专利摘要
提供了使用与生物分子偶联的发色聚合物点来分析目标分子的方法、系统、组合物和试剂盒。与现有技术相比，使用发色聚合物点改善了的检测灵敏度和稳定性。在一些方面中，提供了在Western印迹分析中使用与生物分子偶联的发色聚合物点来检测目标蛋白质的方法、系统和试剂盒。还提供了相关方法、系统、组合物和试剂盒。
权利要求
1.一种进行Western印迹分析的方法，所述方法包括：
使用含SDS的凝胶分离蛋白质；
将分离的蛋白质转移至膜；
使具有所述分离的蛋白质的所述膜与包含聚合物点的溶液接触，所述聚合物点与生物分子偶联，所述聚合物点包含半导体聚合物；以及
检测来自所述聚合物点的至少一种信号，所述至少一种信号对应于所述分离的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，所述凝胶包含聚丙烯酰胺、琼脂糖、淀粉或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，所述膜包含硝酸纤维素或氟化聚合物膜。
4.如权利要求3所述的方法，所述氟化聚合物是PVDF。
5.一种用聚合物点检测蛋白质或肽的方法，所述方法包括：
从混合物中分离所述蛋白质或肽；
使分离的蛋白质或肽与包含聚合物点的溶液接触，所述聚合物点与生物分子偶联，所述聚合物点包含半导体聚合物；以及
检测来自所述聚合物点的至少一种信号，所述至少一种信号对应于所述分离的蛋白质或肽；
其中，所述方法包括试验，所述试验含SDS。
6.如权利要求5所述的方法，还包括定量所述蛋白质或肽。
7.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点还包含非半导体聚合物。
8.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点包含：芴聚合物、基于芴的聚合物或共聚物、亚苯基亚乙烯基聚合物或共聚物、亚苯基亚乙炔基聚合物或共聚物、BODIPY基聚合物或共聚物。
9.如权利要求8所述的方法，所述BODIPY基聚合物或共聚物包括具有式(I)的结构的BODIPY衍生物：
其中，R
10.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。
11.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点中的所述聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、PDHF、PFO、PFPV、PFBT、PFTBT、MEH-PPV、CN-PPV、PPE，或其组合。
12.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点还具有聚电解质包衣，所述聚电解质包衣包含选自下组的聚电解质：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。
13.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点还具有聚电解质包衣，所述聚电解质包衣包含聚电解质聚合物，所述聚电解质聚合物的各重复单元包含选自下组的带电基团：羧基、磺酸酯/盐、磷酸酯/盐、氨基、羟基和巯基。
14.如权利要求1或5所述的方法，所述聚合物点包含连接所述聚合物点的官能团。
15.如权利要求14所述的方法，所述官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。
16.如权利要求14所述的方法，所述官能团适用于生物偶联。
17.如权利要求14所述的方法，所述官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。
18.如权利要求1或5所述的方法，所述生物分子是蛋白质、核酸、肽或脂质。
19.如权利要求18所述的方法，所述生物分子是抗体或亲和素。
20.如权利要求18所述的方法，所述蛋白质是一抗、二抗或亲和素。
21.如权利要求1或5所述的方法，所述分离包含SDS-PAGE分离。
22.如权利要求1或5所述的方法，所述检测包括检测皮克量的分离的蛋白质。
23.如权利要求1或5所述的方法，所述检测包括检测小于2皮克的分离的蛋白质。
24.如权利要求1或5所述的方法，还包括使用电磁辐射源激发所述聚合物点。
25.如权利要求24所述的方法，所述电磁辐射源包括灯。
26.如权利要求24所述的方法，所述电磁辐射在激发聚合物点前通过滤光片、多向色镜或其组合。
27.如权利要求24所述的方法，其中，激发所述样品的电磁辐射的峰值波长为200nm至300nm、250nm至350nm、300nm至400nm、350nm至450nm、400nm至500nm、450nm至550nm、500nm至600nm、550nm至650nm、600nm至700nm、650nm至750nm、700nm至800nm、750nm至850nm、800nm至900nm、850nm至950nm，或900nm至1000nm。
28.如权利要求24所述的方法，其中，电磁辐射的两个或多个峰值波长激发所述样品。
29.用于Western印迹分析的包含偶联的聚合物点的组合物，所述Western印迹分析包括在含SDS的凝胶中分离蛋白质或肽，所述聚合物点包含半导体聚合物。
30.一种包含权利要求29所述的组合物的试剂盒。
31.如权利要求30所述的试剂盒，还包含至少一种封闭剂。
32.一种用于检测蛋白质或肽的试剂盒，所述试剂盒包含多个聚合物点，还包含含有SDS的缓冲液或者含有SDS的凝胶，其中各聚合物点包含半导体聚合物和连接于所述聚合物点的官能团。
33.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，各聚合物点还包含非半导体聚合物。
34.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，各聚合物点包含聚合物，其中所述聚合物选自下组：芴聚合物、基于芴的聚合物或共聚物、亚苯基亚乙烯基聚合物或共聚物、亚苯基亚乙炔基聚合物或共聚物、BODIPY基聚合物或共聚物。
35.如权利要求34所述的试剂盒，所述BODIPY基聚合物或共聚物包含具有式(I)结构的BODIPY衍生物：
其中，R
36.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点包含由CN-PPV组成的聚合物。
