IPC分类号 : C08G65/00,C08G65/337,C08G65/333,A61K9/107,A61K33/24,A61P35/00,A61K31/365N,A61K31/282N,A61K31/194N,A61K31/44N
专利摘要
本发明提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子、制备方法及其纳米胶束，属于化学合成药物技术领域。该主链含双抗癌药两亲性高分子结构式如式(I)所示，该高分子将四价铂斑蝥素配合物或四价铂去甲基斑蝥素配合物引入聚合物主链中，四价铂斑蝥素或四价铂去甲基斑蝥素配合物为主体，通过酰胺键连接作为疏水段，聚乙二醇链为亲水段，得到的高分子具有较高的抗肿瘤活性和较低的细胞毒性。本发明还提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法。本发明还提供上述主链含双抗癌药两亲性高分子制备得到的纳米胶束。
权利要求
1.一种主链含双抗癌药两亲性高分子，其特征在于，具有式(I)所示结构：
其中， 表示聚乙二醇mPEG-NH2或mPEG-OH；
表示四价铂斑蝥素配合物或四价铂去甲基斑蝥素配合物；
表示二胺。
2.根据权利要求1所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子，其特征在于，所述的二胺为乙二胺、丁二胺或哌嗪。
3.一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，包括如下：
步骤一：将铂(II)化合物与双氧水反应，得到铂(IV)化合物；
步骤二：将步骤一得到的铂(IV)化合物和斑蝥素反应，或者将步骤一得到的铂(IV)化合物和去甲基斑蝥素反应，得到铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物；
步骤三：将步骤二得到的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物和二胺、聚乙二醇反应，得到主链含双抗癌药两亲性高分子。
4.根据权利要求3所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的铂(II)化合物为顺铂、奥沙利铂、卡铂或二价铂双叠氮配合物。
5.根据权利要求4所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的二价铂双叠氮配合物的结构如下：
6.根据权利要求3所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的步骤二的反应温度为65-70℃，反应时间为12-24h。
7.根据权利要求3所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的铂(IV)化合物和斑蝥素的摩尔比为1：(2-6)，铂(IV)化合物和去甲基斑蝥素的摩尔比为1：(2-6)。
8.根据权利要求3所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的将步骤二得到的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物和二胺、聚乙二醇反应，具体步骤为：
①将1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物中，加入二胺反应，得到反应溶液；
②将聚乙二醇加入上述反应溶液中反应，得到主链含双抗癌药两亲性高分子。
9.根据权利要求8所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的铂(IV)斑蝥素配合物、二胺和聚乙二醇摩尔比为1：(0.9-0.95)：(0.2-0.4)；铂(IV)去甲基斑蝥素配合物、二胺和聚乙二醇摩尔比为1：(0.9-0.95)：(0.2-0.4)。
10.根据权利要求8所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的①的反应温度为室温，反应时间为24-72h。
11.根据权利要求8所述的一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，其特征在于，所述的②的反应温度为室温，反应时间为12-24h。
12.权利要求1-2任意一项所述的主链含双抗癌药两亲性高分子制备得到的纳米胶束。
说明书
技术领域
本发明属于化学合成药物技术领域，具体涉及一种主链含双抗癌药两亲性高分子、制备方法及其纳米胶束。
背景技术
自1965年Rosenberg意外地发现了顺铂抗癌活性以来，顺铂、卡铂及奥沙利铂等二价铂药作为癌症化疗药物用以治疗一半以上的癌症，如睾丸癌、膀胱癌、肺癌等。然而，顺铂等铂药几乎缺乏选择性，对正常组织和器官造成了极大的毒副作用，降低了病人对药物的耐受度。更为严重的是，很多癌症对顺铂等铂药表现出先天耐药性，或者在多次化疗后产生后天获得耐药性，都进一步限制了铂药的化疗效用并增加了后期治疗的难度。
