专利摘要

本发明涉及天然药物领域，主要是丹参酮IIA衍生物通式(I)和通式(II)在制备内皮细胞保护药物中的应用。实验结果表明丹参酮IIA衍生物通式(I)和通式(II)可以明显降低H2O2引起的内皮细胞损伤，同时可以降低H2O2引起的内皮细胞凋亡，机制研究证明丹参酮IIA衍生物通式(I)和通式(II)是通过激活Nrf2‑ARE通路发挥抗氧化作用。

权利要求

1.一种丹参酮IIA衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于该丹参酮IIA衍生物及其药学上可接受的盐的结构式如式(I)和式(II)所示：

其中：X、Y各自独立表示O、N；

M＝0或1；

R₁、R₂相同或不同，分别独立代表C₁-C₅直链或支链烷基，被0-1个取代基W取代的C₁-C₅的直连和支链烷基，被0-1个取代基W取代C₃-C₆的环烷基；芳基、芳杂环；所述W为独立选自羟基、氨基、羧基、巯基；或者R₁和R₂相互连接形成非取代的3-6元饱和或不饱和的含有1-4个杂原子的环状基团，所述杂原子可独立或同时选自O、N或S；

R₃可以是羟基，C₁-C₅饱和醇，C₁-C₅不饱和醇，C₁-C₅饱和的一级胺，C₁-C₅不饱和一级胺，C₁-C₅饱和的二级胺或C₁-C₅不饱和的二级胺，芳基；

所述的芳基选自含5-14个原子的芳基官能团；

所述的芳杂环选自含5-14个原子的芳杂环官能团。

2.如权利要求1所述的一种丹参酮IIA衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的芳基官能团选自苯基、萘基、卤代苯；所述的芳杂环官能团选自吡啶、哌啶、嘧啶、呋喃、吡咯、噻唑、噻吩、噁唑、喹啉、吲哚、吡嗪。

3.一种药物组合物，其中含有权利要求1化合物及其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。

4.权利要求1中化合物及其药学上可以接受的盐在制备保护内皮细胞的药物中的用途。

5.如权利要求4所述的权利要求1中化合物及其药学上可以接受的盐在制备保护内皮细胞的药物中的用途，其特征在于：所述保护血管内皮细胞的药物用于治疗心血管疾病。

6.如权利要求5所述的权利要求1中化合物及其药学上可以接受的盐在制备保护内皮细胞的药物中的用途，其特征在于：所述心血管疾病是冠心病、动脉粥样硬化、高血压、脑出血或脑血栓。

7.权利要求1中化合物及其药学上可以接受的盐在制备抗氧化药物中的用途。

8.如权利要求7所述的权利要求1中化合物及其药学上可以接受的盐在制备抗氧化药物中的用途，其特征在于：所述抗氧化是在氧化应激时保护血管内皮细胞。

9.如权利要求8中所述的权利要求1中化合物及其药学上可以接受的盐在制备抗氧化药物中的用途，其特征在于：所述在氧化应激时保护血管内皮细胞是通过调节Nrf2-ARE通路进行的。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学和药物技术领域，具体涉及一类丹参酮IIA衍生物，该类衍生物为活性成分的药物组合物，其制备方法以及该类化合物和其他药物组合物在制备治疗内皮细胞损伤引起疾病的药物应用。

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草植物丹参(Salvia Miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效。丹参在临床上广泛用于心血管系统疾病，具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善微循环、降低心肌耗氧量、防止心肌缺血和心肌梗阻等作用。

丹参含有多种化学成分，丹参酮IIA是其脂溶性成分中含量最高的化合物，也是其主要的活性成分之一。丹参酮IIA具有抗癌、抗菌、抗氧化、扩张冠脉增加冠脉血流量、改善心脏功能、抗炎、抗动脉粥样硬化等良好而广泛的药理活性。已有研究表明丹参酮IIA可以减轻过氧化氢引起损伤，保护内皮细胞。但是丹参酮IIA水溶性差，因此制备水溶性好活性高丹参酮IIA衍生物可以增加其成药性。

血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell，VEC)为衬贴于血管内腔面的单层扁平细胞，其表面积可达1000m²以上。VEC分泌多种调节血管功能的活性物质，具有多种生理功能，参与机体凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生命活动。血管内皮损伤是多种心血管疾病的病理基础。最近已有研究通过干预治疗以恢复心血管疾病患者的内皮功能，改善预后，这是对心血管疾病治疗的新的尝试。

Nrf2-ARE通路是目前最重要的抗氧化通路，对于维持体内氧自由基的稳态起关键性作用，在生理状态下Nrf2-ARE通路处于抑制状态，Keap1与Nrf2蛋白结合，调控Nrf2蛋白的蛋白酶体水解。当有外界刺激或体内氧自由基增多，Nrf2蛋白与Keap1蛋白解离进入细胞核中， Nrf2蛋白与抗氧化原件(antioxidant response element ARE)结合，调控下游抗氧化蛋白的表达。研究发现缺血性心肌损伤发生与氧化应激关系密切。因此Nrf2-ARE通路可能是预防和治疗氧化应激引起疾病的重要手段和方法。

