专利摘要

本发明公开了一种基于蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜及其在培养干细胞方面的应用。本发明所述复合膜包括蛋清和至少一种甲基丙烯酸衍生化聚合物。本发明利用蛋清为主要原料，在受控的条件下与甲基丙烯酸衍生化聚合物反应制备复合膜，所得复合膜有良好的力学性能和生物学性能，可作为干细胞的支架材料，支撑干细胞生长；另外，本发明不仅能在较低固含量下形成稳定的胶体，而且有利于提高产物的强度，使复合膜内部有足够空间，有利于不同条件下的干细胞生长；同时，本发明可通过调整原料的比例进一步调整支架材料的各方面性能，实现生物学功能精确可控。本发明产品性能可靠，生物相容性好，操作简便，重复性好，易于产业化。

权利要求

1.一种基于蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜，其特征在于，所述复合膜包括蛋清和至少一种甲基丙烯酸衍生化聚合物；

所述复合膜由包括以下步骤的方法制备得到：

S1.制备蛋清溶液：取新鲜蛋清，震荡混匀处理5～10min，转速2000～4000r/min下离心8～20min，取澄清溶液即为蛋清溶液；

S2.合成甲基丙烯酸衍生化聚合物：将明胶、聚乙二醇或糖类，与甲基丙烯酸酐或丙烯酰氯反应，反应产物经后处理干燥后得到可光交联的甲基丙烯酸衍生化聚合物；

S3.制备复合膜：将甲基丙烯酸衍生化聚合物消毒后用纯水溶解，所得溶液与蛋清溶液混合，加入光引发剂得到预聚液，除去气泡，置于模具中紫外光照成膜。

2.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述甲基丙烯酸衍生化聚合物选自甲基丙烯酸酯化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯化糖类中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的复合膜，其特征在于，所述甲基丙烯酸衍生化聚合物为甲基丙烯酸酯化明胶和聚乙二醇二丙烯酸酯，两者的质量比为0.1％～68％：0.1％～85％。

4.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述蛋清在复合膜中的含量为0.5％～95％；所述甲基丙烯酸衍生化聚合物的分子量为250～1000000。

5.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述复合膜的厚度为0.1～3mm。

6.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，步骤S2中所述合成甲基丙烯酸衍生化聚合物的方法为：

当甲基丙烯酸衍生化聚合物为甲基丙烯酸酯化明胶时，按质量体积比1.5～7.5：1，将甲基丙烯酸酐与明胶溶液反应，反应产物透析干燥后得到白色松软的海绵状产物即为甲基丙烯酸酯化明胶；

当甲基丙烯酸衍生化聚合物为聚乙二醇二丙烯酸酯时，将聚乙二醇与二氯甲烷混合，冰浴条件下加入三乙胺和丙烯酰氯反应4～48h后，用0.5～1.5mol/L的酸和碱进行后处理，即可得到聚乙二醇二丙烯酸酯。

7.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述光引发剂为I2959、二苯甲酮、安息香丁醚、异丙基硫杂蒽酮、二苯基乙酮或苯甲酰甲酸甲酯中的一种或多种；所述光引发剂的添加量为0.05％～5％。

8.权利要求1～7任一所述复合膜在培养干细胞方面的应用。

9.一种干细胞的培养方法，其特征在于，以权利要求1～7任一所述的复合膜为培养载体，将干细胞悬液进行表面接种或直接混入权利要求1～7任一所述的复合膜预聚液中成膜培养。

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，更具体地，涉及一种基于蛋清与甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜与其制备方法和其在培养干细胞方面的应用以及在该膜上培养干细胞的方法。

背景技术

干细胞因具有多向分化潜能在生命科学、生物、医疗等各个领域备受关注。目前，全球范围内针对干细胞的研究层出不穷，从血液病到组织损伤修复到抗衰老，干细胞技术正逐步从临床研究过渡到临床应用阶段，干细胞治疗已经成为血液系统疾病、神经系统疾病、心血管及肝脏疾病等重大疾病的新的治疗选择。同时，作为组织工程的关键因素之一，干细胞与支架材料和生长因子等一同构成了组织工程材料，以修复或替换受损器官及组织。随着生物医学工程技术的不断发展，从自身天然组织结构出发设计仿生、高效、生物相容性好、且与健康组织具有相似生理状态的多功能组织工程支架以解决医疗方面的现实问题成为当前的重点研究方向。