二价铂药的“四价化”改性近年来受到了研究者们的重视。八面体结构的四价铂药相比二价铂药，其惰性程度较高，在血液循环中不易水解失活，毒副作用较低，而进入肿瘤细胞后却可以在细胞内还原环境下还原成更具抗癌活性的二价铂药发挥作用，故又称为“四价铂前药”。
然而，就癌症治疗而言单一化疗药物的效果往往是有限的，尤其是针对上述多种机制并存的顺铂耐药性，仅靠铂药自身往往无法获得良好的综合效果。近年来研究与临床结果表明，将两种或两种以上化疗药物同时或先后应用进行联合化疗是一种非常有吸引力的化疗手段，和单独药物化疗相比，联合化疗能够作用于肿瘤细胞不同的分子靶点，最大化不同药物的化疗效果甚至逆转耐药性。然而无论上述哪种四价铂前药形式的联合化疗，依然存在体内分布广，易被代谢，生物利用率低，有时毒副作用还更大等问题。
纳米药物控制释放体系尤其是高分子纳米控制释放体系，能够延长药物血液循环时间，改善药代动力学；增加药物溶解性，控制释放降低药物的毒副作用和免疫原性；通过“EPR效应”在肿瘤部位被动靶向蓄积药物，主动靶向修饰进一步增加肿瘤细胞主动摄取药物。
因此，将四价铂前药，联合化疗以及高分子纳米控制释放体系相结合，设计简单、确定、可控、有效的高分子纳米联合药物输送体系并解决顺铂毒性和耐药性等问题依然有非常大的探索和研究空间。基于此，在本专利申请人选用两亲性嵌段配位高分子纳米体系进行联合药物输送：即针对肿瘤细胞产生顺铂耐药性的细胞内铂药摄取蓄积减少机制、增强的损伤DNA修复机制和解毒机制，选用能够抑制蛋白磷酸酶(PP2A)活性阻断损伤DNA修复的化疗药物去甲基斑蝥素(demethylcantharidin,DMC)与铂药联用，设计主链含双抗癌药高分子胶束体系。该两亲性嵌段配位高分子纳米联合药物输送体系与其它结合四价铂前药的高分子纳米联合药物输送体系有很大的不同：一是通过一步缩聚反应就可以合成主链含有上述两种化疗药物的两亲性嵌段配位高分子并自组装成纳米胶束，制备简单、结构明确；二是含有两种药物的四价铂前药作为单体直接参与聚合，药物间比例精确确定的同时减少了其它辅料提高了药物在体系中的负载比例；三是该体系药物是在主链上的，可以避免突释；而进入细胞后四价铂药在细胞内还原环境下或者光照条件下会还原释放二价铂药，使得胶束主链结构迅速崩解；随后通过溶酶体酸性环境酸解释放去甲基斑蝥素，因此该体系具有非常可控的细胞内靶向药物释放能力；四是该体系同时针对肿瘤细胞产生顺铂耐药性的多种耐药机制即四价铂前药缓和的解毒机制，去甲基斑蝥素阻断的DNA修复机制以及纳米胶束增加的细胞摄取机制，多种机制共同作用下以期彻底逆转顺铂耐药性。本专利研究为解决高分子纳米联合输送体系中的问题提供了全新的设计思路，同时为有效逆转顺铂耐药性和重新认识癌症顺铂耐药性机制等关键科学问题奠定实验研究基础。本专利成果的运用一方面有望在临床上克服目前常用的抗癌药物存在的毒副作用大的缺点，另一方面可通过两亲性嵌段配位高分子纳米联合药物输送体系逆转顺铂耐药性的策略，开辟一条具有实际应用价值的简单、确定、可控、有效的抗癌新路径，具有相当大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子、制备方法及其纳米胶束，该高分子具有较高的抗肿瘤活性和较低的细胞毒性。
本发明首先提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子，具有式(I)所示结构：
其中， 表示聚乙二醇mPEG-NH2或mPEG-OH；
表示四价铂斑蝥素配合物或四价铂去甲斑基蝥素配合物；
表示二胺。
优选的是，所述的二胺为乙二胺、丁二胺或哌嗪。
本发明还提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，包括如下：
步骤一：将铂(II)化合物与双氧水反应，得到铂(IV)化合物；
步骤二：将步骤一得到的铂(IV)化合物和斑蝥素反应，或者将步骤一得到的铂(IV)化合物和去甲基斑蝥素反应，得到铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物；
步骤三：将步骤二得到的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物和二胺、聚乙二醇反应，得到主链含双抗癌药两亲性高分子。
优选的是，所述的铂(II)化合物为顺铂、奥沙利铂、卡铂或二价铂双叠氮配合物。
优选的是，所述的二价铂双叠氮配合物的结构如下：
优选的是，所述的步骤二的反应温度为65-70℃，反应时间为12-24h。
优选的是，所述的铂(IV)化合物和斑蝥素的摩尔比为1：(2-6)，铂(IV)化合物和去甲斑蝥素的摩尔比为1：(2-6)。
优选的是，所述的将步骤二得到的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物和二胺、聚乙二醇反应，具体步骤为：
①将1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入到铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物中，加入二胺反应，得到反应溶液；
