专利摘要

本发明公开一种含芳香环基团的玫瑰烷型二萜，其特征在于结构通式如下：式中A环为芳香化的玫瑰烷型二萜，R1，R2，R3，R4，R5分别为氢原子、羟基、卤素原子、甲氧基、氨基、巯基、C1至C8脂肪酸、烷氨基或烷巯基及其光学异构体。所制备的化合物具有对结核分枝杆菌的抑制活性，尤其是对结核分枝杆菌乙酰基转移功能蛋白GlmU具有抑制作用，可应用于制备抗结核药物。

权利要求

1.一种含芳香环基团的玫瑰烷型二萜在制备抗结核药物中的应用，其特征在于制备抑制结核分枝杆菌乙酰基转移功能蛋白GlmU药物中的应用，

所述含芳香环基团的玫瑰烷型二萜具体结构如下：

说明书

技术领域

本发明涉及玫瑰烷型二萜化合物，尤其涉及一种含芳香环基团的玫瑰烷型二萜、制备方法及在制备抗结核药物中的应用。

背景技术

月腺大戟（Euphorbiae ebracteolatae）为大戟科大戟属植物，多年生草本，药用部位为根，为中药狼毒的原植物之一，植物资源丰富，收载于《中华人民共和国药典》（2015版）中。其味苦、辛，性平，有毒，具有散结杀虫的功效。民间药用历史悠久，常用于治疗淋巴结核及肿瘤等疾病。但是，其中的抗结核活性成分尚不明确，抗结核作用机制亦不清晰。因此，迄今为止并没有以月腺大戟为原料，提取抗结核活性成份的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种含芳香环基团的玫瑰烷型二萜、制备方法及在制备抗结核药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：一种含芳香环基团的玫瑰烷型二萜，其特征在于结构通式如下：

式中A环为芳香化的玫瑰烷型二萜， R₁，R₂，R₃，R₄，R₅分别为氢原子、羟基、卤素原子、甲氧基、氨基、巯基、C1至C8脂肪酸、烷氨基或烷巯基及其光学异构体。

所述R₁、R₃、R₄、R₅=H；R₂ = OH。

所述R₁、R₃、R₄ =H；R₂、R₅ = OH。

所述R₁、R₄ 、R₅=H；R₂、R₅ = OH；R₃ = β-OCH₃

所述R₁、R₃ 、R₅=H；R₂、R₅ = OH；R₄ =α-OCH₃。

所述R₁、R₃、R₄、R₅=H；R₂ = 。

所述R₃、R₄、R₅=H；R₁、R₂ = OH。

上述含芳香环基团的玫瑰烷型二萜的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 将月腺大戟干燥根粉碎，用质量浓度80%的乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩并回收乙醇，得月腺大戟浸膏；将浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇多次等体积萃取，分别减压浓缩得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物；

b.将石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物合并，进行硅胶柱层析，石油醚-丙酮按50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1梯度洗脱；

c. 合并石油醚-丙酮30:1至10:1洗脱流份；合并石油醚-丙酮10:1至5:1洗脱流份；

d. 将上述合并后的两个馏分分离，得化合物1-6含芳香环基团的玫瑰烷型二萜化合物。

上述含芳香环基团的玫瑰烷型二萜在制备抗结核药物中的应用。

所述含芳香环基团的玫瑰烷型二萜在制备抗结核药物中的应用是在制备抑制结核分枝杆菌乙酰基转移功能蛋白GlmU药物中的应用。

本发明通过现代色谱、波谱技术结合高通量药物筛选，从月腺大戟中提取制备了六个含有芳香环基团的玫瑰烷型二萜类化合物。所制备的化合物具有对结核分枝杆菌的抑制活性，尤其是对结核分枝杆菌乙酰基转移功能蛋白GlmU具有抑制作用，可应用于制备抗结核药物。

