专利摘要

本发明公开了一种中药质量标志物发现方法及黄芩汤质量标志物群。本发明以经典方剂黄芩汤为例，借助于本发明提供的方法，发现了可以基本代替黄芩汤治疗下痢药效的等效化学成分群，该化学成分群与黄芩汤的等效性经细胞模型验证。本发明发现了能代表黄芩汤药效且基本等效的化学成分群，一方面，该化学成分群可以用作黄芩汤的质量标志物用于质量控制，实现基于药效成分的黄芩汤质量控制；另一方面，该化学成分群可以用于制备替代黄芩汤的药物组合物，破解中药材质量参差不齐导致疗效预期不明确以及质量控制难的局面，而且药物组合物为国际公认，可制备成药物走向国际医药市场。

权利要求

1.一种代表黄芩汤治疗下痢药效的等效成分群，其特征在于：由黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A组成，且各成分的含量比例与其在黄芩汤中的含量比例相同。

2.一种组合物在等效替代黄芩汤制备治疗下痢的药物中的应用，其特征在于：该组合物由黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A组成，且各成分的含量比例与其在黄芩汤中的含量比例相同。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及中药质量标志物的发现，具体涉及一种中药质量标志物发现方法及黄芩汤质量标志物群。

背景技术

中药药效物质基础研究是中医药现代化的关键问题之一，是阐释中药整体功效及其作用本质的核心环节，是实现中药安全、有效和质量控制的重要基础。长期以来，中药质量控制手段、质量评价指标及质量标准与中药的有效性关联不强。因此中药产品质量控制的新概念：中药质量标志物(Q-Marker)被提出。中药Q-marker是存在于中药材和中药产品(如中药饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂)中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质，作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制。中药Q-marker是中药质量的标示性物质，必须与中药的有效性密切相关，而中药饮片标准汤剂是中药临床应用的基础标准形式，是中药有效性溯源的核心环节。

目前中药质量标志物研究刚刚起步，有学者提出基于“性-效-物”三元论研究中药质量标志物的策略，该策略依据中医理论研究中药的疗效物质基础及药性和效应的关系，并以元胡止痛滴丸为例进行了研究。然而该方法要求研究者有良好的中医学背景。因此，寻找一种可被广泛接受的中药质量标志物研究策略尤为重要。

网络药理学是基于药物-靶点-疾病网络，通过分析网络拓扑结构，关键蛋白质功能，药物疾病网络库等现有信息，系统的揭示复杂药物协同作用于人体的奥秘，与中药的多成分多靶点机制不谋而合。目前网络药理学多用于中药成分功能解析研究，尚未有应用于中药质量标志物发现研究。因此，应用网络药理学发现中药质量标志物的研究策略对于中药质量标准的建立具有重要意义。

黄芩汤是中医治疗下痢的经典方剂，国内外多项研究均证实其能有效防治化疗所致的胃肠道毒副反应。但黄芩汤组分复杂，真正发挥作用的物质不够明确。因此将黄芩汤作为示范例，说明应用网络药理学研究中药质量标志物的科学性。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种中药质量标志物发现方法；

本发明第二目的在于提供黄芩汤治疗下痢药效的有效成分群；

本发明第三目的在于提供黄芩汤有效成分群在制备治疗下痢的药物中的应用；

本发明第四目的在于提供黄芩汤有效成分群用作黄芩汤质量标志物的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种中药质量标志物的发现方法，所述中药质量标志物为代表该中药药效的有效成分群，包括如下步骤：