②将聚乙二醇加入上述反应溶液中反应，得到主链含双抗癌药两亲性高分子。
优选的是，所述的铂(IV)斑蝥素配合物、二胺和聚乙二醇摩尔比为1：(0.9-0.95)：(0.2-0.4)；铂(IV)去甲基斑蝥素配合物、二胺和聚乙二醇摩尔比为1：(0.9-0.95)：(0.2-0.4)。
优选的是，所述的①的反应温度为室温，反应时间为24-72h。
优选的是，所述的②的反应温度为室温，反应时间为12-24h。
本发明还提供上述主链含双抗癌药两亲性高分子制备得到的纳米胶束。
本发明的有益效果
本发明首先提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子，结构式如式(I)所示，该两亲性高分子将四价铂斑蝥素配合物或四价铂去甲斑蝥素配合物引入高分子主链中，四价铂斑蝥素或四价铂去甲斑蝥素配合物为主体，通过酰胺键连接作为疏水段，聚乙二醇链为亲水段，得到的高分子具有较高的抗肿瘤活性和较低的细胞毒性。
本发明还提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，该方法是将四价铂与斑蝥素或去甲基斑蝥素配合使用，再经酰胺化缩聚生成两亲性嵌段配位直链高分子，该制备方法简单、原料易得。
本发明还提供上述主链含双抗癌药两亲性高分子制备得到的纳米胶束，对制备的纳米胶束进行细胞毒性测试，细胞毒性实验结果表明，本发明提供的纳米胶束对癌细胞如人肺腺癌A549细胞有很强的杀伤效果，提高铂类药物的抗癌效果。
附图说明
图1为本发明实施例4得到的顺铂去甲基斑蝥素配合物的核磁谱图；
图2为本发明实施例4得到的顺铂去甲基斑蝥素配合物的质谱谱图；
图3为本发明实施例4制备得到的顺铂去甲基斑蝥素配合物和本发明实施例4制备得到主链含双抗癌药两亲性高分子mPEG2k-Pt-mPEG2k的红外光谱图；
图4为本发明实施例4制备得到的主链含双抗癌药两亲性高分子mPEG2k-Pt-mPEG2k的GPC谱图；
图5为本发明实施例11制备得到的主链含双抗癌药两亲性高分子药物mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束的DLS图；
图6为本发明实施例11制备得到的主链为双抗癌药两亲性高分子药物mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束的扫描电镜照片；
图7为顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及本发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束分别处理L929细胞24h，48h和72h的细胞毒性曲线图；
图8为顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及本发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束分别处理HeLa细胞24h，48h和72h的细胞毒性曲线图；
图9为顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及本发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束分别处理A549细胞24h，48h和72h的细胞毒性曲线图。
具体实施方式
本发明首先提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子，具有式(I)所示结构：
其中， 表示聚乙二醇mPEG-NH2或mPEG-OH，所述的聚乙二醇的数据分子量优选为1000-5000；
表示四价铂斑蝥素配合物或四价铂去甲基斑蝥素配合物；
表示二胺，所述的二胺优选为乙二胺、丁二胺或哌嗪。
本发明还提供一种主链含双抗癌药两亲性高分子的制备方法，包括如下：
步骤一：将铂(II)化合物与双氧水反应，得到铂(IV)化合物；
步骤二：将步骤一得到的铂(IV)化合物和斑蝥素或去甲基斑蝥素反应，得到铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲斑蝥素配合物；
步骤三：将步骤二得到的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物和二胺、聚乙二醇反应，得到主链含双抗癌药两亲性高分子。
按照本发明，先将铂(II)化合物与双氧水反应，得到铂(IV)化合物，所述的反应温度优选为室温，反应时间优选为12h，所述的铂(II)化合物与30％双氧水的的比例优选为1g铂化合物/ml双氧水(质量/体积)，所述的铂(II)化合物为优选顺铂、奥沙利铂、卡铂、或二价铂双叠氮配合物。
所述的二价铂双叠氮配合物优选为二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CDA)(N3)2]、二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]或二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(pyAA)(N3)2]，所述的c,c-[Pt(II)(CDA)(N3)2]、c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]、c,c-[Pt(II)(pyAA)(N3)2]的结构如下：
