专利摘要

本发明涉及一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法。将高山被孢霉菌株经过试管斜面培养基和摇瓶培养基逐级放大培养，制备种子液，然后接种于发酵罐中进行发酵培养，将整个发酵过程分为发酵前期、发酵中期和发酵后期3个阶段；转速初始设定为0rpm，溶氧初始设定在100%，在发酵前期，使得溶氧下降后稳定在40%-70%；在发酵中期，将溶氧控制在20%-40%；在发酵后期，将溶氧控制在40%-70%。发酵结束可使高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸占总油脂的百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到55g/L、54%、65%，20.628g/L，花生四烯酸生产强度达到2.292g/(L*d)。

权利要求

1.一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，将高山被孢霉菌株经过试管斜面培养基和摇瓶培养基逐级放大培养，制备种子液，然后接种于发酵罐中进行发酵培养，其特征在于：在发酵过程中，以控制高山被孢霉发酵形态为目标，以发酵溶氧参数为指标，对发酵过程进行分阶段调控，将整个发酵过程分为发酵前期、发酵中期和发酵后期3个阶段；转速初始设定为0rpm，溶氧初始设定在100%，随着菌体浓度增加，溶氧会呈现下降趋势，通过先逐步提高转速，并结合提高风量的操作方法，在发酵前期，使得溶氧下降后稳定在40%-70%；在发酵中期，将溶氧控制在20%-40%；在发酵后期，将溶氧控制在40%-70%。

2.根据权利要求1所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵前期为发酵的0-72小时期间。

3.根据权利要求1所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵前期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1-3VVM，转速控制在0-50转/分钟。

4.根据权利要求1所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵中期为发酵的73-120小时期间。

5.根据权利要求1所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵中期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在0.5-1.5VVM，转速控制在50-200转/分钟。

6.根据权利要求1所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵后期为发酵的121-216小时期间。

7.根据权利要求1所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵后期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1-3VVM，转速控制在100-200转/分钟。

8.根据权利要求3所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵前期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1-2VVM，转速控制在0-50转/分钟，将溶氧控制在40%-55%之间。

9.根据权利要求5所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵中期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在0.8-1.2VVM，转速控制在80-150转/分钟，将溶氧控制在20%-35%之间。

10.根据权利要求7所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：所述发酵后期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1.5-2VVM，转速控制在150-200转/分钟，将溶氧控制在40%-50%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

    自从20世纪90年代以来，人们对健康饮食和营养搭配越来越重视，长链多不饱和脂肪酸逐渐进入人们的视线。长链多不饱和脂肪酸主要包括花生四烯酸（ARA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）。这些脂肪酸不仅仅在组成膜磷脂结构成份中起了重要作用，而且可以作为合成信号分子类二十烷酸（包括前列腺素、凝血恶烷和白三烯等）的前体物质，被广泛应用于医药和化妆品，尤其是婴幼儿食品和营养品领域。

    目前，微生物发酵法生产花生四烯酸油脂的工艺已经进入工业生产阶段。但是，发酵法生产也面临了诸多问题，例如发酵法周期长、葡萄糖转化率低、细胞生物量低、油脂含量低、饱和以及单不饱和脂肪酸含量过高，尤其是发酵过程中菌体形态难以控制等。

    传统生产中使用的发酵罐主要包括机械搅拌式和气升式等。机械搅拌式发酵罐使用功率高，能耗大，同时桨叶剪切力较大，对菌体形态有很大影响，很容易将菌体打碎，呈碎羽毛状。另一方面，气升式发酵罐以鼓进无菌空气为推动力，将发酵液进行翻滚，没有剪切力，但是发酵后期菌体生物量长到一定程度，发酵液密度大，粘度高，气体的推动对发酵液翻腾混合的影响程度显著减弱，溶氧不易控制，菌体形态同样不易控制。然而，菌体形态对菌体生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量等指标有着直接的影响。

    目前高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的普遍水平为：周期10-16天，生物量22-37g/L，花生四烯酸占总油脂含量的33-60%。其中已报道的花生四烯酸含量最高的一组实验周期12.1天、生物量38.3g/L、含油量26.4g/L、花生四烯酸占总油脂的含量达到75%。然而，花生四烯酸的生产强度基本在0.3-1.45g/(L*d)，花生四烯酸净含量报道的最高值也仅仅为18g/L。鉴于发酵周期长、容易引起染菌、生产强度仍然处于较低水平等问题，有进一步提升的空间。此外，目前报道的花生四烯酸净含量较高的实验基本都是在250mL摇瓶、1L、5L、20L小发酵罐的水平上进行的，很少有工业放大中应用较好的实例报道。

