专利摘要

本发明涉及医药技术领域，具体是从重楼属(Paris)植物中分离得到的一种甾体皂苷类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，甾体皂苷类化合物分子式为C58H96O26，化学结构式为：本发明的甾体皂苷类化合物对人肝癌细胞HepG2和人胶质瘤细胞U87MG具有明显的抑制作用，其半数有效抑制浓度(IC50值)分别为16.02±2.67μmol/L和16.98±1.21μmol/L。

权利要求

1.一种从金线重楼中提取的甾体皂苷类化合物，其特征在于：所述甾体皂苷类化合物分子式为C₅₈H₉₆O₂₆，化学结构式为：

上述结构化学名称为(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-Δ⁵⁽⁶⁾-烯-呋甾-3β,26-二羟基-22α-甲氧基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃鼠李糖苷，是从金线重楼中分离的甾体皂苷类化合物，以下简称其为JXZG2。

2.如权利要求1所述的一种从金线重楼中提取的甾体皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.如权利要求2所述的一种从金线重楼中提取的甾体皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述甾体皂苷类化合物可以单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上可以使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从重楼属(Paris)植物中分离的新化合物及用途，具体地说是从传统中药金线重楼中提取分离到一种新的甾体皂苷类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

中药重楼来源于百合科(Liliaceae)重楼属植物，主要分布于亚欧大陆的热带和温带地区，全世界共有24个种，我国种类最多，有19种，以西南各省区的种类和资源最为丰富。本属植物是一类极具药用价值的植物，其根茎在我国有着悠久的药用历史，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊之功效，用于治疗痈疮、毒蛇咬伤、凉风抽搐、咽喉肿痛和跌打伤痛等症。现代药理学研究表明其具有抗肿瘤、抑菌与止血等作用。

金线重楼(ParisdelavayiFranchet)主要分布于四川、云南、湖南和湖北等地，迄今对其化学成分的研究报道甚少。我们对金线重楼总皂苷进行了系统分离，获得了一种新的甾体皂苷类化合物，其化学结构和抗肿瘤活性未见有过报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种从金线重楼中提取的甾体皂苷类化合物及在制备抗肿瘤药物方面的应用。

为此，本发明的目的是这样实现的，一种从金线重楼中提取分离的新的甾体皂苷类化合物，采用高分辨质谱和二维核磁共振谱等光谱技术及化学方法，确定了该化合物的分子式为C₅₈H₉₆O₂₆，化学结构式如下：

上述结构化学名称为(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-Δ⁵⁽⁶⁾-烯-呋甾-3β,26-二羟基-22α-甲氧基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃鼠李糖苷，即(25R)-26-O-β-D-Glc-22-methoxy-5-ene-furost-3β,26-diol-3-O-α-L-Rha(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-[β-D-Glc-(1→4)]-α-L-rhamnopyranoside，是从金线重楼中分离的新的甾体皂苷类化合物，以下简称其为JXZG2。

本发明还提供了从金线重楼中提取的甾体皂苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述甾体皂苷类化合物可以单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上可以使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。

本发明的特点是：式Ι化合物JXZG2苷元与3位糖链结构非常罕见，在本属植物皂苷中首次发现。该化合物对肝癌细胞和胶质瘤细胞有明显的抑制作用，表明其可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。

附图说明

图1是本发明甾体皂苷类化合物JXZG2的HMBC和NOESY相关。

具体实施方式

实施例1：

本实施例提供了该种甾体皂苷类化合物的提取和分离，是从金线重楼中分离获得，分子式为C₅₈H₉₆O₂₆，化学结构式为：

上述结构其化学名称为(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-Δ⁵⁽⁶⁾-烯-呋甾-3β,26-二羟基-22α-甲氧基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃鼠李糖苷，即(25R)-26-O-β-D-Glc-22-methoxy-5-ene-furost-3β,26-diol-3-O-α-L-Rha(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-[β-D-Glc-(1→4)]-α-L-rhamnopyranoside，以下简称其为JXZG2。