按照本发明，将上述得到的铂(IV)化合物和斑蝥素或去甲基斑蝥素溶于溶剂中，所述的溶剂优选为N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)，优选在65-70℃反应12-24h，然后抽干体系中的溶剂，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物，所述的铂(IV)化合物和斑蝥素或去甲基斑蝥素的摩尔比优选为1：(2-6)；所述的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物结构式如下：
按照本发明，将上述得到的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物与二胺进行缩合，具体步骤优选为：将1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到上述铂(IV)斑蝥素配合物的DMF溶液中，或者加入到铂(IV)去甲基斑蝥素配合物的DMF溶液中进行活化，优选在室温下搅拌30-120min，然后加入二胺反应，所述的反应温度优选为室温，反应时间优选为24-72h，所述的二胺优选为乙二胺、丁二胺或哌嗪；铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物中Pt、EDC和NHS的摩尔比优选为(0.4-0.5)：1:1。
将铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物与二胺进行缩合后，用聚乙二醇mPEG-NH2或mPEG-OH进行封端，优选在室温下搅拌12-24h，然后对蒸馏水透析，除去其中未反应单体，最后冷冻干燥，得到主链含双抗癌药两亲性高分子。所述的铂(IV)斑蝥素配合物或铂(IV)去甲基斑蝥素配合物、二胺和聚乙二醇摩尔比优选为1：(0.9-0.95)：(0.2-0.4)。
本发明还提供上述主链含双抗癌药两亲性高分子制备得到的纳米胶束。所述的纳米胶束的制备方法，优选包括以下步骤：
(1)将主链含双抗癌药两亲性高分子溶解在DMF中，得到主链含双抗癌药两亲性高分子溶液，所述的主链含双抗癌药两亲性高分子的质量/体积浓度为1‰至1％；
(2)在搅拌下向主链含双抗癌药两亲性高分子溶液中滴加二次蒸馏水，形成胶束溶液，水体积为DMF溶液体积的3至10倍；
(3)将所形成的胶束溶液进行透析，除去残留溶剂DMF；
(4)将除去溶剂的胶束溶液浓缩到含量0.5至1.0％(w/v)；
(5)冷冻干燥，获得纳米胶束冻干粉针剂。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有抗癌活性的化合物及其制备方法进行详细描述。
实施例1c,c-[Pt(II)(CDA)(N3)2]的制备
(1)1.57g(5mmol)的c,c-[Pt(II)(CDA)Cl2]与1.7g(10mmol)的硝酸银溶于100ml的蒸馏水中，在室温下避光搅拌反应12h，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c,c-[Pt2+(II)(CDA)(H20)2](NO3-)2；
(2)将上述的c,c-[Pt2+(II)(CDA)(H20)2](NO3-)2水溶液与0.65g(10mmol)的叠氮化钠在室温下反应4h，获得二价铂的双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CDA)(N3)2]黄色沉淀。
实施例2c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]的制备
(1)1.14g(10mmol)反式1,2-环己二胺与4.15g(10mmmol)氯亚铂酸钾溶于100ml二次蒸馏水中，避光搅拌反应12h，获得二价铂的配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)Cl2]；
(2)1.9g(5mmol)的c,c-[Pt(II)(CHDA)Cl2]与1.7g(10mmol)的硝酸银溶于100ml的蒸馏水中，在室温下避光搅拌反应12h，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c,c-[Pt2+(II)(CHDA)(H20)2](NO3-)2；
(3)将上述的c,c-[Pt2+(II)(CHDA)(H20)2](NO3-)2水溶液与0.65g(10mmol)的叠氮化钠在室温下反应4h，获得二价铂的双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]黄色沉淀。
