化合物peniroquesine A。在本发明中，所述凝胶柱色谱优选为葡聚糖凝胶柱色谱。所述凝胶柱色谱纯化时的溶剂优选为甲醇。

经凝胶柱色谱纯化的溶剂优选为甲醇；本发明优选的采用葡聚糖凝胶柱对化合物进行纯化。所述甲醇流速优选为0.4～0.6mL/min，更优选为0.5mL/min。

本发明提供的抗炎化合物peniroquesine A具有显著的抗炎活性，能够应用于制备抗炎药物。所述药物中优选的包括质量百分数1～99％的抗炎化合物peniroquesine A，更优选为55～90％。本发明所述含有抗炎化合物peniroquesine A的药物中还可以包括药用辅料，选择本领域常规的制药辅料即可。所述含有抗炎化合物peniroquesine A的药物采用本领域熟知的制备方法制成片剂、颗粒剂、注射剂等剂型即可。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1制备抗炎化合物peniroquesine A

1、菌种活化：将娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)接种到PDA斜面培养基上，28℃恒温培养3～7d后，置于4℃冰箱中储存备用。

2、发酵培养基的制备：取洗净的土豆，分成直径1cm的土豆块置于组织培养瓶中，50g/瓶，组织培养瓶加盖后在120℃下高温灭菌30min，冷却，即得发酵培养基。

3、将步骤1活化的娄地青霉按照1％的接种量接种到步骤2制得的发酵培养基，加盖后在28℃下恒温培养30d，得到娄地青霉发酵物。

4、取50g步骤3得到的娄地青霉发酵物与100mL甲醇按照质量体积比混合，混合溶液在40kHz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压浓缩至无醇味，得到25.0gpeniroquesine A粗提物。

5、用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液30mL溶解25.0g的peniroquesine A粗提物，再与25.0g硅胶(200目)混合，减压浓缩去除溶剂，装柱；依次以体积比100:0，100:1，50:1，10:1，5:1的氯仿:甲醇进行梯度洗脱，合并各洗脱段得到5个部分：Fr1～Fr5，取其中Fr2部分(100:1的氯仿；甲醇)；Fr2部分经硅胶柱层析，先用石油醚：丙酮(体积比200:1)洗脱300mL以除去硅胶杂质，再用石油醚：丙酮(体积比120:1)洗脱300mL以除去主点上方量较少的杂质，最后用石油醚：丙酮(体积比80:1)洗脱约200mL目标化合物开始流出，继续用石油醚：丙酮(体积比80:1)冲洗至目标化合物消失为止，将含目标化合物较纯的洗脱液合并，即得含有peniroquesine A的洗脱液。以甲醇为溶剂，对洗脱液进行葡聚糖凝胶柱色谱纯化，干燥，得到1.2g抗炎化合物peniroquesine A。

实施例2结构的鉴定

取实施例1制备得到的抗炎化合物peniroquesine A，通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定得到的化合物peniroquesine A及其结构。

(1)peniroquesine A的HR-ESI-MS图谱见附图1，结果见附图2：

根据附图1和附图2所示可以看出该化合物的分子式为C₂₅H₄₀O₂(m/z:395.2923[M+Na]⁺,计算值：395.2926),不饱和度为6。

(2)1D/2DNMR检测的结果如附图3～7所示，

由附图3、4可以看出该化合物的¹H和¹³C NMR数据显示其含有一个双键(δ_H：5.57s,1H；δ_C：135.5d)，提示该化合物含有五个环。其¹³C NMR显示该化合物共有25个碳，包括6个CH₃(δ_C：14.0q,19.1q,21.0q,24.9q,30.6q,33.3q)，6个CH₂(δ_C：26.0t,31.0t,40.9t,42.7t,43.5t,45.5t)，8个CH(δ_C：40.0d,53.0d,54.6d,57.4d,58.7d,72.8d,75.0d,135.5d)和5个季碳(δ_C：43.7s,44.4s,48.3s,50.5s,147.9s)。

由HSQC谱(图6)可以得到化合物peniroquesine A的H和与之相连接的C的化学位移δ归属如表1：

表1化合物peniroquesine A的¹H NMR(600MHz)和¹³C NMR(150MHz)