步骤S1，采用中药化学成分数据库搜集所述中药中含有的所有已知化学成分；

步骤S2，采用靶点数据库搜集上述所有已知化学成分的作用靶点；

步骤S3，采用疾病靶点数据库搜集该中药药效对应疾病的靶点；

步骤S4，将步骤S2所得到的作用靶点与步骤S3所得到的靶点进行比较，保留共有靶点；

步骤S5，保留所有已知化学成分中作用于共有靶点的化学成分群；

步骤S6，鉴定步骤S5所得化学成分群是否确实存在于所述中药中，并将确实存在于该中药中的化学成分群作为该中药的质量标志物。

一种黄芩汤质量标志物的发现方法，所述黄芩汤质量标志物为代表黄芩汤治疗下痢药效的有效成分群，包括如下步骤：

步骤S1，采用数据库TCMSP和TCMID搜集黄芩汤各单味药含有的所有已知化学成分；

步骤S2，采用数据库drugbank、TCMSP和STITCH搜集所有已知化学成分的作用靶点；

步骤S3，采用数据库PharmGKB、TTD、GAD和OMIM搜集腹泻的靶点；

步骤S4，将步骤S2所得到的作用靶点与步骤S3所得到的靶点进行比较，保留共有靶点；

步骤S5，保留所有已知化学成分中作用于共有靶点的化学成分群；

步骤S6，鉴定步骤S5所得化学成分群是否确实存在于黄芩汤中，并将确实存在于黄芩汤中的化学成分群作为黄芩汤的质量标志物。

另外，研究人员还将208个化学成分与33个共有靶点建立成分-靶点网络图，根据成分-靶点网络图发现蛋白靶标PTGS2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase)、NOS2(Nitric Oxide Synthase 2)、KDR(Kinase Insert Domain Receptor)、TNF(TumorNecrosis Factor)为关键靶标群，这四个蛋白靶标的“度”最高；其中，“度”代表成分-靶点网络图中一个节点直接相连的其他节点的个数。

一种代表黄芩汤治疗下痢药效的有效成分群，包括：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A。

上述有效成分群在制备治疗下痢的药物中的应用。

上述有效成分群作为黄芩汤质量标志物用于控制黄芩汤质量的用途。

本发明的优点：

1、本发明提供了一种发现中药质量标志物的方法，所述中药质量标志物为代表该中药药效的有效成分群；本发明以经典方剂黄芩汤为例，采用本发明提供的方法发现了可以基本代替黄芩汤治疗下痢药效的等效成分群，该化学成分群与黄芩汤的等效性经细胞模型验证；

2、本发明发现了能代表黄芩汤药效且基本等效的化学成分群，一方面，该化学成分群可以用作黄芩汤的质量标志物用于质量控制，实现基于药效成分的质量控制；另一方面，该化学成分群可以用于制备替代黄芩汤的药物组合物，破解中药材质量参差不齐导致疗效预期不明确以及质量控制难的局面，而且药物组合物为国际公认，可制备成药物走向国际医药市场。

附图说明

图1为黄芩汤所有759个已知化学成分中作用于33个共有靶点的208个化学成分与33个共有靶点建立成分-靶点网络图；

图2为黄芩汤色谱图；

图3为对照组0、24h划痕区域面积变化示意图；

图4为各药物对LPS诱导的NCM460细胞迁移能力的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：黄芩汤质量标志物的发现

一种黄芩汤质量标志物的发现方法，所述黄芩汤质量标志物为代表黄芩汤治疗下痢药效的有效成分群，包括如下步骤：

步骤S1，采用数据库TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)和TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)搜集黄芩汤各单味药含有的所有已知化学成分；考虑到黄芩汤主要用来治疗胃肠道损伤，黄芩汤中未被吸收入血或脑的成分也可能发挥治疗作用，因此在上述数据库中以DL≥0.05(druglikeness，代表化合物类药性)进行筛选；结果共筛到186个成分来自黄芩，111个成分来自芍药，236个成分来自甘草，226个成分来自大枣；

步骤S2，采用数据库drugbank(https://www.drugbank.ca/)、TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)和STITCH(http://stitch.embl.de/)搜集上述759个化学成分的已知作用靶点；

步骤S3，采用数据库PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、GAD(https://geneticassociationdb.nih.gov/)和OMIM(http://www.omim.org/)搜集腹泻的靶点，共64个；为便于后续靶点比较，本实验使用UniProt(http://www.uniprot.org/)数据库，通过输入蛋白名称并限定物种为人，将检索得到的所有蛋白靶标校正为其官方名称；