附图说明

图1是本发明实施例化合物6对GlmU乙酰基转移功能的抑制作用示意图。

图2是本发明实施例化合物6对GlmU乙酰基转移功能抑制动力学研究示意图。

图3是本发明实施例化合物1与GlmU蛋白的相互作用Docking分析图。

图4是本发明实施例化合物2与GlmU蛋白的相互作用Docking分析图。

图5是本发明实施例化合物3与GlmU蛋白的相互作用Docking分析图。

图6是本发明实施例化合物4与GlmU蛋白的相互作用Docking分析图。

图7是本发明实施例化合物5与GlmU蛋白的相互作用Docking分析图。

图8是本发明实施例化合物6与GlmU蛋白的相互作用Docking分析图。

具体实施方式

本发明的制备方法按照如下步骤进行：

a. 取月腺大戟干燥根20 kg，粉碎，用质量浓度80%的乙醇加热回流提取三次，合并提取液，减压浓缩并回收乙醇，得月腺大戟浸膏3.7 kg；将浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇多次等体积萃取，分别减压浓缩得石油醚萃取物192 g，乙酸乙酯萃取物264 g，正丁醇萃取物90 g；

b.将石油醚萃取物与乙酸乙酯萃取物合并，取400 g进行硅胶柱层析，石油醚-丙酮（50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1）梯度洗脱；

c. 合并石油醚-丙酮30:1至10:1洗脱流份，共77 g，记为YXH；合并石油醚-丙酮10:1至5:1洗脱流份，共45 g，记为YXK；

d. 将上述YXH及 YXK两个馏分分别经反复硅胶柱色谱、制备型中压柱色谱、制备薄层色谱、制备型液相色谱及重结晶等方法分离，得化合物1-6。

一. 化合物的结构测定：

化合物1：

白色粉末，根据HR-ESI-MS m/z 271.2054 [M+H]⁺，确定其分子式为C₁₉H₂₆O，UV (CH₃OH) λ_max 202.3、279.7 nm，提示含有芳香环结构。在¹H-NMR（500 MHz，CDCl₃）谱中，δ1.02 (3H, s)、2.11 (3H, s)、1.01 (3H, s)为三个甲基质子信号，δ7.05 (1H, d, J=8.5 Hz)、6.63 (1H, d, J=8.5 Hz)为苯环上的两个氢质子信号，δ5.57 (1H, dd, J=17.5, 11.0 Hz)、4.97 (1H, dd, J= 17.5, 1.5 Hz)、4.88 (1H, dd, J= 11.0, 1.5 Hz)为末端双键上的三个氢质子信号，δ7.25 (1H, s)为一个羟基氢信号。在¹³C-NMR（125 MHz，CDCl₃）中，共给出19个碳信号，其中δ122.6、112.5、151.1、121.9、135.7、140.9为苯环上六个碳信号，δ151.2、108.8为末端双键碳信号，综合以上波谱数据，该化合物为玫瑰烷型二萜类化合物。

根据¹H-¹H COSY谱，建立了三个自旋耦合体系，分别为H-1/H-2，H-6/H-7/H-8/H-14，H-11/H-12。在HMBC谱中，H-19和C-3、C-4、C-5之间远程相关，H-1和C-3、C-5之间远程相关，H-2和C-3、C-10之间远程相关，确定A环为四取代苯环结构，H-15和C-13、C-14之间远程相关，H-16和C-13之间远程相关，H-17和C-13、C-14之间远程相关，确定了C-15、C-16位末端双键。因此，综合以上波谱数据，确定了化合物1的结构。

化合物2：

白色粉末，根据HR-ESI-MSm/z 287.2011 [M+H]⁺，确定其分子式为C₁₉H₂₆O₂，UV (CH₃OH) λ_max 285.2 nm，提示含有芳香环结构。