实施例3c,c-[Pt(II)(pyAA)(N3)2]的制备
(1)395.5mg(5mmol)吡啶与4.15g(10mmmol)氯亚铂酸钾溶于100ml二次蒸馏水中，避光80℃回流1h，加入2M盐酸70℃回流24h后冷却过滤获得二价铂的配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)Cl2]；
(2)1.9g(5mmol)的c,c-[Pt(II)(pyAA)Cl2]与1.7g(10mmol)的硝酸银溶于100ml的蒸馏水中，在室温下避光搅拌反应12h，过滤法除去沉淀物AgCl，获得二价铂水合物硝酸盐c,c-[Pt2+(II)(pyAA)(H20)2](NO3-)2；
(3)将上述的c,c-[Pt2+(II)(pyAA)(H20)2](NO3-)2水溶液与0.65g(10mmol)的叠氮化钠在室温下反应4h，获得二价铂的双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(pyAA)(N3)2]黄色沉淀。
实施例4
将顺铂Cisplatin(600mg,2mmol)置于烧瓶中，再加入30％双氧水10mL，室温避光搅拌8h后，过滤除去双氧水得到Cisplatin(IV)-(OH)2的黄色粉末；
将得到的Cisplatin(IV)-(OH)2(334mg,1mmol)以及去甲基斑蝥素(336mg,2mmol)溶解于干燥的DMF，并在70℃下充分搅拌反应12h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末顺铂去甲基斑蝥素配合物Cisplatin(IV)-(DMC)2；
将Cisplatin(IV)-(DMC)20.1mmol(67.0mg)，EDC0.12mmol(23mg)和的NHS0.12mmol(13.5mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应30min至溶液澄清，加入乙二胺0.09mmol(5.4mg)常温反应24h，将mPEG2k-NH280mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子mPEG2k-Pt-mPEG2k。
图1为本发明实施例4得到的顺铂去甲基斑蝥素配合物的核磁谱图；图2为本发明实施例4得到的顺铂去甲基斑蝥素配合物的质谱谱图，图1和图2可以说明，各峰都有明确的归属，且积分面积比也对应于结构中H的比例，说明本发明成功的合成了顺铂去甲基斑蝥素配合物。
图3为本发明实施例4制备得到的顺铂去甲基斑蝥素配合物和实施例4制备得到的主链含双抗癌药两亲性高分子mPEG2k-Pt-mPEG2k的红外光谱图，图3可以说明，与小分子单体相比，除具有1645cm-1和1702cm-1处典型的配位羧基和自由羧基中羰基的伸缩振动峰外，出现了明显的PEG中甲基峰，说明本发明成功合成了主链含双抗癌药两亲性高分子。
图4为本发明实施例4制备得到的主链含双抗癌药两亲性高分子mPEG2k-Pt-mPEG2k的GPC谱图，从图4可以看出，本发明成功合成了主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例5
将奥沙利铂Oxaliplatin(795mg,2mmol)置于烧瓶中，再加入30％双氧水10mL，室温避光搅拌8h后，过滤除去双氧水得到Oxaliplatin(IV)-(OH)2的黄色粉末；
将得到的Oxaliplatin(IV)-(OH)2(412mg,1mmol)以及斑蝥素cantharidin(1176mg,6mmol)溶解于干燥的DMF，并在65℃下充分搅拌反应24h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末Oxaliplatin(IV)-(cantharidin)2；
将Oxaliplatin(IV)-(cantharidin)20.1mmol(85.3mg)，EDC0.14mmol(26.8mg)和NHS0.14mmol(16.1mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应60min至溶液澄清，加入丁二胺0.093mmol(8.2mg)常温反应48h，将mPEG2k-NH256mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例6
将卡铂Carboplatin(786mg,2mmol)置于烧瓶中，再加入30％双氧水10mL，室温避光搅拌8h后，过滤除去双氧水得到Carboplatin(IV)-(OH)2的黄色粉末；
将得到的Carboplatin(IV)-(OH)2(455mg,1mmol)以及去甲基斑蝥素(673mg,4mmol)溶解于干燥的DMF，并在70℃下充分搅拌反应16h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末Carboplatin(IV)-(DMC)2；