步骤S4，将步骤S2所得作用靶点与步骤S3所得靶点进行比较，保留共有靶点33个；

步骤S5，保留所有759个已知化学成分中作用于33个共有靶点的208个化学成分作为化学成分群；另外，研究人员还使用软件Cytoscape 3.4.0将208个化学成分与33个共有靶点建立成分-靶点网络图(如图1所示)，根据成分-靶点网络图发现蛋白靶标PTGS2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase)、NOS2(Nitric Oxide Synthase 2)、KDR(Kinase Insert Domain Receptor)、TNF(Tumor Necrosis Factor)为关键靶标群，这四个蛋白靶标的“度”最高；其中，“度”代表成分-靶点网络图中一个节点直接相连的其他节点的个数；

步骤S6，鉴定步骤S5所得化学成分群是否确实存在于黄芩汤中，并将确实存在于黄芩汤中的化学成分群作为黄芩汤的质量标志物，包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A。

其中，步骤S6的鉴定过程如下：

黄芩汤样品制备：黄芩、芍药、甘草、大枣(9g：6g：6g：6g)，400mL双蒸水冷浸30min，调节平板加热器显示温度为330℃，加热20min(约17min后沸腾)，调节温度至285℃，加热80min。四层纱布过滤，取滤液。滤渣加270mL双蒸水，调节温度至330℃，加热15min，然后调节温度至285℃，加热60min。再四层纱布过滤，合并两次的滤液为黄芩汤水煎液。放置室温，4℃储存。-80℃冻2-4小时，冷冻干燥。每一份定容到27mL备用。

黄芩汤样品前处理：取1mL中药水提液加入1mLDMSO助溶，涡旋3min；用80％甲醇溶液定容至5mL，超声处理10min；放冷，补足失重，取1mL，4℃，16000rpm离心10min；0.22μm滤膜过滤进样。

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18rapid resolution HT(2.1×100mm,1.8μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-甲醇(B)二元梯度洗脱系统；流速：0.25mL/min；进样量3μL。

梯度洗脱条件：0-12min为10％-45％B，12-28min为45％-100％B，100％B维持6min，1min内恢复至初始比例，平衡10min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，采用正负离子同时监测模式，雾化气速率：1.5L/min；干燥器压力：100kPa；检测电压：1.85kV；界面电压：-3.5kV；CDL及加热部件温度：200℃；离子累积时间：30ms；质量扫描范围(m/z)：100-1000。

9个质量标志物在黄芩汤中的定量方法如下(标准品外标法)：

黄芩汤样品处理过程同上。

高效液相系统Agilent 1100HPLC system(Agilent Technologies,USA)

色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mmID，5μm)

检测波长芍药苷236nm；黄芩苷，黄芩素，汉黄芩素，甘草素278nm；甘草酸铵250nm；千层纸素A270nm；野黄芩素340nm；去甲汉黄芩素280nm

色谱条件：流动相乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)

洗脱梯度：0-8min,19％A→21％A；8-10min,21％A→35％A；10-18min,35％A→35％A；18-20min,35％A→40％A；20-38min,40％A→40％A；38-43min,40％A→100％A；

柱温：30℃，流速：1.0mL/min。

黄芩汤色谱图如图2所示。

实施例2：黄芩汤质量标志物群与黄芩汤等效性验证

一、试验材料

1、仪器与试剂

DMEM高糖培养基(Boster Biological Technology co.Itd)；RIPM1640(Gibco-Thermo Fisher Scientific，USA)；0.25％胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液(Biological Industries，Israel)；DMSO(美国Sigma公司)；6孔板、24孔板、96孔板(美国Corning公司)；多功能酶标仪(Infinite M200PRO)；生物安全柜、CO2细胞培养箱(ThermoFisher Scientific，USA)TNF-α试剂盒(MULTI SCIENCES LIANKE BIOTECH)；PGE2试剂盒(MEIMIAN)