在¹H-NMR（600 MHz，CDCl₃）谱中，δ1.03 (3H, s)、1.02 (3H, s)、2.20 (3H, s)为三个甲基质子信号，δ6.63 (1H, d, J=8.4 Hz)、6.52 (1H, d, J=8.4 Hz)为苯环上的两个氢质子信号，δ5.77 (1H, dd, J=17.4, 10.8 Hz)，4.91 (1H, d, J=17.4 Hz)，4.86 (1H, d, J=10.8 Hz)为末端双键上的三个氢质子信号。在¹³C-NMR（150 MHz，CDCl₃）中，共给出19个碳信号，其中δ120.6、112.3、149.6、121.7、135.3、148.8为苯环上六个碳信号，δ150.2、109.3为末端双键碳信号，δ81.3为连氧碳信号。综合以上波谱数据，该化合物为玫瑰烷型二萜类化合物。

根据¹H-¹H COSY谱，建立了三个自旋耦合体系，分别为H-1/H-2，H-6/H-7/H-8/H-14，H-11/H-12。在HMBC谱中，H-19和C-3、C-4、C-5之间远程相关，H-2和C-4、C-10之间远程相关，H-1和C-3、C-4、C-5之间远程相关，确定A环为四取代苯环结构，结合在¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定苯环C-3位为羟基取代，H-15和C-12、C-13、C-14、C-17之间远程相关，H-16和C-13、C-14之间远程相关，H-17和C-13、C-14之间远程相关，确定了C-15、C-16位末端双键结构。H-7和C-8，H-11和C-8，H-14和C-8，H-20和C-8都有相关，确定C-8位为羟基取代。在NOESY谱中，H-12和CH₃-20，H-12和H-15存在相关，可确定8α-OH相对构型。因此，综合以上波谱数据，确定了该化合物的。

化合物3：

白色粉末，根据HR-ESI-MSm/z323.1979[M+Na]⁺，确定其分子式为C₂₀H₂₈O₂，UV(CH₃OH) λ_max284.6 nm，提示含有芳香环结构。

在¹H-NMR（600 MHz，CDCl₃）谱中，δ1.06 (3H, s)、0.97 (3H, s)、2.21 (3H, s)为三个甲基质子信号，δ3.45 (3H, s)为一个甲氧基质子信号，δ4.27 (1H, dd, J=3.6, 1.2 Hz)为一个连氧碳上的氢质子信号，δ7.06 (1H, d, J=8.4 Hz)，6.73 (1H, d, J=8.4 Hz)为苯环上的两个氢质子信号，δ5.88 (1H, dd, J=17.4,10.2 Hz)，4.97 (1H, dd, J=17.4,1.2 Hz)，4.89 (1H, dd, J=10.2,1.2 Hz)为末端双键上的三个氢质子信号。在¹³C-NMR（150 MHz，CDCl₃）中，共给出20个碳信号，其中δ123.0、115.2、151.7、123.9、134.5、141.2为苯环上六个碳信号，δ151.2、108.9为末端双键碳信号，δ74.3为连氧碳信号，δ56.0为甲氧基上的碳信号。综合以上波谱数据，该化合物为玫瑰烷型二萜类化合物。

根据¹H-¹H COSY谱，建立了三个自旋耦合体系，分别为H-1/H-2，H-7/H-8/H-14，H-11/H-12。在HMBC谱中，H-19和C-3、C-4、C-5之间远程相关，H-2和C-4、C-10之间远程相关，H-1和C-3、C-5、C-9之间远程相关，确定A环为四取代苯环结构，结合在¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定苯环C-3位为羟基取代，H-15和C-12、C-13、C-14、C-17之间远程相关，H-16和C-13之间远程相关，H-17和C-13、C-14、C-15之间远程相关，确定了C-15、C-16位末端双键结构。H-7和C-6，H-19和C-6相关，确定C-6位为甲氧基取代。NOESY谱中，OCH₃-6和H-7β，H-7β和H-14β，CH₃-20和H-12β，H-12α和H-8，H-8/CH₃-17，H-8和H-17之间存在NOE相关。可确定6β- OCH₃和8α-H的相对构型。因此，综合以上波谱数据，确定了该化合物的结构。

化合物4：

白色粉末，根据HR-ESI-MSm/z623.4076[2M+Na]⁺，确定其分子式为C₂₀H₂₈O₂，UV (CH₃OH) λ _max283.2nm，提示含有芳香环结构。

