专利摘要

本发明提供了一种骨架为交联聚丙烯腈或交联聚甲基丙烯腈、功能基为羟基或氨基的多孔树脂粒子及其制备方法。此类树脂是由丙烯腈或甲基丙烯腈、含有2个或2个以上的双键的交联剂、含烯基的功能单体在致孔剂的存在下进行悬浮自由基共聚合，得到多孔聚合物树脂，所得到的多孔聚合物树脂再经过功能基化反应，得到含有功能基羟基或氨基的多孔树脂。该树脂可以用作多肽的固相合成或核苷酸的固相合成的载体。

权利要求

1.一种含有羟基或氨基的交联聚丙烯腈或交联聚甲基丙烯腈的多孔树脂，所述的树脂所包含的含腈基的聚合物骨架和功能基羟基或氨基的结构可用下式表示： 

(R＝H或CH₃，R′＝H，G＝OH) 

或(R＝H或CH₃，R′＝H或CH₃，G＝CONH(CH₂)_nNH₂，其中n＝2～18) 。

2.按照权利要求1所述的多孔树脂的制备方法，所述方法包括丙烯腈或甲基丙烯腈、含有2个或2个以上的双键的交联剂和含烯基的功能单体在致孔剂的存在下进行悬浮自由基共聚合，得到多孔聚合物树脂，所得到的多孔聚合物树脂再经过功能基化反应，得到含有功能基羟基或氨基的多孔树脂。 

3.按照权利要求2所述的多孔树脂的制备方法，所述的含有2个或2个以上的双键的交联剂包括但不限于二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、衣康酸烯丙基酯、三聚氰酸三烯丙基酯、三聚异氰酸三烯丙基酯，所述悬浮共聚合中使用1种或多种含有2个或2个以上的双键的交联剂。 

4.按照权利要求2所述的多孔树脂的制备方法，所述的含烯基的功能单体包括乙酸乙烯酯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，其中丙烯酸酯优选丙烯酸酯甲酯和丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸酯优选甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸乙酯。 

5.按照权利要求2所述多孔树脂的制备方法，所述的致孔剂包括但不限于芳香烃如苯、甲苯、乙苯；脂肪烃如含有6到12个碳的直链或支链烷烃，优选己烷、庚烷、辛烷、十二烷；卤代烃如氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷、氯苯；含4个碳以上的酯，优选乙酸乙酯、乙酸丁酯，含4到12个碳的直链或支链脂肪醇，优选丁醇、己醇、辛醇、2-乙基己醇、环己醇；致孔剂可以是上述的有机溶剂的一种或几种。 

6.按照权利要求2、权利要求3、权利要求4和权利要求5所述多孔树脂的制备方法，所述悬浮聚合中，丙烯腈或甲基丙烯腈在可聚合单体(可聚合单体包括丙烯腈或甲基丙烯腈、功能单体和交联剂)中的含量为50～95％，功能单体在可聚合单体中的含量为0.5％～30％，交联剂在可聚合单体中的含量为5～50％，致孔剂与可聚合单体的比例为0.3/1～2/1，上述含量或比例都以重量计。 

7.按照权利要求2、权利要求3、权利要求4、权利要求5和权利要求6所述多孔树脂的制备方法，所述的多孔聚合物树脂的功能基化反应为：含聚乙酸乙烯酯的树脂与伯胺或仲胺反应使其酯基发生酯的胺解而使树脂引入羟基功能基，所用的胺优选乙二胺、丙胺、丁胺；含聚丙烯酸酯或甲基聚丙烯酸酯的树脂与过量的含2个伯胺基的化合物反应，得到含氨基的树脂，所用的含2个伯胺基的化合物为两端分别带有氨基的含2～18个碳的饱和碳氢链的二胺，优选乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、十二烷二胺、十六烷二胺和十八烷二胺。 

8.按照权利要求1所述的多孔树脂的用途，所述的多孔树脂用于固相多肽合成和固相寡聚核苷酸合成的载体。 

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种含有羟基或氨基的多孔聚交联丙烯腈树脂，此类树脂用于多肽或核酸的固相合成的载体。 