2、细胞株

本实验应用人源正常结肠上皮细胞NCM460。NCM460细胞培养于正常含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO，USA)的完全培养基中。

二、试验方法和结果

1、对LPS诱导的NCM460细胞迁移能力的影响

本实验称取各化学成分单体(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A)溶于二甲基亚砜中，使用时根据各单体成分在黄芩汤(HQD)中的含量比例进行混合。取对数生长期的NCM460细胞，0.25％胰蛋白酶消化后收集细胞，接种于6孔细胞培养板，每孔约3.0×105个细胞，设对照组、模型组和药物组(成分组合组、HQD组和黄芩苷组)。对照组和模型组给予常规培养液，药物组分别提前24h给予成分组合、HQD和黄芩苷，HQD的终浓度分别为400、200、100μg/mL(以原药材质量计)，成分组合、黄芩苷的终浓度经换算后分别相当于HQD终浓度400、200、100μg/mL。24h后模型组和药物组给予1.0μg/mL LPS。当细胞单层铺满时，用10μL移液器枪头在底部作“一”字划痕，拍照并记录不同时间点的划痕区域面积(图3为对照组0、24小时划痕区域面积的比较，可见随着时间延长，划痕区域面积会越来越小，与细胞迁移能力有关)。观察区域面积用软件Image J计算。按照如下公式计算细胞迁移率(％)：

细胞迁移率(％)＝(1-划痕区域面积/划痕区域初始面积)×100％。

统计学分析为：采用GraphPad Prism 5.0统计软件(GraphPad Software，USA)进行统计分析和图表处理。各组之间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以Dunnett’spost-hot检验进一步检测组间显著性差异。以P<0.05作为具有显著性差异。

结果如表1和图4所示。

表1对LPS诱导的NCM460细胞迁移能力的影响

##表示与对照组相比P<0.01；与模型组相比*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

与对照组相比，模型组NCM460细胞迁移能力显著降低；与模型组相比，成分组合组100、200、400μg/mL预处理后NCM460细胞迁移能力显著升高，且细胞迁移能力略优于相同给药浓度的HQD组(基本等效)，但显著优于相同给药浓度的黄芩苷组。

本领域技术人员知道，下痢与肠道损伤有关，肠道损伤后的愈合能力直接关系到肠道正常功能的恢复。NCM460细胞为人源正常结肠上皮细胞，本领域常采用NCM460细胞划痕愈合试验评价受损肠道的修复能力。上述试验中，相同给药浓度的成分组合与黄芩汤对受损肠道的修复能力基本一致，且成分组合略优，均显著优于相同浓度的黄芩苷。本领域技术人员知道(从图2色谱图也可以看出)，黄芩苷为黄芩汤和成分组合的主要化合物，黄芩汤对受损肠道的修复能力显著优于黄芩苷体现了中药“多成分”治疗的优势；从成分组合(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A)与黄芩汤对受损肠道的修复能力基本一致可以看出，黄芩汤中发挥综合疗效的“多成分”即为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、去甲汉黄芩素、野黄芩素、芍药苷、甘草素、甘草酸和千层纸素A的组合物，该组合物为黄芩汤治疗下痢的药效物质基础。本领域技术人员知道，中药的化学成分极为复杂，虽然其药效是多成分共同发挥作用的结果，但绝非所有成分都对药效具有贡献，寻找发现其中能代表该中药药效且基本等效的化学成分群具有重要意义：一方面，该化学成分群可以用作该中药的质量标志物用于质量控制，实现基于药效成分的质量控制；另一方面，该化学成分群可以用于制备替代该中药的药物组合物，破解中药材质量参差不齐导致疗效预期不明确的局面，而且药物组合物为国际公认，可以走向国际医药市场。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

一种中药质量标志物发现方法及黄芩汤质量标志物群专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。