在¹H-NMR（600 MHz，CDCl₃）谱中，δ1.12 (3H, s)、0.99 (3H, s)、2.21 (3H, s)为三个甲基质子信号，δ3.39 (3H, s)为一个甲氧基质子信号，δ4.63 (1H, m)为一个连氧碳上的氢质子信号，δ7.03 (1H, d, J=8.4 Hz)、6.72 (1H, d, J=8.4 Hz)为苯环上的两个氢质子信号，δ5.86 (1H, dd, J=17.4, 10.2 Hz)、4.97 (1H, dd, J=17.4,1.2 Hz)、4.90 (1H, dd, J=10.2,1.2 Hz)为末端双键上的三个氢质子信号。在¹³C-NMR（150 MHz，CDCl₃）中，共给出20个碳信号，其中δ122.2、114.6、152.0、124.3、135.2、142.5为苯环上六个碳信号，δ150.9、109.0为末端双键碳信号，δ74.8为连氧碳信号，δ54.5为甲氧基上的碳信号。综合以上波谱数据，该化合物为玫瑰烷型二萜类化合物。

根据¹H-¹H COSY谱，建立了三个自旋耦合体系，H-1/H-2，H-11/H-12。在HMBC谱中，H-18和C-3、C-4、C-5之间远程相关，H-2和C-4、C-10之间远程相关，H-1和C-3、C-5、C-9之间远程相关，确定A环为四取代苯环结构，结合在¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定苯环C-3位为羟基取代，H-15和C-12、C-13、C-14、C-17之间远程相关，H-16和C-13之间远程相关，H-17和C-13、C-14之间远程相关，确定了C-15、C-16位末端双键结构。H-6和C-7，H-8和C-7相关，结合¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定C-7位为甲氧基取代。NOESY谱中，OCH₃-7和H-8，H-8和H-17之间存在NOE相关。可确定7α-OCH₃和8α-H的相对构型。因此，综合以上波谱数据，确定了该化合物的结构。

化合物5：

白色粉末，根据HR-ESI-MS m/z 319.1665 [M+Na]⁺，确定其分子式为C₂₀H₂₄O₂，UV (CH₃OH) λ_max 206.7、245.0、277.3 nm，提示含有芳香环结构。

在¹H-NMR（600 MHz，CDCl₃）谱中，δ1.05 (3H, s)、1.09 (3H, s)为两个甲基质子信号，δ7.49 (1H, d, J=8.4 Hz)、7.70 (1H, d, J=8.4 Hz)为苯环上的两个氢质子信号，δ5.87 (1H, dd, J=17.4, 10.8 Hz)、4.92 (1H, dd, J= 10.8, 1.2 Hz)、4.99 (1H, dd, J= 17.4, 1.2 Hz)为末端双键上的三个氢质子信号，δ5.19(1H, d, J=15.6Hz)、5.14(1H, d, J=15.6Hz)为连氧亚甲基上的两个氢质子信号。在¹³C-NMR（150 MHz，CDCl₃）中，共给出20个碳信号，其中δ126.0，122.8、146.2、122.7、130.2、154.5为苯环上六个碳信号，δ150.7、109.8为末端双键碳信号，δ171.6为酯羰基碳信号。综合以上波谱数据，该化合物为玫瑰烷型二萜类化合物。

根据¹H-¹H COSY谱，建立了3个自旋耦合体系，分别为H-1/H-2，H-6/H-7/H-8/H-14，H-11/H-12。在HMBC谱中，H-19和C-2、C-3、C-4、C-18之间远程相关，H-2和C-3、C-10之间远程相关，H-1和C-3、C-4、C-9之间远程相关，H-6和C-4、C-7、C-10之间远程相关，确定A环为四取代苯环结构，结合在¹H-NMR中δ5.19 (1H, d, J=15.6 Hz)，5.14 (1H, d, J=15.6 Hz)连氧亚甲基信号，确定苯环C-3、C-4、C-18、C-19位形成五元内酯环，C-18位为羰基碳，H-15和C-12、C-13、C-14之间远程相关，H-16和C-13之间远程相关，H-17和C-12、C-13、C-14之间远程相关，确定了C-15、C-16位末端双键结构。因此，综合以上波谱数据，确定了该化合物的结构。