干细胞的自我复制及分化行为由细胞本身状态、细胞存在的微环境等多方面因素决定，至今尚无明确、完整的机制理论。为了组织工程和干细胞治疗的进一步发展，构建适于干细胞生长的微环境，深入了解干细胞细胞的生物学行为、确定干细胞应用的安全性、可行性的考察迫在眉睫。从组织工程原理出发，支架材料不仅为细胞的生长提供支撑，还构成了细胞生长的微环境，已广泛用于骨、皮肤、心脏相关领域的应用研究，故构建适宜干细胞生长且生物学功能精确可控的支架材料可为干细胞的行为研究及应用开发提供极大的便利，是一个十分可行的设想。

在此设想中，支架材料有以下几点要求：1、支架材料应安全无毒，可支持干细胞生长；2、作为细胞分化代谢的场所，应具有多孔性，为细胞的长期培养输送营养；3、可以控制支架材料的组分、尺寸和形状，提供适宜的模拟微环境，进行细胞生长分化的调控；4、具有生物相容性、可加工性和操作简便性，可以适应不同的研究及应用。因此，如何获得安全无毒、可控、生物相容性、适宜干细胞生长的生物支架材料成为组织工程亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种基于蛋清与甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜和其在培养干细胞方面的应用以及在该复合膜上培养干细胞的方法。本发明所述复合膜能支撑干细胞体外培养，具备多孔结构、良好的力学性能和生物性能、且其生物学功能精确可控，为进一步的干细胞行为研究和应用探索创造了条件。

本发明的目的是提供一种基于蛋清与甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜。

本发明另一个目的是提供上述复合膜的制备方法。

本发明再一个目的是提供上述复合膜在培养干细胞方面的应用。

本发明再一个目的是提供在上述复合膜上培养干细胞的方法。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种基于蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜，包括蛋清和至少一种甲基丙烯酸衍生化聚合物。

使用的蛋清可来自所有蛋类，包括但不限于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋等蛋类；另外，该复合膜还可以加入营养因子、生长因子等其他常规添加剂。

蛋清来源丰富，含有丰富的氨基酸组成与人类必需氨基酸比例接近的蛋白质，可为细胞生长提供良好的营养环境；而明胶常被用于模拟细胞外基质，聚乙二醇和一些糖类化合物也具备良好的生物相容性，本发明以蛋清为主要材料，通过将明胶、聚乙二醇和一些糖类化合物（如透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠等）制备成甲基丙烯酸衍生化聚合物，使其能在紫外光下与蛋清固化交联来制备生物复合膜，制成的复合膜的机械性能与生物相容性均能满足干细胞培养需要，可广泛应用于组织工程的研究中。

所述蛋清在复合膜中的含量优选为0.5%～95%，更优选为20%～80%，进一步优选为30%～70%。

所述甲基丙烯酸衍生化聚合物的分子量优选为250～1000000，更优选为250～100000，最优选为250～80000。

所述复合膜的厚度优选为0.1～3 mm，更优选为1.5～3 mm。

优选地，所述甲基丙烯酸衍生化聚合物选自甲基丙烯酸酯化明胶（GelMa）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）或甲基丙烯酸酯化糖类中的至少一种。所述甲基丙烯酸酯化糖类指的是用甲基丙烯酸酐或丙烯酰氯与透明质酸、壳聚糖或海藻酸钠等多糖制备成的透明质酸、壳聚糖或海藻酸钠的甲基丙烯酸衍生化聚合物。

更优选地，所述甲基丙烯酸衍生化聚合物为GelMa、PEGDA；其中，所述GelMa与PEGDA的质量比为0.1%～68%：0.1%～85%；优选为1%～55%：1%～55%；更优选为35%：15%。

所述GelMa的甲基丙烯酸酯化程度至少为10%，优选为20%～80%。实验发现，GelMa的甲基丙烯酸酯化程度较高时，产物的光交联性能提升，有利于提高复合膜的强度，制成的复合膜更有利于不同条件下的干细胞生长。