将Carboplatin(IV)-(DMC)20.1mmol(78.7mg)，EDC0.15mmol(28.7mg)和NHS0.15mmol(17.2mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应120min至溶液澄清，加入哌嗪0.095mmol(8.2mg)常温反应72h，将mPEG5k-NH2100mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例7
将实施例1得到的1g(2.5mmol)的二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CDA)(N3)2]置于50ml蒸馏水中，随后加入10ml30％的双氧水(100mmol)，在室温下反应12h，然后在50℃下反应12h以除去体系中的双氧水，获得轴向双羟基配位的四价铂配合物c,c,t-[Pt(IV)(CDA)(N3)2(OH)2]，简作CDA-Pt(IV)-(OH)2。将上述反应溶液冷冻干燥，获得CDA-Pt(IV)-(OH)2粉末；
将得到的CDA-Pt(IV)-(OH)2(347mg,1mmol)以及去甲基斑蝥素(673mg,4mmol)溶解于干燥的DMF，并在70℃下充分搅拌反应16h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末CDA-Pt(IV)-(DMC)2；
将上述CDA-Pt(IV)-(DMC)20.1mmol(69.8mg)，EDC0.12mmol(23mg)和NHS0.12mmol(13.5mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应30min至溶液澄清，加入乙二胺0.09mmol(5.4mg)常温反应24h，将mPEG1k-NH240mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例8
将实施例2得到的1g(2.5mmol)的二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(CHDA)(N3)2]置于50ml蒸馏水中，随后加入10ml30％的双氧水(100mmol)，在室温下反应12h，然后在50℃下反应12h以除去体系中的双氧水，获得轴向双羟基配位的四价铂配合物c,c,t-[Pt(IV)(CHDA)(N3)2(OH)2]，简作CHDA-Pt(IV)-(OH)2，将上述反应溶液冷冻干燥，获得CHDA-Pt(IV)-(OH)2粉末；
将得到的CHDA-Pt(IV)-(OH)2(427mg,1mmol)以及去甲基斑蝥素(336mg,2mmol)溶解于干燥的DMF，并在70℃下充分搅拌反应12h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末CHDA-Pt(IV)-(DMC)2；
将CHDA-Pt(IV)-(DMC)20.1mmol(77.8mg)，EDC0.14mmol(26.8mg)和NHS0.14mmol(16.1mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应60min至溶液澄清，加入丁二胺0.093mmol(8.2mg)常温反应48h，将mPEG2k-NH256mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例9
将实施例3得到的1g(2.5mmol)的二价铂双叠氮配合物c,c-[Pt(II)(pyAA)(N3)2]置于50ml蒸馏水中，随后加入10ml30％的双氧水(100mmol)，在室温下反应12h，随后在50℃下反应12h以除去体系中的双氧水，获得轴向双羟基配位的四价铂配合物c,c,t-[Pt(IV)(pyAA)(N3)2(OH)2]，简作pyAA-Pt(IV)-(OH)2，将上述反应溶液冷冻干燥，获得pyAA-Pt(IV)-(OH)2粉末；
将得到的pyAA-Pt(IV)-(OH)2(516mg,1mmol)以及去甲基斑蝥素(336mg,2mmol)溶解于干燥的DMF，并在70℃下充分搅拌反应12h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末pyAA-Pt(IV)-(DMC)2；
将pyAA-Pt(IV)-(DMC)20.1mmol(85.2mg)，EDC0.15mmol(28.7mg)和NHS0.15mmol(17.2mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应120min至溶液澄清，加入哌嗪0.095mmol(8.2mg)常温反应72h，将mPEG5k-NH2100mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例10
将顺铂(600mg,2mmol)置于烧瓶中，再加入30％双氧水10mL，室温避光搅拌8h后，过滤除去双氧水得到Cisplatin(IV)-(OH)2的黄色粉末；