【技术背景】

自从Merrifield发明了固相多肽合成方法以来(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，1963，85，2149)，固相合成方法在多肽合成和核酸合成方面得到了广泛应用。固相合成方法的优点包括：用过量的反应试剂使反应完全；每步的产物都固定于不溶于任何溶剂的固相载体上，因此所需产物与其它过量试剂、催化剂等小分子试剂的分离可通过简单的过滤而实现；在裂解前的所有操作步骤中，固相载体始终处于同一容器中，没有任何机械损失；易实现自动化。 

固相合成方法中的固相载体的性能是成功实现固相合成的关键因素之一。目前固相多肽合成中最广泛使用的载体是低交联聚苯乙烯凝胶树脂，其优点是低交联聚苯乙烯凝胶树脂在固相多肽合成常用的溶剂如二氯己烷、二甲基甲酰胺等中有很高的溶胀度，反应试剂易扩散到反应位点，使反应进行的完全。其缺点是低交联聚苯乙烯凝胶树脂溶胀后的机械强度差，经过很多步反应、洗涤后易破碎；在反应和洗涤过程中使用大量的有机溶剂，不仅降低反应器的效率，也增加合成成本和造成环境污染；不适用于连续柱反应器固相合成的载体。也有用多孔树脂作为固相多肽合成载体的报道，多孔树脂一般都具有较高的交联度，其优点是多孔树脂的机械强度高，在溶剂中的溶胀度小，在反应和洗涤过程中使用溶剂量小，适用于柱法合成。但文献中报道的以聚苯乙烯或聚(甲基)丙烯酸酯为骨架的大孔树脂作为多肽合成的载体合成的多肽的纯度往往较低。最早用于核酸固相合成的载体为多孔玻璃载体，多孔玻璃载体具有表面易功能基化、在溶剂中不溶胀的优点。但多孔玻璃载体具有负载量较低的缺点。后来发展了高交联、多孔聚苯乙烯或聚(甲基)丙烯酸酯类树脂作为核酸合成的载体，其优点是负载量高，但合成的核酸的纯度较低。 

随着近年来多肽和核酸药物研究的巨大进展，越来越多的多肽和核酸药物实现临床应用。而可大规模、低成本地合成多肽和核酸是多肽和核酸药物实现临床应用的必要条件之一，因此开发合成效率高、成本低的多肽和核酸固相合成的载体具有重要的意义。 

【发明内容】

本发明的目的是针对多孔聚苯乙烯或聚(甲基)丙烯酸酯类树脂作为多肽和核酸的固相合成的载体所存在的缺点，发明了一类以交联聚丙烯腈或交联聚甲基丙烯腈为基本骨架、含 有羟基或氨基的大孔树脂作为多肽和核酸的固相合成的载体，该类树脂用于多肽和核酸的固相合成的载体，所合成的多肽和核酸的纯度高，树脂的合成成本低。该类树脂的含腈基的聚合物骨架和功能基的化学结构式如下： 

(R＝H或CH₃，R′＝H，G＝OH) 

或(R＝H或CH₃，R′＝H或CH₃，G＝CONH(CH₂)_nNH₂，其中n＝2～18) 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：丙烯腈或甲基丙烯腈、含有2个或2个以上的双键的交联剂、含烯基的功能单体在致孔剂的存在下进行悬浮自由基共聚合，得到多孔聚合物树脂，所得到的多孔聚合物树脂再经过功能基化反应，得到含有功能基羟基或氨基的多孔树脂。 