37.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点中包含的聚合物选自：基于聚((甲基)丙烯酸)-的聚合物、基于聚二烯的聚合物、基于聚(环氧乙烷)的聚合物、基于聚异丁烯的聚合物、基于聚苯乙烯的聚合物、基于聚硅氧烷的聚合物、基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的聚合物、基于聚(2-乙烯基萘)的聚合物、基于聚(乙烯基吡啶)的聚合物、基于聚(碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的聚合物，或基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的聚合物。
38.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点中的聚合物选自：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)、聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)、聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)、聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b-环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)、PDHF、PFO、PFPV、PFBT、PFTBT、MEH-PPV、CN-PPV、PPE，或其组合。
39.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点还具有聚电解质包衣，所述聚电解质包衣包含选自下组的聚电解质：聚(苯乙烯磺酸酯/盐)、聚磷酸酯/盐、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和聚肽。
40.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点还具有聚电解质包衣，所述聚电解质包衣包含聚电解质聚合物，所述聚电解质聚合物的各重复单元包含选自下组的带电基团：羧基、磺酸酯/盐、磷酸酯/盐、氨基、羟基和巯基。
41.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，所述聚合物点包含连接所述聚合物点的官能团。
42.如权利要求41所述的试剂盒，所述官能团选自疏水性官能团、亲水性官能团或其组合。
43.如权利要求41所述的试剂盒，所述官能团适用于生物偶联。
44.如权利要求41所述的试剂盒，所述官能团选自：醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，或其组合。
45.如权利要求30-32中任一项所述的试剂盒，各聚合物点偶联生物分子。
46.如权利要求45所述的试剂盒，所述生物分子是蛋白质、核酸、肽或脂质。
47.如权利要求46所述的试剂盒，所述生物分子是抗体或亲和素。
48.如权利要求46所述的试剂盒，所述蛋白质是一抗、二抗或亲和素。
49.如权利要求31所述的试剂盒，所述封闭剂改变所述偶联的聚合物点的非特异性吸附性质或所述封闭剂改变所述聚合物点的非特异性吸附性质。
50.如权利要求31所述的试剂盒，所述封闭剂与所述多个聚合物点竞争吸附表面或膜。
51.如权利要求31所述的试剂盒，所述封闭剂与所述多个聚合物点竞争结合一种或多种生物分子。
52.如权利要求32所述的试剂盒，还包含用于偶联各所述聚合物点与生物分子的试剂。
53.如权利要求32所述的试剂盒，所述试剂盒还包含膜，所述膜选自硝酸纤维素膜或氟化聚合物膜。
54.如权利要求53所述的试剂盒，所述氟化聚合物是PVDF。
55.如权利要求32所述的试剂盒，还包含PEG、EDL或其组合。
56.如权利要求32所述的试剂盒，其还包含生物分子。
57.一种测定蛋白质或肽的系统，所述系统包含：
与生物分子偶联的聚合物点，其中所述聚合物点包含半导体聚合物；
蛋白质或肽分离平台；
电磁辐射源；
检测器；以及
计算机，所述计算机包含储存有可执行命令的储存装置，所述命令在由处理器执行时导致所述处理器：
运行所述检测器以获取图像，
储存所述图像，以及
分析所述图像；
其中，所述蛋白质或肽分离平台包括含SDS的凝胶分离平台、含SDS的毛细管电泳分离平台，或其组合。
58.如权利要求57所述的系统，所述膜包含硝酸纤维素或氟化聚合物。
59.如权利要求58所述的系统，所述氟化聚合物是PVDF。
60.一种进行Western印迹分析的系统，所述系统包括：
与生物分子偶联的聚合物点，其中所述聚合物点包含半导体聚合物；
含SDS的凝胶；
电泳平台；
电磁辐射源；
检测器；以及
计算机，所述计算机包含储存有可执行命令的储存装置，所述命令在由处理器执行时导致所述处理器：
运行所述检测器以获取图像，
储存所述图像，以及
分析所述图像。
61.如权利要求60所述的系统，所述凝胶包含聚丙烯酰胺凝胶。
62.如权利要求57或60所述的系统，所述电磁辐射源包括灯。
63.如权利要求57或60所述的系统，还包含滤光片、多向色镜或其组合。
64.如权利要求57或60所述的系统，所述检测器包含凝胶成像设备。
65.如权利要求57或60所述的系统，所述检测器包含显微镜。
66.如权利要求57或60所述的系统，所述检测器包含照相机。
说明书
交叉参考
本申请要求2013年3月5日提交的美国临时申请号61/773,044的权益，该申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。
有关联邦资助的研究的声明
本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)的合同号GM085485和国家科学基金会(National Science Foundation)的合同号CHE-0924320下由美国政府支持完成。
背景
Western印迹是一种广泛使用的用于蛋白质分析的实验室技术。在该技术中，蛋白质通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并随后转移至疏水性膜上；随后使用多种标记方法使这些蛋白质可见。
传统的化学发光成像方法基于使用辣根过氧化物酶标记蛋白质。最近荧光检测受到欢迎，因为其灵敏度高且具有多重功能。然而，用于Western印迹的荧光染料往往经历快速光漂白，其降低了重复印迹成像的灵敏度。量子点(Qdots)是一种替代性荧光观察来源，可用于Western印迹分析的应用中。然而，使用量子点的技术需要相对复杂的设置和分析，无法在大多数生物化学实验室中容易地使用。
因此，需要改进的技术来显示蛋白质和肽作为Western印迹分析的一部分。