   因此，鉴于现有的机械搅拌式发酵罐和气升式发酵罐对菌体形态影响的弊端，对于高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂这样周期长、极好氧且发酵后期粘度显著升高的发酵体系，优化合适的高密度发酵工艺条件，提供出一种能够适合高山被孢霉菌体积累产花生四烯酸油脂的新型工艺，提升菌体生物量和花生四烯酸油脂含量，提高花生四烯酸生产强度，并且付诸于工业化大生产实为必要。

发明内容

    鉴于现有技术的上述问题，本发明的目的是提出一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，其通过以菌体形态为目标，结合机械搅拌式发酵罐和气升式发酵罐的优点，通过对工艺的调控，提高了发酵产能。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，将高山被孢霉菌株经过试管斜面和摇瓶逐级放大培养，制备种子液，然后接种于发酵罐中进行发酵培养，在发酵过程中，以控制高山被孢霉发酵形态为目标，以发酵溶氧参数为指标，对发酵过程进行分阶段调控，将整个发酵过程分为发酵前期、发酵中期和发酵后期3个阶段；在发酵前期，菌体生物量增长旺盛阶段，转速初始设定为0rpm，溶氧初始设定在100%，随着菌体浓度增加，溶氧会呈现下降趋势，通过每间隔4小时将转速提高5rpm，直至50rpm止，使得溶氧下降后能够稳定在40%-70%；在发酵中期，油脂积累阶段，将溶氧控制在20%-40%；在发酵后期，花生四烯酸生物合成阶段，将溶氧控制在40%-70%。

所述发酵前期为发酵的0-72小时期间。

所述发酵前期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1-3VVM（VVM：单位体积单位分钟内通入的气量），转速控制在0-50转/分钟。

所述发酵中期为发酵的73-120小时期间。

所述发酵中期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在0.5-1.5VVM，转速控制在50-200转/分钟。

所述发酵后期为发酵的121-216小时期间。

所述发酵后期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1-3VVM，转速控制在100-200转/分钟。

所述发酵前期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1-2VVM，转速控制在0-50转/分钟，将溶氧控制在40%-55%之间。

所述发酵中期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在0.8-1.2VVM，转速控制在 80-150转/分钟，将溶氧控制在20%-35%之间。

所述发酵后期溶氧控制通过风量和转速控制来实现，风量控制在1.5-2VVM，转速控制在150-200转/分钟，将溶氧控制在40%-50%。

本发明中所采用的高山被孢霉菌株为高山被孢霉菌株R807（CCTCC M 2012118）

    本发明调控原理如下：将发酵步骤分为三个阶段（生物量积累阶段、油脂积累阶段、花生四烯酸生物合成阶段），并且针对不同的阶段采用不同的调控工艺，在生物量积累阶段，种子液刚刚接进发酵罐，菌体活力较低较脆弱，不耐剪切，采用气升罐式的培养方式，高溶氧低剪切，利于高山被孢霉细胞数量的积累。当进入油脂积累阶段，生物量达到一定程度，单一的通气方式不足以给发酵液形成翻腾的效果，配合适宜的搅拌转速，对发酵液的气液混合效果有很好的贡献。在发酵后期花生四烯酸生物合成阶段，适当的降低转速并且提高风量，有利于Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶和Δ5去饱和酶发挥作用，使得花生四烯酸的百分含量上升。

    本发明的有益效果：

    （1）针对菌体前期较脆弱，后期密度过大等问题，结合气升罐溶氧较好和机械搅拌罐桨叶可以提供剪切等优点。通过对工艺的调控，提高了发酵产能，在7.5L罐中花生四烯酸的单位产量达到20.628g/L发酵液，花生四烯酸的生产强度达到2.291g/(L*d)。

    （2）本发明涉及的工艺操作简便，有利于工业化生产。目前已经在7m3和25m3发酵罐水平完成试运行，并且得到很好的收益。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以下实施例中所采用的培养基如下：

试管斜面培养基（PDA斜面培养基）：新鲜去皮马铃薯200g，煮沸后计时30min，4层纱布过滤除去固形物，加葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH自然，121℃灭菌30min。

种子培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄ 3g/L， pH自然，121℃灭菌30min。

发酵培养基：葡萄糖80g/L，酵母膏11g/L，KH₂PO₄ 3.8g/L，NaNO₃ 3.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH自然，121℃灭菌30min。