上述的含有2个或2个以上的双键的交联剂包括但不限于二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、衣康酸烯丙基酯、三聚氰酸三烯丙基酯、三聚异氰酸三烯丙基酯等，共聚合中使用1种或多种含有2个或2个以上的双键的交联剂。所述的含烯基的功能单体包括：为了在树脂中引入羟基所用的功能单体为乙酸乙烯酯，为了在树脂中引入氨基所用的功能单体为丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。因为最后的功能基化使酯基发生胺解，酯基中醇的部分最后因胺解而脱离树脂，所以所用的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中醇的结构没有特别的限制，优选丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸乙酯。所述的致孔剂为不参与聚合反应、水溶性较小的有机溶剂，包括但不限于：芳香烃如苯、甲苯、乙苯等；脂肪烃如含有6到12个碳的直链或支链烷烃(如己烷、庚烷、辛烷、十二烷等)；卤代烃如氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷、氯苯等；含4个碳以上的酯如乙酸乙酯、乙酸丁酯等；醇如含4到12个碳的直链或支链脂肪醇(如丁醇、己醇、辛醇、2-乙基己醇、环己醇等)。致孔剂可以是上述的有机溶剂的一种或几种。 

具体实施方法是，由丙烯腈或甲基丙烯腈、功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂组成的油相在一定的搅拌下悬浮于含有一定浓度的盐和分散稳定剂的水相中，在一定的温度下聚合一定的时间，将所得到的树脂中的致孔剂去除后即可得到多孔树脂，筛分后得到一定具有一定粒径范围的树脂。所得到的多孔树脂再经过功能基化反应，得到含有羟基或氨基的多孔树脂。聚合温度为50～95℃，聚合时间为1～24小时。 

在上述的悬浮聚合中，丙烯腈或甲基丙烯腈在可聚合单体(可聚合单体包括丙烯腈或甲基丙烯腈、功能单体和交联剂)中的含量为50～95％，功能单体在可聚合单体中的含量为0.5％～30％，交联剂在可聚合单体中的含量为5～50％，致孔剂与可聚合单体的比例为0.3/1～2/1。上述含量或比例都以重量计。 

上述的悬浮聚合可以使用任何油溶性的自由基引发剂，所述聚合引发剂的实例包括过氧化物，例如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、过氧化硬脂酰、二叔己基过氧化物、二叔丁基过氧化物等，或者偶氮化合物，例如偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈、偶氮二异庚腈等。用量为可聚合单体量的0.2～2％。 

在本发明中，分散稳定剂没有特别限制，可以使用任意的分散稳定剂，只要其在悬浮聚合中有分散稳定的作用即可。分散稳定剂的实例包括亲水性保护胶体剂，比如聚乙烯醇、聚丙烯酸、明胶、淀粉和羧基甲基纤维素。分散稳定剂在水相中的用量为0.1～2％。水相中盐的作用是减小油相中各组分在水相中的溶解度，可以用常用的任何水溶性的盐，所述的盐的实例包括氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵等，盐在水相中的用量为0～30％。 

聚合完成后用水洗涤所得树脂，将树脂晾干后通过淋洗或提取的方法将树脂中致孔剂去掉，可以使用任何低沸点有机溶剂作为淋洗或提取剂，淋洗或提取剂包括甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈等。 

为了引入羟基或氨基，上述得到的包含功能单体的树脂进行进一步的功能键化反应。含聚乙酸乙烯酯的树脂与伯胺或仲胺反应使其酯基发生酯的胺解而使树脂引入羟基功能基，反应式如下。所使用的胺没有特别的限制，只要所使用的胺可以使树脂中所含的聚乙酸乙烯酯的酯键胺解即可，优选伯胺，如乙二胺、丙胺、丁胺等。 

含聚丙烯酸酯或甲基聚丙烯酸酯的树脂与过量的含2个伯胺基的化合物反应，得到含氨基的树脂，反应式如下。含2个伯胺基的化合物为两端分别带有氨基的含2～18个碳的饱和碳氢链的二胺，优选乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、十二烷二胺、十六烷二胺和十八烷二胺。 

