专利摘要

具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物及其制备方法，涉及药物技术领域，本发明采用活性追踪的技术手段从中药金樱子果皮中分离纯化两个羽扇豆烷型三萜类新化合物。该两个新化合物具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，且其呈现明显的量效与时效关系，显示该类化合物在制备抗老年痴呆和神经退行性疾病药物中的应用前景。

权利要求

1.具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物，其特征在于，所述化合物包括以下两种，其结构式为：

。

2.具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物制备方法，其特征在于，所述方法包括以下制备步骤：

（1）金樱子果皮6-10倍量乙醇：水（3：1）微波辅助提取2-3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏；将浸膏分散在水中，分别用等体积正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，减压浓缩得到正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层；

（2）分别对总提物、正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，仅二氯甲烷活性明显高于总提物活性，因此确定其为活性部位；

（3）将二氯甲烷萃取物进行聚酰胺柱分离，经过正己烷: 二氯甲烷: 甲醇进行混合梯度洗脱，减压浓缩得组分A-E；

5个流分同样经过乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，确定D为活性部位；

（4）将组分D进行C8反相色谱分离，以甲醇：水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，得10流分，其中第5 和第9 流分经高效液相色谱分离得化合物1 和2。

3.具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物，其特征在于，所述化合物用在制备抗老年痴呆或神经退行性疾病药物中。

说明书

技术领域

本发明属于药物技术领域，涉及羽扇豆烷型三萜类化合物，并以其为活性成分的药物组合物及其制备方法，特别是涉及具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物及其制备方法。

背景技术

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是以记忆损伤、认知功能障碍、行为障碍和生活自理能力下降为特征的慢性神经退行性疾病，是老年痴呆中最常见的疾病。老年性痴呆症危害着病人的健康，给我们的家庭和社会带来沉重的负担。随着我国逐步进入老龄化，因此，AD日益成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一。医学治疗上多采用乙酰胆碱酯酶抑制剂（acetylcholinesterase inhibitor, AChEI）抑制 AChE活性，延缓ACh水解的速度，提高突触间隙 ACh 的水平，从而发挥对 AD 的治疗作用。目前临床上还没有药物可以完全保护神经元，抑制神经元内部 ACh的降解是治疗老年痴呆症的主要手段，AChEI 是美国 FDA 许可唯一作为治疗 AD 的药物，也是治疗 AD 最有效的药物之一。近来从中草药、微生物的代谢产物和化学合成中筛选 AChEI的研究倍受关注。

中药金樱子Rosa laevigata Michx.为蔷薇科蔷薇属植物在我国分布非常广泛。始载于《蜀本草》，其果实，根和叶均可入药。《本草纲目》中记载金樱子：性酸、涩、平、无毒；主治脾泻下痢、止小便利、涩精气。金樱子果实中含有丰富的三萜皂苷、黄酮及多糖类化合物，其化学成分和药理活性的多样性近年来成为国内外学者研究的热点。经查，现有技术中未见有本发明的化合物及其具有抗老年痴呆或神经退行性疾病价值治疗前景的活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物及其制备方法，本发明通过对金樱子果皮化学成分进行研究，从中分离得到两个羽扇豆烷型三萜类新化合物，化合物具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，是具有抗老年痴呆或神经退行性疾病价值的化合物。

本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：

    具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物，所述化合物包括以下两种，其结构式为：

    具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物制备方法，所述方法包括以下制备步骤：

（1）金樱子果皮6-10倍量乙醇：水（3：1）微波辅助提取2-3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏；将浸膏分散在水中，分别用等体积正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，减压浓缩得到正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层；

（2）分别对总提物、正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，仅二氯甲烷活性明显高于总提物活性，因此确定其为活性部位；

（3）将二氯甲烷萃取物进行聚酰胺柱分离，经过正己烷：二氯甲烷: 甲醇进行混合梯度洗脱，减压浓缩得组分A-E。5个流分同样经过乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，确定D为活性部位；

（4）将组分D进行C8反相色谱分离，以甲醇：水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，得10流分，其中第5 和第9 流分经高效液相色谱分离得化合物1 和2。

    具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物，所述化合物用在制备抗老年痴呆或神经退行性疾病药物中。

本发明的有益效果为：

本发明首次公开了中药金樱子果皮中两个羽扇豆烷型三萜衍生物的结构。本发明通过对金樱子果皮化学成分进行研究，从中分离得到两个羽扇豆烷型三萜类新化合物，经过改进的Ellman法进行乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定，结果表明两个新化合物具有显著的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，且其呈现明显的量效与时效关系，显示该类化合物在制备抗老年痴呆和神经退行性疾病药物中的应用前景。

