IPC分类号 : C07J7/00I,C07K14/765I,C07K16/44I,G01N33/74I
专利摘要
本发明公开了一种黄体酮半抗原、人工抗原和多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明以黄体酮为原料，提供了制备黄体酮半抗原的合成及提纯方法，利用合成纯化的黄体酮半抗原与载体蛋白偶联，得到黄体酮完全免疫原，免疫新西兰大白兔，制备了效价高、特异性强的多克隆抗体，最后建立了基于生物素/链霉亲和素放大信号的酶联免疫分析法(BA‑ELISA)用于检测黄体酮，本发明建立的BA‑ELISA免疫分析方法检测黄体酮的IC50为1.29ng/mL，检测线性范围0.22～7.50ng/mL，检测限为0.080ng/mL，具有较大的应用前景。
权利要求
1.一种黄体酮BA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括黄体酮标准品、黄体酮完全免疫原为包被抗原、生物素化的黄体酮特异性多克隆抗体、包被溶液、洗涤液、封闭液、HRP标记的链霉亲和素、底物显色液和终止液；所述黄体酮完全免疫原是由黄体酮半抗原经活泼酯法与牛血清蛋白偶联得到；所述黄体酮特异性多克隆抗体由所述黄体酮完全免疫原乳化后免疫兔后得到；所述黄体酮半抗原其结构式如式(I)所示：
所述的黄体酮半抗原的制备方法，包括如下步骤：
S1.将羧甲氧基胺半盐酸盐和无水吡啶按摩尔比3：1在甲醇溶液中分别溶解；
S2.向S1的无水吡啶溶液中加入甲醇溶解的黄体酮P
S3.将上述溶液混匀，得黄色黏稠状液体；再用二氯甲烷溶解黄色黏稠状液体，去离子水洗涤，无水硫酸镁除水，抽滤，得到淡黄色液体，再旋转蒸发除去溶剂、浓缩；
S4.以二氯甲烷/甲醇20:1→16:1→12:1为洗脱剂，采用硅胶层析柱纯化残渣，重复1～2次，得到白色的目标化合物，即黄体酮半抗原。
2.一种利用权利要求1所述试剂盒检测黄体酮的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释至1μg/mL，包被于酶标板，100μL/孔，4℃包被12～16小时，用PBST洗板3～5次并用吸干水分；
S2.封闭：用含30％脱脂奶粉的0.01mol/L PBST以270μL/孔进行封闭，37℃孵育1～2h，再如步骤S1洗涤操作；
S3.加生物素化抗体和黄体酮标准品：将生物素化多克隆抗体用0.01mol/L PBST稀释8,000倍，以50μL/孔加入到酶标板中，同时分别以50μL/孔加入含10％DMF的PBS溶液溶解的黄体酮标准品和待测样品液，10％DMF的PBS溶液作为空白对照，37℃孵育1～2h，再如步骤S1洗涤操作；
S4.加HRP标记的链霉亲和素：每孔加入1:10,000稀释过的HRP标记的链霉亲和素100μL，37℃孵育1～2h，再如步骤S1洗涤操作，吸干酶标板的水分；
S5.显色和终止反应：加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育10～20min，然后加入2M硫酸终止液，50μL/孔；
S6.检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值，利用软件得出竞争抑制曲线，将待测样品液的吸光值代入竞争抑制曲线，获得待测样品液中黄体酮的含量。
说明书
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，更具体地，涉及一种黄体酮半抗原、人工抗原和多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
黄体酮又称孕酮，是一种类固醇激素，在雌性生殖功能的复杂调控中起着关键作用。若检测到血清或牛奶中黄体酮含量过低，牛有可能会流产，则可以通过适当补充黄体酮来预防牛在怀孕早期流产，可挽回牛养殖业的巨大损失。同时，检测牛奶制品中黄体酮含量也是十分有意义的。女性儿童若长期饮用黄体酮含量过高的牛奶制品，会导致性早熟，引发生理和心理各方面的问题。若检测到某品牌的牛奶制品含量过高，可避免购买该产品，减少了女性儿童性早熟的几率。所以奶制品中黄体酮的检测显得尤为重要。
专利CN108254365A公开了一种黄体酮的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、黄体酮系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、复溶液、洗涤液；其酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的黄体酮半抗原，其磁标抗体是免疫磁珠标记的黄体酮单克隆抗体，其黄体酮单克隆抗体是由黄体酮半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原免疫动物制备获得；其黄体酮半抗原是16,17-环氧黄体酮与巯基丙酸反应得到。由于其人工抗原的免疫原性不强，不能充分暴露黄体酮的特异性位点，因而不能产生特异性强的黄体酮抗体，导致黄体酮检测结果准确性较差；虽然其采用的是磁免疫化学发光检测，但是对黄体酮的检测灵敏度仅可达到0.1μg/L，依然无法满足黄体酮的微量检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种黄体酮半抗原。