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供了使用聚合物点(或“Pdot”)进行分析的方法和系统。在某些方面中，本发明提供了用于检测蛋白质的聚合物点的组合物，包括但不限于Western印迹分析。本发明还提供了可包含聚合物点的试剂盒，且在一些实施方式中，提供了适用于使用聚合物点进行Western印迹分析的封闭剂。该封闭剂可用于例如在将聚合物点应用于Western印迹分析时改变非特异性吸附/相互作用。本发明还提供了使用Pdot分析蛋白质或肽样品的系统。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的方法，该方法包括：使用凝胶分离蛋白质；将分离的蛋白质转移至膜上；使含有分离的蛋白质的膜接触包含聚合物点的溶液，该聚合物点与特异性针对至少一些分离的蛋白质的生物分子偶联；以及检测来自聚合物点的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质。
在多个方面中，本发明提供了检测蛋白质或肽的方法，该方法包括：从混合物中分离蛋白质或肽；使分离的蛋白质或肽接触包含聚合物点的溶液，该聚合物点与特异性针对至少一些分离的蛋白质或肽的生物分子偶联；以及检测来自聚合物点的至少一种信号，该至少一种信号对应于分离的蛋白质或肽。
在多个方面中，本发明提供了包含用于Western印迹分析的偶联的聚合物点的组合物和包含该组合物的试剂盒。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的试剂盒，该试剂盒包含聚合物点、偶联生物分子和封闭剂。
在多个方面中，本发明提供了检测蛋白质或肽的系统，该系统包括：与生物分子偶联的聚合物点；蛋白质或肽分离平台；电磁辐射源；检测器；以及包含存储装置并储存可执行命令的计算机，这些命令在由处理器执行时导致处理器运行检测器获取图像、储存图像并分析图像。
在多个方面中，本发明提供了进行Western印迹分析的系统，该系统包括：与生物分子偶联的聚合物点；凝胶；电泳平台；电磁辐射源；检测器；以及包含存储装置并储存可执行命令的计算机，这些命令在由处理器执行时导致处理器运行检测器获取图像、储存图像并分析图像。
附图说明
所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式和附图：
图1A显示0.1％聚乙二醇(PEG)20mM HEPES缓冲液中CN-PPV Pdot和 CN-PPVPdot-链霉亲和素偶联物(CNPPV-Strep)的吸收(虚线)和发射(实线) 光谱以及CN-PPV聚合物的结构。
图1B显示来自英杰公司(Invitrogen)的Qdot 605-链霉亲和素偶联物的吸收和发射光谱。
图1C显示CN-PPV Pdot和CN-PPV-链霉亲和素Pdot的示例性TEM图像；比例尺代表长度50mm。
图1D显示CN-PPV和CN-PPV-链霉亲和素Pdot的示例性动态光散射测量。
图2A-2B显示与Qdot 605-链霉亲和素(图2A)和CN-PPV Pdot-链霉亲和素偶联物(图2B)孵育的抗小鼠IgG-生物素点印迹的图像。图2C和2D分别显示图 2A和2B中所示相应点印迹的经标准化积分强度。
图3A和3B显示不存在相应一抗的情况下(图3A)转铁蛋白和(图3B)胰蛋白酶抑制剂点印迹的图像。CN-PPV Pdot-链霉亲和素偶联物的浓度是1nM。在这些点印迹中没有检测到荧光，因此表明这些Pdot和蛋白质之间不存在明显的非特异性结合。
图3C-3F显示转铁蛋白(图3C和3E)和胰蛋白酶抑制剂(图3D和3F)的点印迹图像和相应的经标准化背景扣除积分强度。将点印迹与相应生物素化抗体和 CN-PPV Pdot-链霉亲和素偶联物孵育。
图4A和4B显示与相应生物素化抗体和CN-PPV Pdot-链霉亲和素偶联物孵育的山羊抗小鼠IgG(图4A)和转铁蛋白(图4B)点印迹在孵育后第14天的经标准化背景扣除积分强度(样品在6℃下储存于TTBS缓冲液中)。
图5A-5D显示完整的Western印迹过程(SDS-PAGE分离，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭并与相应生物素化抗体和CN-PPV Pdot-链霉亲和素偶联物孵育)后转铁蛋白(图5A和5C)和胰蛋白酶抑制剂(图5B和5D)的图像和相应的经标准化背景扣除积分强度。
发明详述
本发明提供了使用聚合物点进行分析的方法、组合物、试剂盒和系统。在多个方面中，本发明提供了进行蛋白质的Western印迹分析的方法、组合物和试剂盒。
在本发明的一些方面中，提供了方法、系统、组合物和试剂盒以使用与生物分子偶联的发色聚合物点检测和分析目标分子。与现有技术相比，使用聚合物点提供了改进的检测灵敏度和稳定性。
本文所用术语“烷基”指直链或支链的饱和的脂族基团，其具有指定数量的碳原子。例如，C1-C6烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基基团包括但不限于：庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任何数目的碳，如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、 1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。该烷基基团通常是单价的，但可以是二价的，例如当烷基基团将两个部分连接到一起时。本文所用术语“杂烷基”指直链或支链的饱和的碳原子脂族基团，其中至少一个碳原子被杂原子(如N、O或S)替换。其他杂原子也可以是有用的，包括但不限于 B、Al、Si和P。
术语“低级”在上文和后文中与有机基团或化合物联用，分别限定特定化合物或基团，其可以是支链或非支链的且具有大于等于7个碳原子，优选大于等于4 个碳原子和(在非支链时)1或2个碳原子。
本文所用术语“亚烷基”指与至少两个基团相连的上文所定义的烷基，即二价烃基基团。与亚烷基相连的两个部分可以与亚烷基的相同或不同原子连接。例如，直链亚烷基可以是-(CH2)n-的二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。
本发明所述基团可以是取代或未取代的。烷基和杂烷基基团(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是多种各种基团，例如烷基、芳基、氰基(CN)、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。取代基可以是反应性基团，例如但不限于氯、溴、碘、羟基或氨基。合适的取代基可选自-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、 -CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-N H-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2 NR’R”、-CN和-NO2，取代基数量为0至(2m'+1)，其中m'为该取代基中碳原子的总数。R'、R"和R″′各自独立地指氢、未取代的(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基、烷氧基或硫代烷氧基，或者芳基-(C1-C4)烷基。当R'和R"连接于同一个氮原子时，它们可与该氮原子一起形成5、6或7元环。例如，-NR'R"包括1-吡咯烷基和 4-吗啉基。从上述有关取代基的讨论中，本领域技术人员应理解，术语“烷基”包括诸如卤代烷基(如-CF3和-CH2CF3)和酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)等基团。