R＝H或CH₃，R′＝CH₃或C₂H₅，n＝2～18 

【具体实施方式】

下面通过实施例对本发明作进一步说明，应当理解，本发明的内容并不局限于实施例的范围。 

实施例1 

将1.5g聚乙烯醇溶于300mL蒸馏水中(为了加快溶解可适当加热)，再将15g氯化钠溶于其中，将制得的水相加入到装有回流冷凝管、机械搅拌器和温度计的500mL三口瓶中。另外制备包含10.75g丙烯腈、2.5g乙酸乙烯酯、3.75g二乙烯苯(含量为79.6％)、3g三聚异氰酸三烯丙基酯、30g甲苯和0.15g偶氮二异丁腈的有油相，将油相加入到上述的三口瓶中，开动搅拌，通过调节搅拌速度来调节油相在水相中形成的油珠的大小，缓慢升温至60℃反应1小时，然后升高温度至70℃反应6小时，最后再升温至80℃反应2小时。反应结束后，用大量的热水洗涤树脂，自然晾干后置于索氏提取器中，用乙醇提取12小时，得到交联丙烯腈-乙酸乙烯酯共聚物树脂。筛分100～200目的树脂。 

将5g上述的交联丙烯腈-乙酸乙烯酯共聚物树脂悬浮于30mL乙二胺中，在搅拌下加热到30℃反应6小时，然后用去离子水洗涤树脂数次，直至洗涤液呈中性为止。所得树脂真空干燥，得到含羟基的树脂。 

羟基含量的测定：通过树脂与过量Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly)缩合，然后脱除Fmoc保护基，比色法测定所脱除的Fmoc的量，换算得到树脂的羟基含量为527μmol/g。 

羟基含量测定的具体方法是：准确称取～0.2g树脂，悬浮于5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入0.2g Fmoc-甘氨酸、0.15g N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)和0.05g的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下搅拌2小时，用DMF洗涤树脂数次直至洗涤液在301nm处无吸收。然后将所得树脂悬浮于20％哌啶的DMF溶液中，室温搅拌1小时，过滤，收集滤液，用DMF洗涤树脂数次并收集洗涤后的滤液，将所收集的所有滤液合并并定容，适当的稀释后测定其在301nm处的吸光度。通过系列已知浓度的Fmoc-甘氨酸作类似的Fmoc脱除反应并测定吸光值，作出标准曲线。 

实施例2 

与实施例1相同的方法获得交联甲基丙烯腈-乙酸乙烯酯共聚物树脂，与实施例1中不同的是：油相含有11g甲基丙烯腈、2g乙酸乙烯酯、7g二乙烯苯(含量为55.3％)、30g 1，2-二氯乙烷和0.25g偶氮二异丁腈。 

将5g上述的交联丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物树脂悬浮于30mL乙二胺中，在搅拌下加热到60℃反应8小时，然后用去离子水洗涤树脂数次，直至洗涤液呈中性为止。所得树脂真空干燥，得到含羟基的树脂，测定得羟基含量为419μmol/g。 

实施例3 

与实施例1相同的方法获得交联丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物树脂，与实施例1中不同的是：水相中含有3g明胶作为分散稳定剂和60g氯化钠，油相含有19g丙烯腈、1.5g丙烯酸甲酯、4.5g二乙烯苯(含量为55.3％)、25g环己醇和0.25g偶氮二异丁腈。 

将5g上述的交联丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物树脂悬浮于30mL乙二胺中，在搅拌下加热到60℃反应8小时，然后用去离子水洗涤树脂数次，直至洗涤液呈中性为止。所得树脂真空干燥，得到含氨基的树脂。 

氨基含量的测定：通过树脂与过量Fmoc-甘氨酸缩合，然后脱除Fmoc保护基，比色法测定所脱除的Fmoc的量，换算得到树脂的氨基含量为510μmol/g。氨基含量的测定方法同实施例1中羟基含量的测定方法。 

实施例4 

与实施例2相同的方法获得交联聚甲基丙烯腈树脂，与实施例2中不同的是：油相含有油相含有16g甲基丙烯腈、2g丙烯酸甲酯、4.5g二乙烯苯(含量为55.3％)、2.5g三聚氰酸三烯丙基酯、15g甲苯、10g正辛烷和0.25g过氧化苯甲酰，聚合温度为80℃，聚合时间为12小时。 

将5g上述的交联甲基丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物树脂悬浮于30mL乙二胺中，在搅拌下加热到60℃反应8小时，然后用去离子水洗涤树脂数次，直至洗涤液呈中性为止。所得树脂真空干燥，得到含氨基的树脂，氨基含量为484μmol/g。 