由HMBC(图5)谱和¹H-¹H COSY谱(图7)中CH₃-20(δ_H 0.84s)与C-1(δ_C 40.0d)，C-2(δ_C 31.0t)和C-9(δ_C 48.3s)相关，CH₃-21(δ_H 0.95s)与C-1和C-9的相关表明CH₃-20与CH₃-21分别与C-1和C-9相连，¹H-¹H COSY谱中CH₃-20与H-1(δ_H 1.84s)，H-1与H-2(δ_H 1.39,d,J＝13.6Hz；1.97,d,J＝13.6Hz)，H-2与H-3(δ_H 1.89m)，H-3与H-4(δ_H 1.46m)，H-4与H-5(δ_H3.36m)，H-5与H-6(δ_H 0.91,d,J＝10.4Hz；2.19,d,J＝10.4Hz)，H-6与H-7(δ_H 2.40m)，H-7与H-12(δH 1.61s)，H-12与H-13(δ_H1.30,d,J＝2.0Hz)的相关确定了C₍₂₀₎-C₍₁₎-C₍₂₎-C₍₃₎-C₍₄₎-C₍₅₎-C₍₆₎-C₍₇₎-C₍₁₂₎-C₍₁₃₎的连接骨架。HMBC谱中CH₃-21与C-4(δ_C 57.4d)的相关确定了C₍₄₎-C₍₉₎键的存在，CH₃-21与C-8(δ_C 147.9s)的相关确定了C₍₈₎-C₍₉₎键的连接，H-7与C-8和C-10(δ_C 135.5d)同时存在HMBC相关表明C-7(δ_C 53.0d)与双键碳C-8相连，至此确定了peniroquesine A的A环和B环。HMBC谱中CH₃-22(δ_H 1.13s)与C-10，C-11(δ_C 50.5s)和C-12(δ_C 54.6d)的相关确定了C₍₁₀₎-C₍₁₁₎-C₍₁₂₎的结构连接片段，至此确定了peniroquesine A的C环。HMBC谱中CH₃-23(δ_H 1.18s)与C-14(δ_C 43.7s)和C-13(δ_C 58.7d)的相关,确定了C₍₁₃₎-C₍₁₄₎键的存在，CH₃-24(δ_H 0.98s)和CH₃-25(δ_H 0.92s)与C-19(δ_C 44.4s)和C-13(δ_C 58.7d)的相关确定了C₍₁₃₎-C₍₁₉₎键的连接。同样，CH₃-24和CH₃-25与C-18(δ_C 40.9t)的HMBC相关，CH₃-23与C-17(δ_C 42.7t)的HMBC相关，H-17(δ_H 1.58,d,J＝8.0Hz；1.70,m)与H-18(δ_H1.47m)的¹H-¹H COSY相关，确定了C₍₁₉₎-C₍₁₈₎-C₍₁₇₎-C₍₁₄₎的连接骨架，至此确定了peniroquesine A的F环。CH₃-23与C-15(δ_C 45.5t)的HMBC相关，CH₃-22与C-16(δ_C 75.0d)的HMBC相关，以及H-17与H-18的¹H-¹H COSY相关，表明存在C₍₁₁₎-C₍₁₆₎-C₍₁₅₎-C₍₁₄₎的结构片段，至此确定了peniroquesine A的E环,至此也确定了该化合物的结构。

综上所述，可以确定实施例1制备得到的化合物peniroquesine A结构式为：

实施例3化合物peniroquesine A的抗炎活性

一氧化氮(nitric oxide，NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。

(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(购自中科院上海细胞库)，用1μg/mL LPS进行诱导刺激，同时加入实施例1制备得到的化合物peniroquesine A处理，化合物peniroquesine A的终浓度依次为3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM和50μM五个梯度，每个梯度设置三个平行样，25℃条件下培养。

设置不含药物组和L-NMMA(总NOS抑制剂)阳性药物组按照上述相同步骤进行处理，作为对照。

(2)细胞过夜(10h)培养后，在570nm处检测各组的NO生成量；向过夜培养得到的培养液中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响。

NO生成抑制率(％)＝(不含药物组OD_570nm-药物组OD_570nm)/不含药物组OD_570nm×100％；

IC₅₀(半数抑制浓度)按Reed&Muench法计算，得到化合物peniroquesine A的NO抑制活性的IC₅₀为：20.69±1.61μM。

经计算可知，在对化合物peniroquesine A的NO抑制活性(阳性对照为：L-NMMA)筛选试验中，化合物peniroquesine A对一氧化氮(NO)的生成表现出了明显的抑制活性，其半数抑制率(IC₅₀值)为：20.69±1.61μM。而阳性对照L-NMMA对一氧化氮(NO)的半数抑制率(IC₅₀值)为：32.88±2.59μM。化合物peniroquesine A对一氧化氮(NO)的生成抑制率要明显强于阳性对照L-NMMA。因此，peniroquesine A具有作为先导化合物开发抗炎药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗炎化合物peniroquesine A的方法，不仅可以现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期该抗炎化合物工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。

实施例4

1、菌种活化：将娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)接种到PDA斜面培养基上，28℃恒温培养3～7d后，置于4℃冰箱中储存备用。

2、发酵培养基的制备：取50g大米浸泡在40mL水中12h，取出大米置于组织培养瓶中，50g/瓶，组织培养瓶加盖后在120℃下高温灭菌30min，冷却，即得发酵培养基。

3、将步骤1活化的娄地青霉按照1％的接种量接种到步骤2制得的发酵培养基，加盖后在26℃下恒温培养25d，得到娄地青霉发酵物。

4、取45g步骤3得到的娄地青霉发酵物与120mL甲醇按照质量体积比混合，混合溶液在40kHz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压浓缩至无醇味，得到peniroquesine A粗提物。

5、用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液30mL溶解25.0g的peniroquesine A粗提物，再与25.0g硅胶(300目)混合，减压浓缩去除溶剂，装柱；分别以体积比100:0，100:1，50:1，10:1，5:1的氯仿：甲醇进行梯度洗脱，合并各洗脱段得到5个部分：Fr1～Fr5，取其中Fr2部分(100:1的氯仿:甲醇)；Fr2部分经硅胶柱层析，先用石油醚：丙酮(体积比200:1)洗脱300mL以除去硅胶杂质，再用石油醚：丙酮(体积比120:1)洗脱300mL以除去主点上方量较少的杂质，最后用石油醚：丙酮(体积比80:1)洗脱约200mL目标化合物开始流出，继续用石油醚：丙酮(体积比80:1)冲洗至目标化合物消失为止，将含目标化合物较纯的洗脱液合并，即得含有peniroquesine A的洗脱液。以甲醇为溶剂，对洗脱液进行葡聚糖凝胶柱色谱纯化，干燥，得到抗炎化合物peniroquesine A。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种抗炎活性化合物peniroquesineA及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。