化合物6：

白色粉末，根据ESI-MS数据以及核磁共振数据确定的该化合物6的分子式为C₁₉H₂₆O₂。推测化合物6为降碳二萜。UV (CH₃OH)显示化合物6的最大吸收峰分别为 λ_max 205.7、284.5 nm，提示结构中含有芳香环片段。化合物6类似于化合物1，仍然为降碳的玫瑰烷型二萜。在¹H-NMR（600 MHz，CDCl₃）谱中，δ1.02 (3H, s)、2.11 (3H, s)、1.01 (3H, s) 为17、19、20位甲基质子信号，δ6.71 (1H, s)为1位芳香氢质子信号，δ5.86 (1H, dd, J=15.0, 10.0 Hz)、4.88 (1H, dd, J=10.0, 0.9 Hz)、4.97 (1H, dd, J=15.0，0.9 Hz)为15、16位双键上的氢质子信号。在¹³C-NMR（150 MHz，CDCl₃）谱中，共给出19个碳信号，其中δ108.8、140.8、140.6、122.6、127.2、139.9为A环上六个碳信号，δ151.1、108.9为15、16位两个双键碳信号。综合以上波谱数据，该化合物为玫瑰烷型二萜类化合物并确定了该化合物的结构。

本发明所得化合物1~6的核磁共振氢谱数据如表1所示；核磁共振碳谱数据如表2所示。

表1. 化合物1-6的核磁共振氢谱数据

注：^{a 1}H-NMR（500 MHz，CDCl₃），^{b 1}H-NMR（600 MHz，CDCl₃）

表2. 化合物1-6的核磁共振碳谱数据

注：^{a 13}C-NMR（125 MHz，CDCl₃），^{b 13}C-NMR（150 MHz，CDCl₃）

本发明实施例所得化合物1~6的具体结构如下：

化合物1~6均为含芳香环基团的玫瑰烷型二萜，结构通式及编号的结构通式如下：

式中A环为芳香化的玫瑰烷型二萜， R₁，R₂，R₃，R₄，R₅分别为氢原子、羟基、卤素原子、甲氧基、氨基、巯基、C1至C8脂肪酸、烷氨基或烷巯基及其光学异构体。

化合物1：R₁、R₃、R₄、R₅=H；R₂ = OH。

化合物2：R₁、R₃、R₄ =H；R₂、R₅ = OH。

化合物3：R₁、R₄ 、R₅=H；R₂、R₅ = OH；R₃ = β-OCH₃

化合物4：R₁、R₃ 、R₅=H；R₂、R₅ = OH；R₄ =α-OCH₃。

化合物5：R₁、R₃、R₄、R₅=H；R₂= H。

化合物6：R₃、R₄、R₅=H；R₁、R₂ = OH。

二.本发明化合物的抗结核分枝杆菌活性评价：

1. 化合物储备液的配制

用DMSO将待测化合物配制成浓度为10 mg/mL的储存液。

2. 显色及光度值测量

将添加完试剂的 96 孔板放入 37℃培养箱培养24 h后，加入刃天青显色液（成分为刃天青的工作液与10% Tween-80按1:1混合），每孔加50 μL。重新将96孔板放入37℃培养箱培养5~6小时，此时可见培养液已有显色反应，此步也可以进行持续监测。5h 后取出，最后在酶标仪 OD 595下检测吸光度值。