制备JXZG2的原料为采自陕西省宝鸡市太白县金线重楼根茎，经粉碎成粗粉后，取6公斤，加入60升浓度为70％的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物680克。提取物分散于8升水中，用石油醚萃取3次，每次8升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次8升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物170克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为10:1:0～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂采用体积比为10:1的水饱和正丁醇-甲醇混合溶剂，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105℃加热显色)，收集R_f值在0.5～0.65处显示紫红色斑点的流份，即为含化合物JXZG2的总皂苷混合物，减压蒸干溶剂后得9.8克样品。样品采用SephdexLH-20(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按20mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含JXZG2的第11～13流份，减压蒸干溶剂后得1.0克样品。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-PackR&DODS-A色谱柱20×250mm，55％乙腈为流动相，流速8mL/min，25℃，206nm紫外检测)，得到JXZG2的纯品20mg。

实施例2：

在实施例1的基础上，对化合物JXZG2的结构进行鉴定：

化合物JXZG2为白色无定形粉末(MeOH)，Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性，提示该化合物可能为一甾体苷类化合物。ESI-MS给出其准分子离子峰m/z1231[M+Na]⁺和m/z1207[M-H]^-，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z1231.6095[M+Na]⁺(calc.forC₅₈H₉₆O₂₆Na1231.6088)，结合¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)数据，如表1所示，确定其分子式为C₅₈H₉₆O₂₆。

分析该化合物的¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)，可观察到在其高场区有7个甲基信号δ0.87(3H，s，CH₃-18)，0.98(3H，d，CH₃-27)，1.04(3H，d，J＝6.9Hz，CH₃-21)，1.08(3H，s，CH₃-19)，1.25(3H，d，J＝6.0Hz，CH₃ofRha)，1.28(3H，d，J＝6.0Hz，CH₃ofRha″)，1.31(3H，d，J＝6.2Hz，CH₃ofRha′)。同时，在其低场区可以看到一个宽单峰的烯氢质子信号δ5.42(1H，brs，H-6)。通过分析其¹³C-NMR、HSQC及其DEPT谱可观察到7个甲基碳信号δ17.0(C-18)，17.4(C-27)，16.3(C-21)，20.0(C-19)，18.1(CH₃ofRha)，18.0(CH₃ofRha′)和18.7(CH₃ofRha″)，一对双键碳信号δ142.0(C-5,C)和δ122.8(C-6,CH)预示1个三取代双键的存在。此外，C-16位与C-22位为连氧碳，其化学位移值分别为δ82.6(一般为δ80.0左右)和δ114.1(一般为δ109.0左右)，这两个碳信号为甾体皂苷中苷元极具特征性信号，易于辨别。C-22位碳信号出现在δ114.1(一般的，对于呋甾烷型甾体皂苷元，当C-22位连有甲氧基时，22位C的化学位移出现在δ113.5)处，较F环闭合时向低场区移了约δ5.1，推测F环开环且C-22位连有甲氧基，再结合该化合物的二维谱图(HSQC，HMBC，TOCSY，NOESY及¹H-¹HCOSY)归属了其苷元上所有的碳、氢信号，见表1，并与已知化合物dichotomin的波谱数据进行对比，发现二者苷元部分的碳和氢数据非常相似，推测具有相同的苷元即呋甾烷型甾体皂苷元；再结合HMBC相关数据分析，可确定该化合物为3位与26位连有糖基的双糖苷。