附图说明

图1是化合物1的¹H NMR图谱；

图2是化合物1的¹³C NMR图谱；

图3是化合物1的HSQC图谱；

图4是化合物1的HMBC图谱；

图5是化合物2的¹H NMR图谱；

图6是化合物2的¹³C NMR图谱；

图7是化合物2的HSQC图谱；

图8是化合物2的HMBC图谱；

图9是样品及石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线图；

图10是羽扇豆烷型三萜类新化合物抑制乙酰胆碱酯酶呈现量效与时效关系图。

具体实施方式

下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。

本发明具有下述结构式的三萜类化合物1 和2，

制备所述的化合物1 和2 的方法，干燥的金樱子果皮粉粹后，加入6-10倍量的体积比为3：1的乙醇水微波400瓦加热回流提取2-3次，合并滤液，减压浓缩得浸膏；将浸膏分散在水中，分别用等体积正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇反复多次萃取，减压浓缩得到正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层；分别对总提物、正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，仅二氯甲烷活性明显高于总提物活性，因此确定其为活性部位；将二氯甲烷萃取物进行聚酰胺柱分离，按照正己烷: 二氯甲烷: 甲醇为75:25:0, 60:40:0, 45:65:0, 0:100:0, 0:95:5, 0:80:20, 0:60:40, 0:0:100 进行梯度洗脱，减压浓缩得组分A，B，C，D，E；5个流分同样经过乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，确定D为活性部位；将组分D进行C8反相色谱分离梯度洗脱，按甲醇：水为5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0 进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1L，每400mL 收集一流分，得10流分，其中第5 和第9 流分经高效液相色谱分离得化合物1 和2。

实施例1：

    化合物1 和2 的分离纯化：

取金樱子药材10kg，其药材来源为蔷薇科蔷薇属植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥果皮，粉粹后，以10倍量乙醇水（3：1）微波400瓦加热回流提取3次，每次2小时，合并滤液，减压浓缩得浸膏；将浸膏分散在5L水中，用等体积二氯甲烷萃取3次，减压浓缩得二氯甲烷部分的萃取物100g；将二氯甲烷萃取物进行聚酰胺柱分离，按照正己烷: 二氯甲烷: 甲醇为75:25:0, 60:40:0, 45:65:0, 0:100:0, 0:95:5, 0:80:20, 0:60:40, 0:0:100 进行梯度洗脱，减压浓缩得组分A-E五个流分；将组分D（9g）进行C18反相色谱分离梯度洗脱，按甲醇：水为5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0 进行梯度洗脱，每个梯度洗脱1L，每400mL 收集一流分，得10个流分，其中第5个流分经高效液相色谱等度（甲醇水80%）分离得化合物2 （11.0 mg）同样第9流分经高效液相色谱等度（甲醇水73%）分离得化合物1 （33.5 mg）。

化合物1 和2 的结构确证：

化合物1 和2 的结构式如下所示：

化合物1：无色针状结晶，易溶于二氯甲烷，甲醇等有机溶剂，高分辨质谱 HRESIMS m/z: [M+Na]⁺ 495.3478 (calcd For C₃₀H₄₈O₄Na⁺, 4495.3445), ¹H NMR, ¹³C NMR数据见下表；

化合物2：无色针状结晶，易溶于二氯甲烷，甲醇等有机溶剂，高分辨质谱 HRESIMS m/z: [M+Na]⁺ 599.3719 [M + Na]⁺ (calcd C₃₇H₅₂O₅Na⁺,599.3707), ¹H NMR, ¹³C NMR数据见下表。

化合物1 和2 的结构鉴定数据：

    实施例2：

    本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗老年痴呆或神经退行性疾病的药理作用。

    化合物1 和2的乙酰胆碱酯酶抑制活性实验。

    实验原理：一定条件下，碘代硫代乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的作用下分解成碘代硫代胆碱，碘代硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成的5-巯基-2-硝基苯甲酸是在405nm处具有紫外光吸收的黄色物质。

乙酰胆碱酯酶与碘代硫代乙酰胆碱的作用

碘代硫代胆碱与DTNB的显色作用

    化合物1 和2样品溶液的配制：准确称取样品2mg，置于15ml EP管中，加入10ml含0.1%DMSO的无水乙醇，稀释成0.2mg/ml样品储备液，待用。分别稀释至2μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml。

配制PBS缓冲液：将PBS粉末定容至200ml容量瓶中，配制得0.1mol/L，pH7.4的PBS缓冲液。

    P-D溶液的配制：取10μL DMSO加入15mlEP管中，加9990μl 的PBS缓冲液。

    乙酰胆碱酯酶的稀释：取一定质量的乙酰胆碱酯酶分别稀释至0.2U/ml、0.4U/ml、0.6U/ml、0.8U/ml、1U/ml。

    DTNB的配制：取40mg 加入10ml无水乙醇10mmol/L，出现黄色即弃用，均置于4℃保存供使用；

    底物ATCI的配制：取43mg加入10ml无水乙醇，配制得15mmol/LATCI。

实验操作步骤 

    样品组：在96孔酶标板上中依次加入140 μL 0.1mol/L pH=7.4的PBS缓冲液，20 μL样品溶液，15μL 0.4 U/mL AChE，在4℃条件下反应20min。加入10μl 15mmol/L 底物ATCI，再加入20μl 10mmol/L DTNB，在37℃条件下反应30min，用酶标仪在405nm波长处测定其吸光度值，每个样品梯度做三组平行实验。

    样品本底组：用15 μL PBS 缓冲液代替15 μL AChE溶液，其它条件不变。

    空白对照组：用20 μL PBS 缓冲液代替 20 μL 待测样品溶液，其它条件不变。

    完全抑制对照孔：用20 μL PBS 缓冲液配制石杉碱甲溶液（0.1mg/mL）。

抑制率(％)=[(空白组-完全抑制组)-(样品组-样品本底组)]/(空白组-完全抑制组)×100％

    根据不同质量浓度梯度的样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，绘制样品及石杉碱甲对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线，如图10，并通过SPSS18软件计算得到化合物1和2的IC₅₀值如下表。结果表明化合物1和2可以作为抗乙酰胆碱酯酶活性的先导化合物进行后续衍生化开发。

具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的三萜化合物及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。