所述PEGDA的分子量优选为250～100000；更进一步优选为250～80000。实验发现，PEGDA的分子量相对较低时，能在较低固含量下形成稳定的胶体，保证制成的复合膜内部有足够空间适宜于干细胞的生长。

本发明以蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物作为干细胞培养载体，通过调整蛋清及甲基丙烯酸衍生化聚合物的组成和比例可进一步调整支架材料的机械性能、力学性能和生物学性能，更好地诱导干细胞的扩增、迁移及分化，以促进干细胞快速增殖、调控干细胞的迁移和定向分化，实现生物学功能精确可控。

具体地，所述的复合膜由包括以下步骤的方法制备得到：

S1. 制备蛋清溶液：取新鲜蛋清，震荡混匀处理5～10 min，转速2000～4000 r/min下离心8～20 min，取澄清溶液即为蛋清溶液；

S2. 合成甲基丙烯酸衍生化聚合物：将明胶、聚乙二醇或糖类，与甲基丙烯酸酐或丙烯酰氯反应，反应产物经后处理干燥后得到可光交联的甲基丙烯酸衍生化聚合物；

S3. 制备复合膜：将甲基丙烯酸衍生化聚合物消毒后用纯水溶解，所得溶液与蛋清溶液混合，加入光引发剂得到预聚液，除去气泡，置于模具中紫外光照成膜。

优选地，所述光引发剂为I2959、二苯甲酮、安息香丁醚、异丙基硫杂蒽酮、二苯基乙酮或苯甲酰甲酸甲酯中的一种或多种；所述光引发剂的添加量为0.05%～5%。更优选地，所述光引发剂为I2959。

优选地，步骤S2中所述糖类选自透明质酸、壳聚糖或海藻酸钠中的一种或多种。

优选地，步骤S2中所述合成甲基丙烯酸衍生化聚合物的方法为：

当甲基丙烯酸衍生化聚合物为GelMa时，按质量体积比1.5～7.5：1将甲基丙烯酸酐与明胶溶液反应，反应产物透析干燥后得到白色松软的海绵状产物即为GelMa。

更优选地，30～60℃水浴下，将明胶溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中配成质量体积浓度为5%～20%的溶液后，与甲基丙烯酸酐反应；所述明胶的分子量优选为10000～300000，更优选为20000～50000。

在本发明的一种实施方式中，明胶的甲基丙烯酸酯化程度至少为10%，优选为20%～80%。实验发现，加入的甲基丙烯酸酐量增加后获得的产物光交联性能提升，相同浓度下制成的复合膜的强度提高，通过调整明胶的甲基丙烯酸酯化程度可控制成胶后获得的复合膜的结构，使之更适宜于不同条件下干细胞的生长。

本文中，术语“甲基丙烯酸酯化程度”指的是存在于甲基丙烯酸衍生化聚合物中的羧酸基团的量，该羧酸基团能反应产生甲基丙烯酸酯基团。

当甲基丙烯酸衍生化聚合物为PEGDA时，将聚乙二醇（PEG）与二氯甲烷混合，冰浴下加入三乙胺和丙烯酰氯反应4～48 h后，用0.5～1.5 mol/L的酸和碱进行后处理，所得产物即为PEGDA。

其中，所述PEGDA的分子量优选为250～100000；更进一步优选为250～80000。

更优选地，所述的酸为盐酸，所述的碱为氢氧化钠；所述盐酸和氢氧化钠的浓度均为1 mol/L；所述的丙烯酰氯以2～6滴/5秒的速度滴加，控制反应速率和温度，以免过热等造成过多的副反应；所述PEG的分子量优选为200～100000；更优选为200～2000。

更具体优选地，合成GelMa的具体方法为：将明胶在30～60℃水浴下溶于PBS缓冲液中，制成质量体积浓度为5%～20%的溶液；以0.1～1 mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐（甲基丙烯酸酐与明胶溶液的质量体积比为7.5：1），于45～55℃水浴中搅拌反应4～24 h，加入3～5倍量的PBS停止反应；所得液体透析7～10 d后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为GelMa。