本发明的另一目在于提供一种黄体酮完全抗原。
本发明的另一目的在于提供一种黄体酮特异性多克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供所述黄体酮完全抗原、黄体酮特异性多克隆抗体的应用。
本发明的再一目的在于提供一种黄体酮BA-ELISA检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种黄体酮半抗原，其结构式如式(I)所示：
本发明以黄体酮为原料，对黄体酮1号位的碳上进行官能团修饰，连接上羧基，得到黄体酮衍生物，作为本发明的黄体酮半抗原。
所述黄体酮半抗原的制备方法，包括如下步骤：
S1.将羧甲氧基胺半盐酸盐和无水吡啶按摩尔比3：1在甲醇溶液中分别溶解；
S2.向S1的无水吡啶溶液中加入甲醇溶解的黄体酮P4溶液，黄体酮P4与无水吡啶的摩尔比为2:1；
S3.将上述溶液混匀，得黄色黏稠状液体；再用二氯甲烷溶解黄色黏稠状液体，加入去离子水洗涤，加入无水硫酸镁除水，抽滤，得到淡黄色液体，再旋转蒸发除去溶剂、浓缩；
S4.以二氯甲烷/甲醇(20:1(v/v)→16:1(v/v)→12:1(v/v))为洗脱剂，采用硅胶层析柱纯化残渣，重复1～2次，得到白色的目标化合物，即黄体酮半抗原。
一种黄体酮完全免疫原，是由上述黄体酮半抗原与载体蛋白偶联得到。
优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白。
所述黄体酮完全免疫原的制备方法，是将式(I)所示的黄体酮半抗原经活泼酯法与载体蛋白偶联，透析后获得黄体酮完全免疫原。
具体地，所述黄体酮完全免疫原的制备方法，包括如下步骤：
S1.将黄体酮半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再分别将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，使三者的摩尔比为1:2:2；
S2.室温下，磁力搅拌器下搅拌12～16小时，转速为250～300rpm，使半抗原上的羧基充分被活化；
S3.冰浴下，缓慢搅拌，逐渐滴加活化的半抗原到5～7mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)中，使DMF在溶液的最终浓度为20～25％；
S4.低温下缓慢搅拌偶联12～16小时，使更多的半抗原偶联上载体蛋白；
S5.将半抗原和载体蛋白的偶联物装入透析袋中，4℃下透析三天，一天换3次PBS(0.01M；pH 7.4)除去多余的DMF；
S6.10,000～12,000rpm，4℃下离心10min，弃沉淀，取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒测量浓度，分装于EP管中，储存于-20℃备用。
一种黄体酮特异性多克隆抗体的制备方法，是将上述任一所述的黄体酮完全免疫原乳化后免疫兔，得到黄体酮特异性多克隆抗体。
具体地，所述黄体酮特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1.将黄体酮完全免疫原稀释成1.0～1.2mg/mL，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(按比例1:1)混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗，在新西兰大白兔靠近脊背处进行多点皮下注射，共注射500～600μg完全免疫原；
S2.从第一轮免疫开始，每14-15天进行新一轮免疫，共6轮。免疫期间，免疫后的第7天在兔耳缘静脉下取血；
S3.4℃下静置过夜，离心取上清，采用酶联免疫分析法(ELISA)检测特异性多克隆抗体的效价，使用辛酸-硫酸铵法对效价较高的血清进行纯化，采用SDS-PAGE电泳测定特异性多克隆抗体的纯度。
本发明还提供由上述任一所述方法制备得到的黄体酮特异性多克隆抗体。
上述任一所述的黄体酮完全免疫原或所述的黄体酮特异性多克隆抗体在黄体酮的BA-ELISA检测或在制备黄体酮BA-ELISA检测试剂盒中的应用。
一种黄体酮BA-ELISA检测试剂盒，包括黄体酮标准品、上述任一所述的黄体酮完全免疫原为包被抗原、生物素化的上述任一所述黄体酮特异性多克隆抗体、包被溶液、洗涤液、封闭液、HRP标记的链霉亲和素、底物显色液和终止液。
一种利用上述试剂盒检测黄体酮的方法，包括如下步骤：
S1.包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释至1μg/mL，包被于酶标板，100μL/孔，4℃包被12～16小时，用PBST洗板3～5次并用吸干水分；
S2.封闭：用含30％脱脂奶粉的0.01mol/L PBST以270μL/孔进行封闭，37℃孵育1～2h，再如步骤S1洗涤操作；
S3.加生物素化抗体和黄体酮标准品：将生物素化多克隆抗体用0.01mol/L PBST稀释8,000倍，以50μL/孔加入到酶标板中，同时分别以50μL/孔加入含10％DMF的PBS溶液溶解的黄体酮标准品和待测样品液，10％DMF的PBS溶液作为空白对照，37℃孵育1～2h，再如步骤S1洗涤操作；