本文所用术语“烷氧基”指具有氧原子的烷基基团，所述氧原子将烷氧基连接至连接点或连接至烷氧基的两个碳。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基还可被本文所述多种取代基取代。例如，这些烷氧基可被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。
本文所用术语“烯基”指直链或支链的2-6个碳原子的烃基，其具有至少一个双键。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。
本文所用术语“亚烯基”指连接至少两个其他基团的上文定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基相连的两个部分可以与亚烯基的相同或不同原子连接。亚烯基包括但不限于：亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基、亚异丁烯基、亚仲丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。
本文所用术语“炔基”指直链或支链的2-6个碳原子的烃基，其具有至少一个三键。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。
本文所用术语“亚炔基”指连接至少两个其他基团的上文定义的炔基，即二价烃基。与亚炔基相连的两个部分可以与亚炔基的相同或不同原子连接。亚炔基包括但不限于：亚乙炔基、亚丙炔基、亚异丙炔基、亚丁炔基、亚仲丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。
本文所用术语“烷基胺”指具有一个或多个氨基的本文所定义烷基。这些氨基可以是伯氨基、仲氨基或叔氨基。烷基胺还可被羟基取代。烷基胺可包括但不限于：乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。氨基可将烷基胺连接至化合物剩余部分连接点，其位于烷基的ω位，或将烷基的至少两个碳原子连接在一起。
本文所用术语“卤素”或“卤化物”指的是氟(化物)、氯(化物)、溴(化物)和碘(化物)。本文所用术语“卤代烷基”指如上文所定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。本文所用术语“卤代烷氧基”指具有至少一个卤素的烷氧基。卤代烷氧基定义为一些或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。烷氧基可被1、2、3或更多个卤素取代。当所有氢都被一种卤素取代时，例如被氟取代时，该化合物是全取代的，例如全氟化的。卤代烷氧基包括但不限于三氟甲氧基、2,2,2,-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。
本文所用术语“环烷基”指饱和的或部分不饱和的单环、稠合二环或桥接多环组成物，其包含3-12个环原子，或指示数量的原子。单环包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。二环和多环包括，例如，降莰烷、十氢化萘和金刚烷。例如，C3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降莰烷。
本文所用术语“亚环烷基”指连接至少两个其他基团的上文定义的环烷基，即二价烃基。与亚环烷基相连的两个部分可以与亚环烷基的相同或不同原子连接。亚环烷基包括但不限于：亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基和亚环辛基。
本文所用术语“杂环烷基”指具有3个环原子至约20个环原子且1至约5个杂原子(如N、O和S)的环系统。也可使用其他杂原子，包括但不限于B、Al、 Si和P。杂原子还可以是氧化的，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。
本文所用术语“亚杂环烷基”指与至少两个其他基团相连的上文定义的杂环烷基。与亚杂环烷基相连的两个部分可以与亚杂环烷基的相同或不同原子连接。
本文所用术语“芳基”指单环或稠合二环、三环或更大的，芳族环组成物，其包含6-16个环碳原子。例如，芳基可以是苯基、苄基、薁基或萘基。“亚芳基”指源自芳基基团的二价基团。芳基可以是被一个、两个或三个选自下组的基团单取代、二取代或三取代的：烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧基-C2-C3-亚烷基；其均任选地被进一步取代，例如如上文定义的那样；或1-或2-萘基；或1-或2-菲基。亚烷基二氧基是与苯基的两个邻近碳原子连接的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。氧基-C2-C3- 亚烷基也是与苯基的两个邻近碳原子连接的二价取代基，例如，氧乙烯或氧丙烯。氧基-C2-C3-亚烷基-苯基的示例是2,3-二氢苯并呋喃-5-基。
芳基可包括但不限于：萘基，苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或双取代的苯基，苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或双取代的苯基，且特别是苯基。
本文所用术语“亚芳基”指与至少两个其他基团相连的上文定义的芳基。与亚芳基相连的两个部分与该亚芳基的不同原子相连。亚芳基包括但不限于亚苯基。
本文所用术语“烷氧基-芳基”或“芳氧基”指其中与芳基相邻的一个部分通过氧原子连接的上文定义的芳基。烷氧基-芳基包括但不限于苯氧基(C6H5O-)。本发明还包括烷氧基-杂芳基或杂芳氧基。
本文所用术语“杂芳基”指含有5至16个环原子的单环或稠合二环或三环芳族环组成物，其中1至4个环原子是杂原子(其各自是N、O或S)。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪吡基、噻吩基，或被例如烷基、硝基或卤素取代(特别是单取代或双取代)的任意其他基团。本发明的合适基团还可包括亚杂芳基和亚杂芳基-氧基，类似于上文关于亚芳基和亚芳基-氧基的描述。