更具体优选地，合成PEGDA的具体方法为：将二氯甲烷加入PEG中，冰浴下加入三乙胺后，以2～6滴/5秒的速度加入丙烯酰氯，反应4～48 h；反应结束后，分别加入0.5～1.5mol/L的盐酸和氢氧化钠，静置分层后收集有机层，于30～60℃旋蒸2～10 h，所得液体产物即为低分子量的PEGDA。其中，PEG与二氯甲烷的质量体积比浓度为5%～20%，PEG：三乙胺：丙烯酰氯的摩尔比为1：5～8：6～9。

更具体优选地，步骤S3制备复合膜的具体方法为：将步骤S1处理过的蛋清溶液与经消毒后用纯水溶解的甲基丙烯酸衍生化聚合物材料（如GelMa、PEGDA或甲基丙烯酸酯化糖类等，所述材料均经过消毒或灭菌）按比例混匀，加入光引发剂，得到的预聚液除去气泡后置于模具中，紫外光照10～300 s成膜。

本发明利用新鲜蛋清在受控条件下制备蛋清溶液；在受控条件下制备可光交联的甲基丙烯酸衍生化聚合物。其中，具体利用不同分子量的明胶、不同比例的甲基丙烯酸酐及PBS在受控条件下制备GelMa；利用不同分子量的PEG和二氯甲烷、丙烯酰氯、三乙胺在受控条件下制备低分子量的PEGDA；然后利用上述反应产物在光引发剂的作用下制成的复合膜，可支持干细胞培养，尤其适用于骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞的体外培养。

本发明还提供了上述任一所述复合膜在培养干细胞方面的应用。

另外，本发明还提供了一种干细胞的培养方法，具体为：以上述任一所述的复合膜为培养载体，将干细胞悬液进行表面接种或直接混入上述任一所述的复合膜预聚液中成膜培养。

其中，干细胞悬液的制备方法为：收集经离心、分离、纯化后的干细胞，在培养基中培养至细胞覆盖率为80%～90%时，对其进行消化后即可制成干细胞悬液。

优选地，所述培养基中包含如下组分：90～110 μg/mL青霉素，90～110 μg/mL链霉素，8%～12%胎牛血清，余量为L-DMEM和/或DMEM/F12。

优选地，所述消化是用含0.1%～0.15%EDTA的0.2%～0.3%胰蛋白酶进行消化传代。

优选地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。

更优选地，所述骨髓间充质干细胞的培养方法为：用PBS或完全培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓滤液，反复离心分离收集单个核细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养，2～4 d后首次更换一半的培养基，经2～4 d更换一次培养基，利用贴壁特性分离出骨髓间充质干细胞，再接种到所述复合膜上培养，或直接混入所述复合膜的预聚液中成膜培养。

更具体优选地，将干细胞在复合膜表面培养时，将灭菌处理的复合膜平铺于6孔板中，接种纯化后的干细胞悬液，孵育10 min～2 h后加适量的培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

更具体优选地，将干细胞包裹于复合膜中培养时，将无菌处理的复合膜的预聚液与干细胞悬液混匀，调整至适宜细胞密度，在模具中紫外光照成膜，取出置于6孔板中加适量的培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，定期观察细胞的生长状态。

本发明利用蛋清溶液和甲基丙烯酸衍生化聚合物，如甲基丙烯酸酯化程度较高的明胶（GelMa）、低分子量的PEGDA或甲基丙烯酸酯化糖类等，在受控的条件下合成复合膜，其弹性模量为0.5～1000 MPa。

本发明所制备的复合膜除了具备传统膜制品的形态和传统复合膜的吸水性和可塑性外，还具有以下有益效果：

1、本发明的复合膜以蛋清为主要材料，利用这一天然的高生物相容性材料可为细胞提供适宜生长、繁殖、分化的微环境。

2、本发明通过对生物相容性极好的明胶、PEG及糖类化合物改性得到的甲基丙烯酸衍生化聚合物，不仅能在较低固含量下形成稳定的胶体，而且有利于提高产物的强度，更有利于制备力学性能和生物性能良好的复合膜。例如甲基丙烯酸酯化程度较高的明胶（GelMa）可提升产物的光交联性能，有利于提高复合膜的强度，使复合膜更有利于不同条件下的干细胞生长；而低分子量的PEGDA或甲基丙烯酸酯化糖类，能在较低固含量下形成稳定的胶体，保证制成的复合膜内部有足够空间适宜于干细胞的生长。