S4.加HRP标记的链霉亲和素：每孔加入1:10,000稀释过的HRP标记的链霉亲和素100μL，37℃孵育1～2h，再如步骤S1洗涤操作，吸干酶标板的水分；
S5.显色和终止反应：加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育10～20min，然后加入2M硫酸终止液，50μL/孔；
S6.检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值，利用软件得出竞争抑制曲线，将待测样品液的吸光值代入竞争抑制曲线，获得待测样品液中黄体酮的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种黄体酮半抗原，是对黄体酮1号位的碳上进行官能团修饰，连接上羧基得到。利用合成纯化的黄体酮半抗原与载体蛋白偶联，得到黄体酮完全免疫原，免疫新西兰大白兔，制备了效价高、特异性强的多克隆抗体，最后建立了基于生物素/链霉亲和素放大信号的酶联免疫分析法(BA-ELISA)用于检测黄体酮，本发明建立的BA-ELISA免疫分析方法检测黄体酮的IC50为1.29ng/mL，检测线性范围0.22～7.50ng/mL，检测限为0.080ng/mL，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为本发明修饰纯化后得到黄体酮半抗原的核磁氢谱表征鉴定图。
图2为本发明修饰纯化后得到黄体酮半抗原的一级质谱表征鉴定图。
图3为本发明纯化后抗黄体酮多克隆抗体的SDS-PAGE电泳图谱。其中条带1是血清纯化前的1.2mg/mL的电泳图，其中条带2是血清纯化前的1.2mg/mL的电泳图，纯化后的IgG是由两条链组成，分别为50KDa左右处的重链和25KDa左右处的轻链，在2中可见25KDa左右的条带有些模糊，有可能是浓度较低造成的。
图4为使用本发明建立的BA-ELISA检测黄体酮的竞争抑制曲线，检测到黄体酮的IC50为1.29ng/mL，检测线性范围0.22～7.50ng/mL，检测限为0.080ng/mL。
图5为交叉反应性实验，选择氢化可的松、去氢表雄酮、地塞米松、雄烯二酮、雌二醇、苯甲酸雌二醇及睾酮做特异性实验，黄体酮的交叉反应率到100％，氢化可的松、去氢表雄酮、地塞米松、雄烯二酮、雌二醇、苯甲酸雌二醇及睾酮等黄体酮的类似物交叉反应率均小于0.1％，说明制备的抗黄体酮多克隆抗体具有较高的特异性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1黄体酮半抗原的制备
一种黄体酮半抗原的修饰制备，其合成路线如下所述：
具体为：
(1)加入164mg羧甲氧基胺半盐酸盐和160μL无水硬吡啶在5mL甲醇溶液中溶解。
(2)在25℃下，加入5mL甲醇溶解的黄体酮P4溶液。
(3)将混合物搅拌5h，使用二氯甲烷溶解黄色黏稠状液体，加入去离子水洗涤5次，加入无水硫酸镁除去水，抽滤，得到淡黄色液体，在旋转蒸发仪下除去溶剂浓缩。
(4)以二氯甲烷/甲醇(20:1(v/v)→16:1(v/v)→12:1(v/v))为洗脱剂，采用硅胶层析柱纯化残渣，重复2次，得到白色的目标化合物。固体(产率：+60％，+90％NMR纯度，Rf＝0.278)。
纯化后半抗原核磁氢谱表征鉴定(见附图1)，一级质谱表征鉴定(见附图2)，表明成功制备得到了黄体酮半抗原。
实施例2黄体酮完全免疫原的制备
(1)将7.8mg黄体酮半抗原溶解于23μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再分别将4.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、8.3mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)分别溶解于45μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
(2)室温下，磁力搅拌器下搅拌12小时，转速为250rpm，使半抗原上的羧基充分被活化。
(3)冰浴下，缓慢搅拌，逐渐滴加活化的半抗原到5mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)中，使DMF在溶液的最终浓度为20％。
(4)低温下缓慢搅拌偶联12小时，使更多的半抗原偶联上载体蛋白。
(5)将半抗原和载体蛋白的偶联物装入透析袋中，4℃下透析三天，一天换3次PBS(0.01M；pH 7.4)除去多余的DMF。
(6)10,000rpm，4℃下离心10min，弃沉淀，取上清。使用BCA蛋白定量试剂盒测量浓度，分装于EP管中，储存于-20℃备用。
实施例3抗黄体酮特异性多克隆抗体的制备
(1)将黄体酮完全免疫原稀释成1.0/mL，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(按比例1:1)混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗，在新西兰大白兔靠近脊背处进行多点皮下注射，共注射500μg完全免疫原。