实施例中所用的菌株为：高山被孢霉菌株R807（CCTCC M 2012118），也可以使用其他类似菌株。

    实施例1 基于溶氧调控策略7.5L罐高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂

    1、菌种的活化以及种子液的制备：选取高山被孢霉菌株R807（CCTCC M 2012118）为出发菌株，将保藏的菌种接入PDA斜面培养基中，于25℃条件下在培养箱中培养10天，转接于装有100mL种子培养基的500mL凹槽瓶中于恒温振荡器中培养，接种量10%（v/v，10mL），培养条件是120rpm，温度25℃，培养时间1-2天。

   2、将步骤1得到的种子液接种到7.5L罐（New Brunswick Scientific, USA）中，装液量5L，接种量为10%（v/v，500mL），培养温度0-120h控制在28℃，121-216h控制在18℃，

发酵初始，种子液刚接进发酵罐，有一段适应期，初始风量为2VVM，搅拌转速初始为50转/分钟，溶氧初始设定100%，发酵的0-72小时期间，为发酵前期，菌体生物量增长旺盛阶段，随着菌体浓度的增加后，溶氧不断下降，通过风量和转速控制来控制溶氧下降后能够稳定在40%-70%，风量控制在1-2VVM，转速初始设定为0rpm，每间隔4小时将转速提高5rpm，直至50rpm止；在发酵的73-120小时期间，为发酵中期，该阶段为油脂积累阶段，通过风量和转速控制将溶氧控制在20%-40%，风量控制在1-1.5VVM，转速控制在150-200转/分钟；在发酵的121-216小时期间，为发酵后期，该阶段为花生四烯酸生物合成阶段，将溶氧控制在40%-70%，风量控制在1-2VVM，转速控制在150-200转/分钟。下表以不同阶段分界点的控制条件为例，见表1。

   表1 

    注：刚刚完成接种时因菌体生物量较低，不易检测，因此0小时未取样检测生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量。

    发酵初始，种子液刚接进发酵罐，有一段适应期，初始风量为2VVM，搅拌转速初始为50转/分钟，溶氧初始设定100%，菌体浓度生长后，溶氧不断下降，控制在40%左右；

    当发酵培养至72小时，菌体生物量增长变缓，此时胞内油脂开始合成，将风量控制在1VVM，搅拌转速控制在150转/分钟，溶氧控制在20%；

   发酵培养至120小时以后，此时罐内菌体浓度过大，发酵液粘度明显上升，将转速控制在200转/分钟，风量控制在2VVM，控制发酵罐内气液混合效果，溶氧控制在50%左右；

    当发酵培养至216小时，发酵结束，取样检测终点的生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量。高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到56.1g/L、53.9%、68.22%，20.628g/L，花生四烯酸生产强度达到2.292g/(L*d)。

    实施例2.基于溶氧调控策略7m3罐发酵高山被孢霉产花生四烯酸

   1、菌种的活化以及种子液的制备：选取高山被孢霉菌株R807（CCTCC M 2012118）为出发菌株，将保藏的菌种接入PDA斜面培养基中，于25℃条件下在培养箱中培养10天，转接于装有100mL种子培养基的500mL凹槽瓶中于恒温振荡器中培养，接种量10%（v/v，10mL），培养条件是120rpm，温度25℃，培养时间1-2天，制备成一级种子液。然后，按照接种量10%（v/v）将一级种子液接入于100L种子罐中，培养条件是200rpm，温度25℃，培养时间1天，制备成二级种子液。接着，将制备好的二级种子液全部接入到3000L种子罐中，培养条件是100rpm，温度25℃，培养时间1天，制备成三级种子液。

    2、将步骤1得到的三级种子液全部接入到7m3发酵罐中，培养温度0-120h控制在28℃，121-216h控制在18℃，其余参数工艺的控制见表2。其中所用的发酵罐的高径比3：1，由南京汇科生物工程设备有限公司制造安装，江苏天凯生物科技有限公司使用及管理，装液量5m3，发酵的0-72小时期间，为发酵前期，菌体生物量增长旺盛阶段，随着菌体浓度的增加后，溶氧不断下降，通过风量和转速控制来控制溶氧下降后能够稳定在40%-45%，风量控制在1-2VVM，转速初始设定为0rpm，每间隔4小时将转速提高5rpm，直至50rpm止；在发酵的73-120小时期间，为发酵中期，该阶段为油脂积累阶段，通过风量和转速控制将溶氧控制在20%-35%，风量控制在0.8-1.2VVM，转速控制在80-150转/分钟；在发酵的121-216小时期间，为发酵后期，该阶段为花生四烯酸生物合成阶段，将溶氧控制在40%-50%，风量控制在1.5-2VVM，转速控制在150-200转/分钟。下表以不同阶段分界点的控制条件为例，控制条件见表2。