3、本发明的产品性质可通过调整蛋清溶液和甲基丙烯酸衍生化聚合物的比例进行精确调控；紫外光照成膜的特性配合复合膜的厚度，可实现不同形状、不同厚度的复合膜的快速制备。

4、本发明所制备的复合膜呈均匀的孔状结构，适宜细胞黏附生长；有良好的力学性能，可承受生理活动中产生的压力；具有良好的生物相容性和极低的细胞毒性，适宜细胞的黏附生长与增殖。

附图说明

图1：a、b为封装好的蛋清复合膜。

图2：a、b、c为固化之后从模具中取出的蛋清复合膜。

图3：a、b为裹入细胞后在孔板中培养的膜。

图4：蛋清-甲基丙烯酸衍生化聚合物复合膜的扫描电镜图，其中a（30%）、b（50%）、c（70%）为不同比例的蛋清-GelMa，d（30%）、e（50%）、f（70%）为不同比例蛋清-PEGDA，蛋清比例由低到高。

图5为蛋清复合膜材料制备成圆柱体进行力学测试的结果。

图6为蛋清复合膜材料MTT测试结果图。

图7为蛋清复合膜材料表面接种细胞培养时显微镜下观察结果。

图8为蛋清复合膜材料表面接种细胞培养（Rhodamine phalloidin和DAPI染色）的结果。

图9为蛋清复合膜材料包裹细胞培养（DAPI染色）的结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1蛋清-甲基丙烯酸酯化程度较高的明胶复合膜的制备及细胞培养

1、一种基于蛋清和甲基丙烯酸酯化程度较高的明胶的复合膜，由以下步骤制备而成：

（1）制备蛋清溶液：取新鲜蛋清，震荡混匀处理7 min，转速3000 r/min下离心15 min后分层明显，取中部澄清溶液备用；

（2）合成GelMa材料：将分子量为20000明胶在50℃水浴下溶于PBS缓冲液中，制备成15%（w/v）浓度的溶液，以0.7 mL/min的速度缓慢滴加甲基丙烯酸酐，其与明胶的比例为7.5：1（w/v），在50℃水浴中搅拌反应12 h后加4倍量的PBS停止反应。将所得乳白色液体装入透析袋（8-14KD）中，于蒸馏水中透析7 d待溶液透析至透明状后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为GelMa材料，储存于低温干燥处；其中，明胶的甲基丙烯酸酯化程度为70%；

（3）制备预聚液：用无菌的纯水溶解灭菌后的GelMa，将所得溶液与蛋清溶液混合使得蛋清含量为50%，加入0.1%（w/w）的溶于DMSO的光引发剂I2959，混匀，即得到预聚液；

（4）复合膜的制备：将上述得到预聚液除去气泡后置于模具中，紫外光照50 s，即可制备成蛋清-GelMa复合膜。

2、细胞培养

（1）骨髓间充质干细胞的分离培养：用PBS或完全培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓滤液，反复离心分离收集单个核细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养，2 d后首次更换一半的培养基，2 d更换一次培养基，利用贴壁特性分离出骨髓间充质干细胞；

（2）骨髓间充质干细胞的培养：将分离纯化后的骨髓间充质干细胞接种于培养基中，培养至细胞覆盖率达80%～90%时，用含0.125%EDTA的0.25%胰蛋白酶对其进行消化传代，并制成干细胞悬液；其中培养基中包含如下组分：100 μg/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，10%胎牛血清，余量为L-DMEM和/或DMEM/F12；

（3）复合膜包裹骨髓间充质干细胞培养：将上述无菌处理的复合膜的预聚液与上述干细胞悬液混匀，调整至适宜细胞密度，在模具中紫外光照成膜，取出置于6孔板中加适量的培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，定期观察细胞的生长状态。

（4）复合膜表面接种骨髓间充质干细胞培养：将上述灭菌处理的复合膜平铺于6孔板中，接种纯化后的干细胞悬液，孵育10 min 后加适量的培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