(2)从第一轮免疫开始，每14天进行新一轮免疫，共6轮。免疫期间，免疫后的第7天在兔耳缘静脉下取血，具体如表1所示。
(3)4℃下静置过夜，离心取上清，采用酶联免疫分析法(ELISA)检测特异性多克隆抗体的效价，效价为1:640,000，其结果如表2所示。使用辛酸-硫酸铵法对效价较高的血清进行纯化，采用SDS-PAGE测定特异性多克隆抗体的纯度，其结果如图3所示，抗体的效价如表2所示。
表1免疫新西兰大白兔时间表
表2特异性抗黄体酮多克隆抗体的效价
实施例4基于生物素/链霉亲和素放大信号的酶联免疫分析法(BA-ELISA)
1、棋盘滴定法优化包被抗原浓度及生物素化抗体的稀释倍
(1)包被：用包被缓冲液(CBS，pH＝9.6，0.05mol/L)将包被抗原分别稀释至0.125～8μg/mL(如表2)，进行倍比稀释，包被于96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被16小时，用PBST洗板5次并用吸水纸拍干。
(2)封闭：用含30％脱脂奶粉的PBST(0.01mol/L)进行封闭(270μL/孔)，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作。
(3)加生物素化抗体：分别将生物素化多克隆抗体用PBST(0.01mol/L)进行倍比稀释(1:2,000～1:64,000，表2)后，用移液枪加入到96孔酶标板(100μL/孔)中，同时加入PBST作为空白对照，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作。
(4)加HRP标记的链霉亲和素：每孔加入1:10,000稀释过的HRP标记的链霉亲和素100μL，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作，使用吸水纸吸干酶标板。
(5)显色和终止反应：加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，在水浴锅中37℃下孵育15min，然后加入2M硫酸终止液，50μL/孔。
(6)检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值。当吸光值不再随包被抗原的浓度增加而增加，达到饱和状态时，选择这一浓度为最佳包被抗原浓度。当吸光值在1.0左右(0.8～1.2之间)时，ELISA具有较高的灵敏度，选择在这一吸光值范围的稀释倍数为最佳生物素化抗体稀释倍数。根据表3，选择最佳包被抗原浓度为0.25μg/mL，最佳抗体稀释倍数为1:8,000。
表3棋盘滴定法优化包被抗原及抗黄体酮生物素化多克隆抗体的稀释倍数
2、使用生物素/链霉亲和素放大信号的ELISA检测黄体酮。
(1)包被：用包被缓冲液(CBS，pH＝9.6，0.05mol/L)将包被抗原稀释至0.25μg/mL，包被于96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被16小时，用PBST洗板5次并用吸水纸拍干。
(2)封闭：用含30％脱脂奶粉的PBST(0.01mol/L)进行封闭(270μL/孔)，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作。
(3)加生物素化抗体和黄体酮标准品：将生物素化多克隆抗体用PBST(0.01mol/L)稀释8,000倍，用移液枪加入到96孔酶标板(50μL/孔)中，同时加入含10％DMF的PBS溶液溶解的黄体酮标准品(50μL/孔)，10％DMF的PBS溶液作为空白对照，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作。
(4)加HRP标记的链霉亲和素：每孔加入1:10,000稀释过的HRP标记的链霉亲和素100μL，在水浴锅中37℃下孵育1h，如上步骤1洗涤操作，使用吸水纸吸干酶标板。
(5)显色和终止反应：加入新鲜配制的TMB显色液，100μL/孔，在水浴锅中37℃下孵育15min，然后加入2M硫酸终止液，50μL/孔。
(6)检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值。利用软件得出竞争抑制曲线。结果如图4所示，上述方法建立的BA-ELISA检测黄体酮的IC50为1.29ng/mL，检测线性范围0.22～7.50ng/mL，检测限为0.080ng/mL，具有很强的检测灵敏度。
(7)交叉反应性实验：同时，选择氢化可的松、去氢表雄酮、地塞米松、雄烯二酮、雌二醇、苯甲酸雌二醇及睾酮做特异性实验，黄体酮类似物的交叉反应率均小于0.1％。其结果如图5所示，结果表明，均无法检测出上述目标物，说明本发明上述方法建立的BA-ELISA具有较高的特异性。
一种黄体酮半抗原、人工抗原和多克隆抗体及其制备方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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