将得到的Cisplatin(IV)-(OH)2(334mg,1mmol)以及去甲基斑蝥素(336mg,2mmol)溶解于干燥的DMF，并在70℃下充分搅拌反应12h，然后抽干体系中的DMF，将剩余物质用丙酮溶解，并过滤掉不溶物，将滤液浓缩后乙醚沉降，过滤得到固体并真空抽干，得到白色固体粉末Cisplatin(IV)-(DMC)2；
将Cisplatin(IV)-(DMC)20.1mmol(67.0mg)，EDC0.12mmol(23mg)和的NHS0.12mmol(13.5mg)溶于5mLDMF溶液，搅拌反应30min至溶液澄清，加入乙二胺0.09mmol(5.4mg)常温反应24h，将mPEG2k-OH80mg加入上述溶液，室温搅拌反应24h，然后对水透析除去未反应单体，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药两亲性高分子。
实施例11
将10mg实施例4得到的主链含双抗癌药两亲性高分子溶解在3mLDMF中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加10mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析，除去DMF，浓缩至含量0.1％w/v)，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药的两亲性高分子药物纳米胶束冻干粉，称为mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束。
图5为本发明实施例11制备得到的主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束冻干粉的DLS图，从图5可以看出，胶束的平均粒径为157nm。
图6为本发明实施例11制备得到的主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束冻干粉的扫描电镜照片，从图6可以看出，高分子药物胶束成球型，且没有聚集。
实施例12
将10mg实施例5得到的主链含双抗癌药两亲性高分子溶解在5mLDMF中，置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加20mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析，除去DMF，浓缩至含量为0.5％(w/v)，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药的两亲性高分子药物纳米胶束冻干粉。
实施例13
将10mg实施例7得到的主链含双抗癌药两亲性高分子溶解在5mLDMF中，置于100mL小烧杯中。往其中缓慢滴加50mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析，除去DMF，浓缩至含量约0.8％(w/v)，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药的两亲性高分子药物纳米胶束冻干粉。
实施例14
将10mg实施例8得到的主链含双抗癌药两亲性高分子溶解在2mLDMF中置于50mL小烧杯中，往其中缓慢滴加15mL二次蒸馏水，形成胶束溶液，用截留分子量3500的透析袋对蒸馏水透析，除去DMF。浓缩至含量约1％，冷冻干燥，获得主链含双抗癌药的两亲性高分子药物纳米胶束冻干粉。
实施例15
对本发明实施例11制备的主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束进行细胞毒性测试，分别以L929、HeLa、A549细胞为模型，以实施例11所提供的主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束作为待检测物，将所述待检测物作用于细胞后，观察细胞的存活率情况，以噻唑蓝(MTT)方法考察本发明所述的主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束的细胞毒性，具体操作步骤如下：
1)收集上述对数期细胞，调整细胞悬液的浓度，加入96孔板中，每孔加入100μl，每孔细胞数约5千个；
2)将上述试验样品置于CO2浓度为5％的细胞培养箱中，在37℃，饱和湿度条件下培养12h，使细胞充分贴壁；
3)将主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束按照一定梯度倍数稀释，浓度分别为108μM、54μM、27μM、13.5μM、6.75μM、3.375μM、1.6875μM，然后加入有细胞的96孔板中，每个浓度设三个复孔，培养时间设置为24h,48h,72h；
4)每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml,即0.5％MTT)，继续培养4h，吸去培养基，每孔加150μl的DMSO，摇床低速震荡10min，使结晶充分溶解；
5)酶标仪490nm处检测每个孔的吸光值；