3、产品性能见实施例8。

实施例2蛋清-低分子量的PEGDA复合膜的制备及细胞培养

1、一种基于蛋清和低分子量的PEGDA的复合膜，由以下步骤制备而成：

（1）制备蛋清溶液：于蛋壳上取一小孔，分离出蛋清，震荡混匀处理5 min后呈浅黄色浑浊状，以2000 r/min转速离心8 min后分层明显，中部澄清溶液即为所需蛋清溶液，分离待用；

（2）合成低分子量PEGDA：将分子量为200的PEG与二氯甲烷按10%（w/v）比例混合，冰浴下加入三乙胺，使用恒压漏斗按4滴/5秒的速度逐滴加入丙烯酰氯（PEG：三乙胺：丙烯酰氯的摩尔比为1：5：6）；反应结束后，分别加入1 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠，静置分层后收集有机层，所得有机层于30℃旋蒸10 h，即得低分子量PEGDA，呈液态于低温避光保存；

（3）制备预聚液：用无菌的纯水溶解灭菌后的PEGDA，将所得溶液与蛋清溶液混合使得蛋清含量为50%，加入0.1%（w/w）的溶于DMSO的光引发剂I2959，混匀，即得到预聚液。

（4）复合膜的制备：将上述得到预聚液除去气泡后置于模具中，紫外光照50 s，即可制备成蛋清-PEGDA复合膜。

2、细胞培养

按实施例1的细胞培养方法利用上述制成的蛋清-PEGDA复合膜接种培养骨髓间充质干细胞。

3、产品性能见实施例8。

实施例3蛋清-甲基丙烯酸酯化糖类（透明质酸）复合膜的制备

1、一种基于蛋清和甲基丙烯酸酯化糖类的复合膜，由以下步骤制备而成：

（1）制备蛋清溶液：于蛋壳上取一小孔，分离出蛋清，震荡混匀处理10 min后呈浅黄色浑浊状，以4000 r/min转速离心20 min后分层明显，中部澄清溶液即为所需蛋清溶液，分离待用；

（2）合成甲基丙烯酸酯化的透明质酸材料：将分子量为500000的透明质酸在30℃下水浴下溶于PBS中制备为饱和透明质酸溶液，以1 mL/min的速度缓慢滴加甲基丙烯酸酐，其与透明质酸的比例为5：1（w/v），常温下搅拌反应24 h后加4倍量的PBS停止反应。将所得乳白色液体装入透析袋（8-14KD）中，于蒸馏水中透析3 d待溶液透析至透明状后，冷冻干燥得到白色产物，即为基丙烯酸酯化的透明质酸材料，储存于低温干燥处；

（3）制备预聚液：用无菌的纯水溶解灭菌后的甲基丙烯酸酯化的透明质酸，将所得溶液与蛋清溶液混合使得蛋清含量为95%，加入0.1%（w/w）的溶于DMSO的光引发剂I2959，混匀，即得到预聚液。

（4）复合膜的制备：将上述得到预聚液除去气泡后置于模具中，紫外光照50 s，即可制备成复合膜。

2、细胞培养

按实施例1的细胞培养方法利用上述制成的蛋清-甲基丙烯酸酯化的透明质酸复合膜接种培养骨髓间充质干细胞。

3、产品性能见实施例8。

实施例4蛋清-GelMa-PEGDA复合膜的制备

本例使用蛋清溶液、过滤消毒后用纯水溶解的GelMa溶液和PEGDA溶液混合，使得各组成成分含量为50%：35%：15%，其余同实施例1的GelMa复合膜制备方法或实施例2的PEGDA复合膜制备方法。产品性能见实施例8。