实施例5 

将实施例1中获得的含羟基的树脂与RinkAmide键合用于合成多肽。在25mL的圆底烧瓶中将1g实施例1中获得的含羟基的树脂悬浮于10mLDMF，然后加入0.75g RinkAmide连接剂(结构式如下)、0.25mLDIC、0.005g DMAP，在缓慢的磁力搅拌下反应4小时。反应结束后，依次用甲醇、二氯甲烷和DMF洗涤树脂数次，得到含有Rink Amide连接剂的树脂。 

Rink Amide连接剂 

实施例6 

用实施例4中获得的含氨基的树脂替代实施例5中所用的由实施例1中获得的含羟基的树脂，其他操作与实施例5相同，获得Rink Amide连接剂的树脂。 

实施例7 

多肽ACP(65-74)的合成：将实施例5中获得的树脂放入容积为25mL的圆底烧瓶中，加入10mL含20％哌啶的DMF溶液，缓慢的磁力搅拌下反应0.5小时，脱去Fmoc保护基团。反应结束后，依次用甲醇、二氯甲烷和DMF洗涤树脂数次，即可进入接肽反应的循环。 

把上述树脂放入容积为25mL的圆底烧瓶中，加入0.45g的Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly)、0.25mL DIC、0.40g 1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、0.005g DMAP以及10mL DMF，并且于室温在缓慢的磁力搅拌下反应1小时。然后取少量树脂于玻璃试管中，乙醇洗三次，加入几滴5％茚三酮溶液，沸水浴3min，树脂不变色则说明反应完全，否则继续反应。反应完全后，依次用少量的甲醇、二氯甲烷和DMF洗涤树脂数次，即得到Fmoc-Gly-Rink树脂。 

用不同的Fmoc-氨基酸重复上述步骤，最后得到连接有多肽的树脂：Fmoc-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Ile-Asp(otBu)-Tyr(tBu)-Ile-Asn(Trt)-Gly-Rink树脂。 

将0.5g上述连接多肽的树脂放入容积为25mL的圆底烧瓶中，在冰浴中慢慢滴加三氟乙酸/苯甲硫醚/水(95∶2.5∶2.5，体积比)的混合溶液10mL。反应2小时后，撤去冰浴，在常温下继续反应2小时。抽滤，用三氟乙酸洗涤树脂三次，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入8-10倍体积的冰乙醚，放入冰箱中过夜。离心，除去乙醚，真空干燥，得到粗肽。利用HPLC可以分离纯化所需多肽，并且可算得粗肽中ACP(65-74)的纯度为81.3％。 

实施例8 

用实施例6中获得的RinkAmide连接剂的树脂替代实施例7中所用的由实施例5中获得的Rink Amide连接剂的树脂，其他操作与实施例7相同，获得ACP(65-74)多肽，其纯度 为80.6％。Rink Amide连接剂的树脂。 

实施例9 

将1g实施例3获得的含氨基的树脂悬浮于10mL乙腈中，然后加入0.2g DMT-dT-3’-O-丁二酸、0.2g DIC和0.05g DMAP，于室温下反应12小时。所得树脂用乙腈洗涤数次后，悬浮于10mL含10％乙酸酐、0.5％DMAP和2％二异丙基乙基胺的乙腈溶液中，室温下搅拌4小时，所得树脂用乙腈洗涤数次，得到负载DMT-dT的树脂。通过用分光光度法测定用三氯乙酸脱下来的DMT得到的树脂负载DMT-dT的量为184μmol/g。 

用上述的负载DMT-dT的树脂在Applied Biosystems 3400 DNA合成仪上合成寡聚核苷酸dT₁₃，合成规模为100μmol。所得树脂用浓氨水在55℃下处理12小时使核苷酸裂解下来，所得核苷酸的纯度为91.6％。 

实施例10 

用实施例2中获得的含羟基的树脂替代实施例9中所用的由实施例3中获得的含氨基的树脂，其他操作与实施例9相同，获得寡聚核苷酸dT₁₃的纯度为91.0％。 

一种多孔树脂作为固相合成的载体专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。