6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)和对照组(细胞、培养基、MTT、DMSO)按照下面公式计算细胞活力：
其中，Abs(sample)为样品组细胞的吸光值；Abs(blank)为空白对照组培养孔中液体的吸光值；Abs(control)为未经过处理实验组细胞的吸光值。
比较例1
分别以L929、HeLa、A549细胞为模型，以顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物作为待检测物，将所述待检测物作用于细胞后，观察细胞的存活率情况，以噻唑蓝(MTT)方法考察本发明所述的主链含双抗癌药两亲性高分子药物纳米胶束的细胞毒性，具体操作步骤如下：
1)收集上述对数期细胞，调整细胞悬液的浓度，加入96孔板中，每孔加入100μl，每孔细胞数约5千个；
2)将上述试验样品置于CO2浓度为5％的细胞培养箱中，在37℃，饱和湿度条件下培养12h，使细胞充分贴壁；
3)将待检测物按照一定梯度倍数稀释，浓度分别为108μM、54μM、27μM、13.5μM、6.75μM、3.375μM、1.6875μM，然后加入有细胞的96孔板中，每个浓度设三个复孔，培养时间设置为24h,48h,72h；
4)每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml,即0.5％MTT)，继续培养4h，吸去培养基，每孔加150μl的DMSO，摇床低速震荡10min，使结晶充分溶解；
5)酶标仪490nm处检测每个孔的吸光值；
6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)和对照组(细胞、培养基、MTT、DMSO)按照下面公式计算细胞活力：
其中，Abs(sample)为样品组细胞的吸光值；Abs(blank)为空白对照组培养孔中液体的吸光值；Abs(control)为未经过处理实验组细胞的吸光值。
图7为顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及本发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束分别处理L929细胞24h(图a)，48h(图b)和72h(图c)的细胞毒性曲线图；图8顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及本发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束分别处理HeLa细胞24h(图a)，48h(图b)和72h(图c)的细胞毒性曲线图；图9顺铂、去甲基斑蝥素、本发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及本发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束分别处理A549细胞24h(图a)，48h(图b)和72h(图c)的细胞毒性曲线图。从图7-9中的曲线可以求出各种药物的IC50值，表1-表3分别是顺铂、去甲基斑蝥素、发明实施例4中顺铂去甲基斑蝥素配合物以及发明实施例11中mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束，分别对L929(表1)、HeLa(表2)、A549(表3)细胞处理24h、48h、72h的IC50值数据汇总。
表1
表2
表3
顺铂具有最小的IC50，顺铂去甲基斑蝥素配合物,以及mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束具有相当的毒性，这证明本发明提供的高分子相对比较安全。顺铂，顺铂去甲基斑蝥素配合物以及mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束随着培养时间的延长，IC50值均有所下降，但顺铂去甲基斑蝥素配合物及mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束下降的趋势更加明显。可能是由于顺铂去甲基斑蝥素配合物及mPEG2k-Pt-mPEG2k纳米胶束均是四价的形式，进入细胞后需要还原的作用才能形成二价顺铂发挥抗癌活性。
本发明提供的主链含双抗癌药两亲性高分子纳米胶束对正常的小鼠成纤维L929细胞杀伤性小，而对癌细胞如人宫颈癌HeLa细胞，以及人肺腺癌A549细胞都有很好的杀伤效果，在降低系统毒性的同时依然能取得与顺铂相当的抗癌活性。由此可知，本发明提供的主链含双抗癌药两亲性高分子纳米胶束具有较高的抗肿瘤活性和较低的细胞毒性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
主链含双抗癌药两亲性高分子、制备方法及其纳米胶束专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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