类似地，本文所述芳基和杂芳基可以是取代的或未取代的。芳基和杂芳基的取代基是不同的，例如烷基、芳基、CN、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸、羟基或卤化物。取代基可以是反应性基团，例如但不限于氯、溴、碘、羟基或氨基。取代基可以选自：-卤素、-OR'、-OC(O)R'、-NR'R"、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、 -CONR'R"、-C(O)R'、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR"C(O)2R'、-NR'-C(O)NR"R″′、 -NH-C(NH2)＝NH、-NR'C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O) 2NR'R"、-N3、-CH(Ph)2、数量为0至芳环系统上开放价态的总数；其中R'、R"和 R″′独立地选自：氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
本文所用术语“烷基-芳基”指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分将芳基组分连接至连接点。烷基组分如上文所定义，不同之处在于烷基组分是至少二价的从而连接芳基组分和连接点。在一些情况下，烷基组分可缺失。芳基组分如上文所定义。烷基-芳基的示例包括但不限于苄基。本发明还包括烷基-杂芳基。
本文所用术语“烯基-芳基”指具有烯基组分和芳基组分的基团，其中烯基组分将芳基组分连接至连接点。烯基组分如上文所定义，不同之处在于烯基组分是至少二价的，从而连接芳基组分和连接点。芳基组分如上文所定义。烯基-芳基的示例包括乙烯基-苯基等。本发明还包括烯基-杂芳基。
本文所用术语“炔基-芳基”指具有炔基组分和芳基组分的基团，其中炔基组分将芳基组分连接至连接点。炔基组分如上文所定义，不同之处在于炔基组分是至少二价的，从而连接芳基组分和连接点。芳基组分如上文所定义。炔基-芳基的示例包括乙炔基-苯基等。本发明还包括炔基-杂芳基。
发色聚合物点
本发明提供了包含用于分析蛋白质和肽的发色聚合物点(Pdot)的方法、系统、组合物和试剂盒。Pdot具有使其特别适用于检测蛋白质或其他生物分子的优良光学性质。
聚合物点(Pdot)具有用作检测剂的多种优势。Pdot是荧光、基于聚合物的颗粒，其可采用多种构型，包括但不限于具有均一、同质性组合物的整体聚合物点或具有不同芯和帽结构的聚合物点。Pdot可由单一聚合物制成或可包含聚合物的掺混物。
本文中，术语“聚合物点”、“发色聚合物点”、“荧光聚合物点”、“发色纳米颗粒”和“Pdot”可互换使用以表示包含一种或多种聚合物(如半导体聚合物)的结构，所述聚合物已塌缩为稳定的亚微米尺寸颗粒。术语“发色聚合物”指其中至少一部分聚合物包含发色单元的聚合物，所述发色单元吸收某些波长的光 (范围为UV至近红外光谱)。本发明所述的发色聚合物可以是或不是发光的。
本发明所述聚合物点可包含任何合适的聚合物次单元，其可促进蛋白质或肽 (且特别是蛋白质)的检测。
本文所用术语“聚合物”指由至少两个重复结构单元组成的分子，通常通过共价化学键连接。重复结构单元可以是一种类型的单体，且所得聚合物是均聚物。在一些方面中，这些聚合物包含两种不同类型的单体，或三种不同类型的单体，或更多类型的单体。本领域普通技术人员应理解，不同类型的单体可以多种方式沿聚合物链分布。例如，三种不同类型的单体可沿聚合物随机分布。类似地，应理解，单体沿聚合物的分布可以不同方式呈现。
本发明提供了半导体、非半导体或其组合的Pdot。任何聚合物组合物均可用于本发明，前提是其适用于检测蛋白质和肽，例如在Western印迹分析过程中。
本发明提供了具有所需表面化学和光学性质的Pdot，使其特别适用于根据本发明的方法检测蛋白质。可在生产Pdot的过程中调节Pdot群体的光学性质和官能化程度。具体而言，可根据需要调节Pdot的属性以调控多种光物理性质(如吸光度、发射光亮度和/或发射光颜色)。在某些方面中，这些聚合物点提供预料之外的亮度和/或光稳定性，应注意，在一些情况下，由于颗粒形成，荧光淬灭不增加。此外，聚合物点表面上少量离散官能团可降低Pdot对生物相关分子和/或细胞的非特异性吸附。应理解，具有高亮度和特异性结合能力的聚合物点向用于研究化学和生物系统的成像和检测技术的其他领域提供重要的方面。
本发明使用的发色聚合物可通过塌缩聚合物领域的任何已知方法形成，包括但不限于，依赖沉淀的方法、依赖乳液(如细乳液(mini emulsion)或微乳液(micro emulsion))形成的方法和依赖缩聚的方法。
在一些方面中，Pdot可通过沉淀形成。该技术包括将稀释发色聚合物溶液(例如溶解于有机溶剂中的发色聚合物)快速添加(例如通过超声或剧烈搅拌促进)至过量的非溶剂(但可与有机溶剂互溶，例如水或其他生理上相关的水溶液)中。例如，在一些本文所述方法中，该发色聚合物可首先溶解在溶解性良好的有机溶剂(良好的溶剂，如THF(四氢呋喃))中，之后将THF中溶解的聚合物添加至过量的水或缓冲溶液(其对于疏水性发色聚合物而言是较差的溶剂但可与良好的溶剂 (THF)互溶)中。对所得混合物进行超声或剧烈搅拌以帮助形成发色聚合物点，随后除去有机溶剂以留下充分分散的发色纳米颗粒。在使用该方法的过程中，该发色聚合物应足够疏水以溶解在有机溶剂(如THF)中。在用于偶联至生物分子的侧链上导入高密度的亲水性官能团或导入高密度的亲水性侧链将使所得聚合物在有机溶剂(如THF)中不溶或溶解性差(其方式类似于或等同于聚电解质的行为)。在一些方面中，提供了使用通过其他方法形成的Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒，包括但不限于基于乳液(如细乳液或微乳液)或沉淀或缩聚的多种方法。还可使用具有疏水性官能团的其他聚合物，其中疏水性官能团不影响发色聚合物点的塌缩和稳定性。随后可将纳米颗粒表面上的疏水性官能团转化为亲水性官能团(如通过后官能化)用于生物偶联或将疏水性官能团直接连接至生物分子。后一种方法可使用疏水性和可点击(即落入点击化学领域的化学反应)的官能团特别良好地进行，包括但不限于炔、链炔、叠氮化物、二烯、烯、环辛炔和膦基团。