3. 本发明的含芳香环基团的玫瑰烷型二萜化合物1-7 均显示了对结核分枝杆菌H37Ra具有抑制作用（表3），特别是化合物6显示出了较强的抗结核分枝杆菌作用。

表3. 化合物1-6 对结核分枝杆菌H37Ra的抑制作用

三.本发明化合物对结核分枝杆菌GlmU蛋白的抑制作用评价

1. GlmU乙酰基转移酶活性测定方法的建立

采用DTNB （Ellman试剂）化学显色法检测GlmU乙酰基转移酶活性。DTNB (5,5’-二巯基-(2-硝基苯甲酸)) 能够与游离SH- 或者含有 SH- 的化合物发生化学反应，自身生成 2-硝基-5-巯基苯甲酸 (TNB^2-)，呈黄色，可在405nm处有吸光值。因此可用此方法来检测产物SH-CoA中含有的还原性SH^-。

DTNB只有在pH中性的溶液中呈无色透明状才能用于检测，在偏酸性的缓冲液里难以溶解，遇到碱性溶液立即分解呈黄色。1 mM DTNB即可用于显色 (50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM DTNB)，可在96孔板中进行。酶促反应体系为50 µl，包括50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM MgCl₂，0.4 mM AcCoA，0.4 mM GlcN-1-P，不同浓度的GlmU蛋白，37 ºC反应5 min；终止体系50 µL包含50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，6 M盐酸胍；检测体系为50 µL 1 mM的DTNB显色液；室温放置5 min即可在405 nm处检测光度变化。

2.化合物对GlmU乙酰基转移酶抑制作用检测

采用DTNB显色法，可在96-孔板中进行。每种化合物首先稀释成不同的使用浓度 (5-100 µM)，在进行酶促反应之前，先将不同浓度、不同种类的化合物分别与0.06 µg GlmU 蛋白在室温下共孵育5 min，阴性对照只为等体积溶剂与GlmU酶的孵育，酶促反应体系为50 µL，反应体系的pH值为8.0，且含有终浓度为20% 甘油以保证酶活性的稳定；孵育后接着加入AcCoA 与GlcN-1-P 使其终浓度达 0.4 mM，在30 ºC下继续反应5 min。由于CBBS为DMSO溶解，有些含有不同程度的颜色，为防止化合物本身以及DMSO对酶活性造成影响，空白对照体系中同样要含有相同浓度的化合物及酶而无底物，以此来消除干扰，每个反应也要分别设立含同样浓度化合物的空白对照来排除化合物本身对DTNB的影响。终止体系50 µL包含50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、6 M盐酸胍，反应结束立即加入。最后加入 1 mM DTNB于96孔板中显色 (50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM DTNB)，室温放置5 min即可在405 nm处检测吸光值变化。将不与化合物孵育的GlmU阴性反应体系吸光值设为1，含不同浓度化合物的反应体系吸光值与其比值作为纵坐标，化合物的浓度为横坐标，绘制不同化合物的抑制直方图。每个反应平行做两遍，计算平均值。

化合物6能够显著抑制结核分枝杆菌GlmU蛋白的乙酰基转移功能，并且表现出了浓度依赖性，如图1所示。化合物6抑制GlmU乙酰基转移功能的IC₅₀ 为 4.807 ug/ml (16.79μM)。同时，抑制动力学研究显示，化合物6对GlmU抑制作用符合竞争性抑制的特点，如图2所示。

3. 通过计算机模拟，对本发明含芳香环基团的玫瑰烷型二萜与GlmU蛋白之间的作用形式及关健作用位点进行了分子对接分析（Docking）。结果显示本发明含芳香环基团的玫瑰烷型二萜均能够作用于GlmU蛋白的C端，该部位为GlmU蛋白发挥乙酰基转移功能的关键区域（图3-8）。同时，分析了本发明含芳香环基团的玫瑰烷型二萜与GlmU蛋白产生相互作用的关键氨基酸，从分子蛋白水平解析了本发明化合物作用于GlmU蛋白，抑制结核分枝杆菌的作用机制（表4）。

表4. 分子对接分析本发明化合物与GlmU蛋白相互作用的关键氨基酸

含芳香环基团的玫瑰烷型二萜、制备方法及在制备抗结核药物中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。