实施例5不同比例蛋清-GelMa复合膜的制备

本例使用蛋清溶液与过滤消毒后用纯水溶解的GelMa溶液混合，使得蛋清含量分别为20%、30%、70%、80%，其余同实施例1。产品性能见实施例8。

实施例6不同比例蛋清- PEGDA复合膜的制备

本例使用蛋清溶液与过滤消毒后用纯水溶解的PEGDA溶液混合，使得蛋清含量分别为20%、30%、70%、80%，其余同实施例2。产品性能见实施例8。

实施例7不同比例蛋清-甲基丙烯酸酯化糖类复合膜的制备

本例使用蛋清溶液与过滤消毒后用纯水溶解的甲基丙烯酸酯化的透明质酸溶液混合，使得蛋清含量为0.5%，其余同实施例3。产品性能见实施例8。

实施例8性能测试

1、测定上述实施例1～7制成的复合膜材料的性能，结果如下：

（1）蛋清含量在0.5%～95%时，蛋清与GelMa、PEGDA或甲基丙烯酸酯化糖类均能成功制备出复合膜，该复合膜的弹性模量为0.5～1000 MPa，断裂时压缩率为25%～90%，较为适宜细胞生长。同时实验发现，蛋清含量在20%～80%时，蛋清与GelMa、PEGDA或甲基丙烯酸酯化糖类制备出的复合膜有着良好的力学性能和生物学性能，更为适宜干细胞的黏附生长与增殖；蛋清含量在30%～70%时，制备出的复合膜呈均匀的孔状结构，复合膜的结构更为稳固，最为适宜不同条件下的干细胞生长。

（2）图4为蛋清-甲基丙烯酸衍生化聚合物复合膜的扫描电镜图，其中a（30%）、b（50%）、c（70%）为不同比例的蛋清-GelMa复合膜，d（30%）、e（50%）、f（70%）为不同比例蛋清-PEGDA复合膜。由图4可知，蛋清与GelMa或PEGDA可在光照后形成多孔状结构的复合膜，整体上显示出孔隙率随着蛋清比例的增加而减小，孔隙大小随着蛋清比例的增加而增加的趋势，调整适宜的比例可制备出孔隙结构适宜干细胞生长的复合膜。

（3）图5为蛋清复合膜材料制备成圆柱体进行力学测试的结果，其中L（30%）、M（50%）、H（70%）为不同比例的蛋清复合膜。由图5可知，蛋清与GelMa或PEGDA在光照后形成的复合膜有可调控的力学性能，整体上显示出复合膜强度随着蛋清比例的减小而增加的趋势，同等蛋清比例下GelMa复合膜强度较PEGDA复合膜强度高，调整不同的比例可制备出强度不同的复合膜以适应不同的需要。

（4）图6为蛋清复合膜材料MTT测试结果图。图6说明不同比例的蛋清与GelMa或PEGDA形成的复合膜对干细胞均无明显毒性，细胞相容性好。

（5）图7为蛋清复合膜材料表面接种细胞进行培养显微镜下观察结果。由图7可知，干细胞在蛋清-甲基丙烯酸衍生化聚合物复合膜上可良好地粘附、生长，干细胞在不同的层面上都能较好地粘附，细胞形态良好。

（6）图8为将细胞种植在蛋清与GelMa或PEGDA形成的复合膜膜表面进行培养2 d后染色的结果，其中a（30%）、b（50%）、c（70%）为不同比例的蛋清-GelMa复合膜，d（30%）、e（50%）、f（70%）为不同比例蛋清-PEGDA复合膜。由图8可知，细胞形态较好，说明细胞在蛋清-甲基丙烯酸衍生化聚合物复合膜表明可良好地粘附、生长。并且，随蛋清比例增加细胞数量有增加的趋势，说明了蛋清的加入有利于干细胞的培养。

（7）图9为蛋清复合膜材料包裹细胞培养（DAPI染色）结果，其中a（30%）、b（50%）、c（70%）为不同比例的蛋清-GelMa复合膜，d（30%）、e（50%）、f（70%）为不同比例蛋清-PEGDA复合膜。由图9可知，细胞在不同比例的蛋清与GelMa或PEGDA形成的复合膜内部可良好地生长；且相同条件下培养2 d后，细胞密度随蛋清比例增加有增加的趋势，说明了蛋清的加入有利于干细胞的培养。

2、另外，本发明人经过大量实验证明，甲基丙烯酸酯化程度较高的明胶（甲基丙烯酸酯化程度为20%～80%），可提升产物的光交联性能，有利于提高复合膜的强度，使复合膜更有利于不同条件下的干细胞生长；低分子量的聚乙二醇二丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯化糖类（分子量为250～100000，尤其为250～80000时），能在较低固含量下形成稳定的胶体，保证制成的复合膜内部有足够空间适宜于干细胞的生长。

一种基于蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜及其在培养干细胞方面的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。