在一些方面中，提供了使用官能化Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒，所述官能化Pdot可经修饰以形成单分子聚合物点(其可以是单价、二价或多价的)。该修饰是为了从点中除去一些聚合物分子，但仅留下可仅具有一个官能团、两个或更多个官能团的一个分子。在一个实施方式中，经工程改造的表面可用于促进修饰。工程改造的表面可具有某些官能团，例如醛、烯、烷基、炔、链炔、氨基、叠氮化物、羰基、羧基、氰基、环辛炔、二烯、酯、琥珀酰亚胺基酯、卤代烷基、羟基、亚氨基、酮、马来酰亚胺、巯基、磷酸酯/盐、膦、硫酸酯/盐、磺酸酯/盐，其取代的衍生物及其组合。通常，可以使用适用于生物偶联的任何其他官能团。本领域普通技术人员可在例如Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》)(学术出版社(Academic Press)，纽约，1996年或之后的版本)中找到这类官能团。该表面可以是任何颗粒的弯曲的表面或平坦的表面(如盖玻片)。这类表面可以是二氧化硅、金属、半导体、硅和其他聚合物表面。上文所述官能化多分子发色性聚合物点经由任何稳定的物理或化学结合仅通过一个发色聚合物分子连接至表面。该发色聚合物点中的所有游离分子(与表面结合的分子除外)均可移除，例如通过用有机溶剂清洗表面，从而仅保留与表面结合的分子。随后可通过任何物理或化学方法从表面上释放单分子发色点。所得单分子点可以是单价的、二价的或多价的，这取决于初始聚合物分子中官能团的数目。
多种半导体聚合物适用于本发明所述的应用。已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的发射波长来开发半导体聚合物。在多个方面中，提供了使用半导体聚合物的方法、系统、组合物和试剂盒，包括但不限于：聚芴聚合物，包括但不限于，聚(9,9-二己基芴基-2,7-二基)(PDHF)和聚(9,9-二辛基芴基-2,7-二基) (PFO)；基于芴的共聚物，包括但不限于，聚[{9,9-二辛基-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}- 交替-共-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}](PFPV)、聚[(9,9-二辛基芴基-2,7- 二基)-共-(l,4-苯并-{2,l,3}-噻二唑)](PFBT)、聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-共-(4,7- 二-2-噻吩基-2,1,3-苯并噻二唑)](PFTBT)，和聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-共-(4,7- 二-2-噻吩基-2,l,3-苯并噻二唑)](PF-0.1TBT)；亚苯基亚乙烯基聚合物，包括但不限于，聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基亚乙烯基](MEH-PPV)和聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](CN-PPV)；亚苯基亚乙炔基聚合物，包括但不限于，聚(2,5-二(3’,7’-二甲基辛基)亚苯基-1,4-亚乙炔基(PPE)。在一些方面中，可以使用的Pdot含有基于聚苯乙烯的梳状聚合物。基于聚苯乙烯的梳状聚合物的非限制性示例包括：聚苯乙烯接枝丙烯酸、聚苯乙烯接枝环氧乙烷、聚苯乙烯接枝丁醇等。
在一些实施方式中，可以使用的Pdot含有基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物。基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的非限制性示例包括聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝环氧乙烷等。
在一些方面中，可以使用的Pdot含有包含羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔或膦基团的梳状聚合物。
在一些方面中，可以使用的Pdot含有在末端单体单元上官能化的聚合物，例如使用羧基、氨基、巯基、酯、琥珀酰酯、叠氮化物、炔、环辛炔、膦或类似官能团。可以使用的聚合物的示例包括但不限于：聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、聚异丁烯、聚二烯、聚亚苯基、聚乙烯、聚乙二醇、聚丙交酯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚氨酯，其嵌段共聚物，其随机或交替共聚物，等。
在一些方面中，可以使用的Pdot含有具有一个或多个官能化单体单元的共聚物，例如两亲聚合物，包括但不限于：基于聚((甲基)丙烯酸)-的共聚物，如：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b- 甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b- 丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)；基于聚二烯的共聚物，如：聚(丁二烯(1,2加聚)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2 加聚)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加聚)-b-碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)，和聚(异戊二烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)；基于聚(环氧乙烷)的共聚物，如：聚(环氧乙烷 -b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c- 己内酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b- 甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠基酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷 -b-2-甲基噁唑啉)；基于聚异丁烯的共聚物，如聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b- 