JXZG2中糖的类型及比例确定通过酸水解结合GC色谱检测等方法得出，结果显示该化合物中D-glucose和L-rhamnose的比例为2:3。通过该化合物的¹H-NMR可以观察到这五个糖的端基质子信号δ5.22(1H，brs，H-1ofRha″)，4.27(1H，d，J＝7.8Hz，H-1ofGlc)，4.87(1H，brs，H-1ofRha′)，5.21(1H，brs，H-1ofRha)和4.53(1H，d，J＝7.8Hz，H-1ofGlc′)，通过HSQC谱可找到相应的糖端基碳信号δ102.5(C-1ofRha″)，104.7(C-1ofGlc)，102.7(C-1ofRha′)，103.3(C-1ofRha)和100.6(C-1ofGlc′)。糖残基的相对构型通过其糖端基氢的偶合常数来确定：葡萄糖的偶合常数均为7.8Hz之间，故推测其相对构型为β；虽然鼠李糖的端基氢信号显示为单峰，但通过其C-3和其C-5的化学位移值可推测其相对构型为α。结合TOCSY谱，在¹H-¹HCOSY谱中，从糖的端基氢出发，可归属所有糖的氢信号；再结合HMBC谱，通过HSQC谱将所有糖的碳信号予以归属。

糖与糖之间以及糖与苷元之间的连接顺序和位置是通过HMBC来确定的，通过该化合物的HMBC谱数据，发现质子信号δ5.22(H-1ofRha″)与δ81.0(C-3ofRha′)存在远程相关，质子信号δ4.27(H-1ofGlc)与δ76.1(C-26)存在远程相关，质子信号δ4.87(H-1ofRha′)与δ79.6(C-3ofRha)存在远程相关，质子信号δ5.21(H-1ofRha)与δ72.5(C-3)存在远程相关，δ4.53(H-1ofGlc′)与δ79.4(C-4ofRha)存在远程相关，从而推测Rha″连接Rha′的C-3位，Rha′连接于Rha的C-3位，Glc′连接Rha的C-4位，Glc与苷元C-26位相连成苷，Rha与苷元C-3位相连成苷，至此确定了糖和苷元的连接位点和糖链的连接顺序，以上结果在NOESY谱中进一步得到了验证，如图1所示。

表1式Ι化合物的1H和13C核磁共振数据(测试溶剂：氘代吡啶)

综合以上数据分析，确定化合物JXZG2的化学结构为(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖-Δ⁵⁽⁶⁾-烯-呋甾-3β,26-二羟基-22α-甲氧基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。

实施例3：

对实施例1分离提纯得到的化合物JXZG2进行体外抗肿瘤试验，试验所采用的细胞为人肝癌HepG2细胞(美国ATCC细胞库)；人胶质瘤U-87MG细胞(中科院上海细胞库)；采用常规的MTT法测试。

实施方法为：取在对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞HepG2细胞、U87MG细胞，调整细胞密度至10³～10⁴个/孔，每孔加入100μL。取细胞悬液接种于96孔板上，100μL/孔，置恒温CO₂培养箱中培养24小时后给药，待测化合物储备液用培养基稀释成浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、和80μmol/L，给药100μL/孔，每个浓度设3个复孔，继续培养36h后，每孔加5mg/mLMTT20μL培养4h。吸弃96孔板中孔内培养液，加入150μL/孔DMSO，置摇床上低速振荡10min，用酶联免疫检测仪在波长为490nm处测定每孔的吸光值(OD值)。并计算受试药物对肿瘤细胞的抑制率(计算公式：细胞抑制率＝(阴性对照组OD值-治疗组OD值)/阴性对照组OD值×100％)。再采用SPSS16.0计算半数抑制浓度(IC50)。试验结果见表2。

表2式I化合物JXZG2对2种肿瘤细胞株HepG2与U87MG的抑制作用(IC₅₀值，μmol/L)

结果显示，化合物JXZG2对人肝癌细胞HepG2和人胶质瘤细胞U87MG具有明显的抑制作用，其半数有效抑制浓度(IC₅₀值)分别为16.02±2.67μmol/L和16.98±1.21μmol/L。

甾体皂苷类化合物JXZG2可以单独使用或与其他药物混合，采用常规方法配制成在临床上可以使用的注射剂、或散剂、或丸剂、或片剂、或微囊剂、或软胶囊剂、或膜剂、或膏剂、或酊剂、或颗粒剂、或气雾剂。

本实施例没有详细叙述的测试方法和英文缩写属本行业的公知常识，这里不一一叙述。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

一种从金线重楼中提取的甾体皂苷类化合物及用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。