    表2 

    注：刚刚完成接种时因菌体生物量较低，不易检测，因此0小时未取样检测生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量。

    发酵初始，种子液刚接进发酵罐，有一段适应期，初始风量为1.5VVM，搅拌转速初始为0，每隔四小时，调节变频器使转速增加5转，达到50转/分钟为止，溶氧初始设定100%，菌体浓度生长后，溶氧不断下降，可以控制在45%左右；

    当发酵培养至72小时，菌体生物量增长变缓，此时胞内油脂开始合成，将风量控制在1VVM，搅拌转速控制在100转/分钟，溶氧控制在20%；

   发酵培养至120小时以后，此时罐内菌体浓度过大，发酵液粘度明显上升，将转速控制在160转/分钟，风量控制在1.7VVM，控制发酵罐内气液混合效果，溶氧控制在40%左右；

    当发酵培养至216小时，发酵结束，取样检测终点的生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量。高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到53.08g/L、57.05%、62.37%，18.887g/L，花生四烯酸生产强度达到2.099g/(L*d)。

    实施例3.基于溶氧调控策略25m3罐发酵高山被孢霉产花生四烯酸

    1、菌种的活化以及种子液的制备：选取高山被孢霉菌株R807（CCTCC M 2012118）为出发菌株，将保藏的菌种接入PDA斜面培养基中，于25℃条件下在培养箱中培养10天，转接于装有100mL种子培养基的500mL凹槽瓶中于恒温振荡器中培养，接种量10%（v/v，10mL），培养条件是120rpm，温度25℃，培养时间1-2天，制备成一级种子液。然后，按照接种量10%（v/v）将一级种子液接入于150L种子罐中，培养条件是200rpm，温度25℃，培养时间1天，制备成二级种子液。接着，将制备好的二级种子液全部接入到5000L种子罐中，培养条件是100rpm，温度25℃，培养时间1天，制备成三级种子液。

    2、将步骤1得到的三级种子液全部接入到25m3发酵罐中，培养温度0-120h控制在28℃，121-216h控制在18℃，发酵的0-72小时期间，为发酵前期，菌体生物量增长旺盛阶段，随着菌体浓度的增加后，溶氧不断下降，通过风量和转速控制来控制溶氧下降后能够稳定在40%-55%，风量控制在1-2VVM，转速初始设定为0rpm，每间隔4小时将转速提高5rpm，直至50rpm止；在发酵的73-120小时期间，为发酵中期，该阶段为油脂积累阶段，通过风量和转速控制将溶氧控制在20%-35%，风量控制在0.8-1.2VVM，转速控制在80-150转/分钟；在发酵的121-216小时期间，为发酵后期，该阶段为花生四烯酸生物合成阶段，将溶氧控制在40%-50%，风量控制在1.5-2VVM，转速控制在150-200转/分钟。下表以不同阶段分界点的控制条件为例，参数工艺的控制见表3。其中所用的发酵罐高径比2.5：1，由湖南益阳市朝阳轻化设备厂制造安装，江苏天凯生物科技有限公司使用及管理，装液量21m3，发酵工艺的控制见表3：

   表3

    注：刚刚完成接种时因菌体生物量较低，不易检测，因此0小时未取样检测生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量。

    发酵初始，种子液刚接进发酵罐，有一段适应期，初始风量为1.5VVM，搅拌转速初始为0，每隔四小时，调节变频器使转速增加5转，达到50转/分钟为止，溶氧初始设定100%，菌体浓度生长后，溶氧不断下降，可以控制在60%左右；

    当发酵培养至72小时，菌体生物量增长变缓，此时胞内油脂开始合成，将风量控制在1VVM，搅拌转速控制在80转/分钟，溶氧可以控制在35%；

    发酵培养至120小时以后，此时罐内菌体浓度过大，发酵液粘度明显上升，将转速控制在150转/分钟，风量控制在1.7VVM，控制发酵罐内气液混合效果，溶氧控制在40%左右；

    当发酵培养至216小时，发酵结束，取样检测终点的生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量。高山被孢霉细胞干重、油脂含量、花生四烯酸百分含量、花生四烯酸的单位产量分别可以达到49g/L、50.42%、63.86%，15.777g/L，花生四烯酸生产强度达到1.753g/(L*d)。

   综合以上实施例可以看出，利用本发明所述的基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法，使得生物量、油脂含量、花生四烯酸百分含量，以及花生四烯酸单位产量和生产强度等多个方面均有大幅度提高。

一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。