环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)；基于聚苯乙烯的共聚物，如：聚(苯乙烯-b- 丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处可切割的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)酸、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4- 苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁二烯)、聚(苯乙烯-b-N,N-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-N-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-碘化N-甲基-4-乙烯基吡啶鎓)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共-对氯甲基苯乙烯-b- 丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共-磺酸异戊二烯酯)；基于聚硅氧烷的共聚物，如：聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b- 甲基丙烯酸)；基于聚(二茂铁基二甲基甲硅烷)的共聚物，如：聚(二茂铁基二甲基甲硅烷-b-环氧乙烷)；基于聚(2-乙烯基萘)的共聚物，如：聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、基于聚(乙烯基吡啶和碘化N-甲基乙烯基吡啶鎓)的共聚物，如：聚(2-乙烯基吡啶-b- 环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(碘化N-甲基2-乙烯基吡啶鎓-b- 环氧乙烷)、聚(碘化N-甲基4-乙烯基吡啶鎓-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶 -b-环氧乙烷)PEO端功能性OH；以及基于聚(乙烯基吡咯烷酮)的共聚物，如：聚(乙烯基吡咯烷酮-b-D/L-交酯)；等。
在本发明的一些方面中，用于检测的Pdot可包含聚合物CN-PPV，其是一种亮、紧密且发橙色光的半导体聚合物点，也称作聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)]。CN-PPV具有优良的荧光性质，例如大吸收截面、高量子产率和快发射速率。
在一些方面中，用于检测蛋白质和肽的Pdot可包含基本由CN-PPV组成的聚合物。在一些方面中，该纳米颗粒包含CN-PPV和至少一种其他材料。例如，CN-PPV 可与提供其他功能的共聚物或其他材料混合。
在一些方面中，用于检测蛋白质和肽的聚合物点可包含具有至少两个不同发色单元的半导体共聚物。例如，偶联的共聚物可含有以给定比例存在的芴和苯并噻唑发色单元。用于合成半导体共聚物的典型发色单元包括但不限于：芴单元、亚苯基亚乙烯基单元、亚苯基单元、亚苯基亚乙炔基单元、苯并噻唑单元、噻吩单元、咔唑芴单元、硼-二吡咯亚甲基单元，及其衍生物。不同的发色单元可以是隔离的 (如同在嵌段共聚物中那样)或掺杂的。本文中，通过书写主要发色物质的种类来表示发色共聚物。例如，PFBT是含有特定比例的芴和苯并噻唑单元的发色聚合物。在一些情况下，连接号用于表示次要发色物质的百分比，之后是次要发色物质的种类。例如，PF-0.1BT是含有90％PF和10％BT的发色共聚物。
在某些方面中，这些聚合物点可包含半导体聚合物的掺混物。这些掺混物可包含均聚物、共聚物和寡聚物的任意组合。可选择用于形成聚合物点的聚合物掺混物以调节所得聚合物点的性质，例如，实现聚合物点的所需激发或发射光谱。
对于一些试验，半导体Pdot提供改进的检测灵敏度，部分因为其显示高于其他荧光报道物的量子产率。在一些方面中，所用Pdot的量子产率是超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％。
对于一些试验，半导体Pdot提供改进的检测灵敏度，部分因为其显示比其他荧光报道物更快的发射速率。在某些方面中，所用Pdot的发射速率为约0.1纳秒至约50纳秒。
在一些方面中，所用发色聚合物点包含携带以下单元的聚合物：小有机染料分子、金属复合物、光发色染料(photochotochromic dye)及其任意组合，例如，无光学活性聚合物，如与小有机染料、金属复合物、光发色染料及其任意组合共价连接或接枝的聚苯乙烯。这些染料或金属复合物可具有蛋白质传感能力。
在一些方面中，提供了使用Pdot的方法、系统、组合物和试剂盒，所述Pdot 包括与作为发射单元的小有机染料分子、金属复合物、光致变色染料及其任意组合共价连接的半导体聚合物。这类发射单元可调节发射颜色、提高量子产率并改善发色聚合物点的光稳定性。
在一些方面中，这些小有机染料或金属复合物可具有传感功能，并因此向发色聚合物点赋予额外的功能，例如蛋白质传感能力。
在一些方面中，该Pdot可包含一种半导体聚合物，其与其他发色聚合物(如与小有机染料、金属复合物、光致变色染料及其任意组合共价连接或接枝的无光学活性聚合物)物理混合或化学交联，从而具有额外的功能(如蛋白质传感)。
在一些方面中，该Pdot可包含半导体聚合物，其与其他组分(如荧光染料、无机发光材料、磁性材料、金属材料等)物理混合或化学交联，从而调节发射颜色、改进量子产率和/或光稳定性，和/或提供额外的功能(如磁性功能、等离振子共振功能等)。
本发明提供的纳米颗粒的大小以“临界尺寸”定义，其表示纳米颗粒的最小尺寸。许多纳米颗粒的形状大致为球形，这导致临界尺寸是球形颗粒的半径或直径。虽然典型的纳米颗粒(如纳米球和纳米管)在尺寸上是完全纳米的，但并非纳米颗粒的所有尺寸都需要是纳米级。例如，纳米圆柱体可具有纳米级的直径但具有微米级的长度。
在一些方面中，所用Pdot的临界尺寸是30nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是25nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是20nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是15nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是10nm或更小。在一些方面中，该临界尺寸是5nm或更小。
在一些方面中，所用Pdot的临界尺寸为大于1nm且小于1000nm。
该纳米颗粒的可能形状是基本不受限制的。然而，在某些方面中，该形状选自球形、圆柱形、椭圆形、多面体、棱镜形、杆状和线状。本领域技术人员应理解，纳米颗粒的形状可影响检测性质(例如，纳米杆的光学性质不同于纳米球)。
纳米颗粒的纳米级尺寸是必要的，从而绕过大颗粒尺寸带来的问题。例如，在将纳米颗粒连接至目标分子(如蛋白质)以进行光致发光成像时，相对大的颗粒具有较大的表面积用于与目标以外的分子非特异性结合，或使目标以外的分子吸收至表面。
对提供的纳米颗粒进行优化以用作可连接至目标分子的光致发光报道物，作为分析方法、系统或试剂盒的一部分。这些纳米颗粒应能够使用光致发光容易地检测到并应对其目标分子具有特异性。
可通过改变给定Pdot的组成和几何形状来调节其光学性质(如吸收波长)。已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的吸收波长来开发半导体聚合物。在一些方面中，所用Pdot的峰值吸收波长为约200nm至约300nm、约250nm 至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500 nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约 600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm 至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm，或约900nm至约 1000nm。
已使用范围为UV至红外(包括整个可见光谱)的发射波长来开发半导体聚合物。在一些方面中，所用Pdot的峰值发射波长为约200nm至约300nm、约250 nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约 500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm 至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm、约900nm至约1000 nm、约950nm至约1050nm、约1000nm至约1100nm、约1150nm至约1250nm、或约1200nm至约1300nm。
在一些方面中，提供的方法、系统、组合物和试剂盒将利用具有窄带发射(narrow-band emission)的Pdot。窄带发射对于某些应用是有利的，包括但不限于多重应用。聚合物点的发射波长可在紫外至近红外区域中变化。发射带的半宽度 (FWHM)小于70nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约65nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约60nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约55nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约50nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约45nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约40nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约35nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约30nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约25nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约20nm。在一些实施方式中，该FWHM小于约10nm。在一些实施方式中，本发明所述聚合物点的FWHM的范围可以是约5nm至约70nm、约10nm至约60nm、约20nm 至约50nm，或约30nm至约45nm。
在一些实施方式中，用于制备Pdot的窄带发射聚合物包括硼-二吡咯亚甲基 (4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯(indacene)，BODIPY)和或其衍生物，和/或其他含硼单体及其衍生物，作为窄带单体。BODIPY和其他含硼单体及其衍生物包括但不限于其烷基衍生物、芳基衍生物、炔衍生物、芳族衍生物、醇盐衍生物、氮杂衍生物、BODIPY扩展系统和其他BODIPY衍生物。窄带发射聚合物还可包括任何其他单体。基于BODIPY的单体可以是能量受体且其他单体可以是能量供体，从而使最终Pdot可表现出窄带发射。良好溶剂中的窄带发射发色聚合物可显示宽发射或窄发射。具有窄带发射的Pdot(包括BODIPY和其他含硼单体及其衍生物)的综合性描述参见WO2013/101902，其通过引用全文纳入本文。
本领域普通技术人员应理解，本文定义的多个化学术语可用于描述本发明的聚合物和单体的化学结构。例如，多种单体衍生物(如BODIPY衍生物)可包括本发明所述多种化学取代基和基团。例如，在一些实施方式中，多种单体的衍生物可被氢、氘、烷基、芳烷基、芳基、烷氧基-芳基、N-二烷基-4-苯基、N-二苯基-4- 苯基、N-二烷氧基苯基-4-苯基、氨基、硫化物、醛、酯、醚、酸和/或羟基取代。
本发明可包括聚合物点，例如窄带发射发色聚合物点。如本文中进一步描述的那样，本发明包括多种表现出窄带发射性质的聚合物点(如FWHM小于 70nm)。如本文中进一步描述的那样，本发明的多种聚合物点可包括具有窄带发射单元的聚合物(如窄带单体和/或窄带单元)。例如，本发明可包括均聚物或杂聚物，其包含窄带单体，如BODIPY和/或BODIPY衍生物单体、方酸菁和/或方酸菁衍生物、金属复合物和/或金属复合物衍生物单体、卟啉和/或卟啉衍生物单体、酞菁和/或酞菁衍生物单体、镧系复合物和/或镧系复合物衍生物单体、二萘嵌苯和/或二萘嵌苯衍生物单体、花青和/或花青衍生物单体、若丹明和/或若丹明衍生物单体、香豆素和/或香豆素衍生物单体，和/或呫吨和/ 或呫吨衍生物单体。窄带单元可以是，例如，窄带单体或荧光纳米颗粒，其包埋在聚合物点中或与聚合物点相连。该荧光纳米颗粒可以是，例如，量子点。窄带单元还可包括聚合物和荧光染料分子，其在本发明的聚合物点中生成窄发射。
多种其他BODIPY衍生物可用于本发明。BODIPY和BODIPY衍生物可进行聚合以形成聚合物(如均聚物或杂聚物)和/或可连接(如共价连接)至聚合物主链、侧链和/或末端。在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(I)的结构：
其中，R
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(II)的结构：
其中，R
在一些实施方式中，本发明的发色聚合物点可包括包含窄带单体的聚合物，所述窄带单体具有式(III)的结构：
其中，R
使用聚合物点进行分析的系统和方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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