发明内容

本发明公布一类的丹参酮IIA衍生物用途，其在制备保护血管内皮细胞的药物中的应用。

丹参酮IIA衍生物表现出较强的抗氧化应激的作用，他可以降低过氧化氢引起的内皮细胞损伤，实验证实丹参酮IIA抗氧化应激作用是通过激活Nrf2-ARE通路达到的。

1、本发明提供的丹参酮IIA衍生物及其药学上可接受的盐，其结构通式如式(I)和式 (II)所示：

其中：X、Y各自独立表示O、N；

M＝0或1；

R₁、R₂相同或不同，分别独立代表C₁-C₅直链或支链烷基，被0-1个取代基W取代的C1-C5 的直连和支链烷基，被0-1个取代基W取代C₃-C₆的环烷基；芳基、芳杂环；所述W为独立选自羟基、氨基、羧基、巯基；或者R₁和R₂相互连接形成的非取代的3-6元饱和或不饱和的含有1-4个杂原子的环状基团，所述杂原子可独立或同时选自O、N或S。

R₃表示羟基，C₁-C₅饱和醇，C₁-C₅不饱和醇，C₁-C₅饱和的一级胺，C₁-C₅不饱和一级胺，C₁-C₅饱和的二级胺或C₁-C₅不饱和的二级胺，芳基，

所述的芳基选自含5-14个原子的芳基官能团，包括但不限于苯基、萘基、卤代苯；

所述的芳杂环选自含5-14个原子的芳杂环官能团，包括但不限于吡啶、哌啶、嘧啶、呋喃、吡咯、噻唑、噻吩、噁唑、喹啉、吲哚、吡嗪。

一种药物组合物，其中含有权利要求1化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。

a丹参酮IIA衍生物或其药学上可以接受的盐在制备保护内皮细胞的药物中的用途。

b优先的用途为在其特征在于：所述心血管疾病是冠心病、动脉粥样硬化、高血压、脑出血或脑血栓。

c丹参酮IIA衍生物或其药学上可以接受的盐在制备抗氧化药物中的用途，尤其是保护血管内皮细胞以避免其氧化应激时受到损伤的用途。

d优先的用途为其特征在于：所述保护血管内皮细胞以避免其氧化应激时受到损伤是通过调节Nrf2-ARE通路进行的。

附图说明

图1是不同浓度(0μM，5μM，15μM，20μM)WL-3化合物作用下Nrf2-ARE通路下游抗氧化蛋白HO-1、Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA表达水平的图

图2是不同浓度(0μM，5μM，15μM，20μM)WL-4化合物作用下Nrf2-ARE通路下游抗氧化蛋白HO-1、Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA表达水平的图

图3是不同浓度丹参酮IIA(0μM，5μM，15μM，20μM)作用下Nrf2-ARE通路下游抗氧化蛋白HO-1、Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA表达水平的图

具体实施过程

实施例1

丹参酮IIA衍生物对EA.hy926细胞中SOD和MDA含量的影响

1.1试验方法：取生长期的EA.hy926细胞，以2*10⁵接种于50ml细胞瓶中，培养24小时后，吸弃培养液，空白组和损伤组加入新鲜的无血清DMEM高糖培养基，常规培养。处理组在此基础上分别加入浓度为1μg/ml的各种药物，继续培养24h后，检测细胞内丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。

SOD增加率＝(给药组-模型组)/给药组*100％

MDA降低率＝(模型组-给药组)/模型组*100％

1.2实验结果：如表1所述

丹参酮IIA衍生物可以增加EA.hy926细胞中SOD的含量同时减少MDA的含量

由表1可以得知，与模型组相比，丹参酮IIA衍生物均表现一定的抗氧化损伤的保护作用。

实施例2

MTT法测试丹参酮IIA衍生物减少H₂O₂引起细胞活力降低。

2.1试验方法：EA.Hy926接种于96孔板中，正常培养12h后换无血清DMEM继续培养12h，使细胞同步化。吸弃原培养液，加入不同浓度的待测化合物预保护12h后，换成含900μMH₂O₂的无血清DMEM培养基，每孔100μL，并设置正常对照组，每组三个平行复孔。继续培养2h后，收集上清，三孔富集于一管中，用于后期LDH测定。每孔加入新鲜无血清培养基，并于每孔加入10μLMTT，继续培养4h，用酶标仪在490nm处检测吸光度值 (OD490)。计算各组细胞活力值。

2.2实验结果：如表2所述

丹参酮IIA衍生物对H₂O₂引起EA.hy926细胞活力降低的影响

细胞活力增加值＝(给药组-模型组)/给药组*100％

由表2可以得知，与模型组相比，丹参酮IIA衍生物均表现一定的抗H₂O₂引起的内皮细胞凋亡的作用。

实施例3

WL-3，WL-4，丹参酮IIA三个化合物提高Nrf2-ARE下游抗氧化蛋白HO-1、Nrf2、GCLC、 GCLM的mRNA的表达。

A549细胞的培养与传代：A549细胞培养于含10％胎牛血清、100M/mL青霉素、100M/mL链霉素的DMEM培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO₂培养孵箱中培养。A549细胞用含EDTA的0.25％胰蛋白酶处理后进行细胞的传代。实验中平均每两天传代一次。具体操作如下：吸去细胞培养皿中的旧培养液，用PBS清洗1次，然后加适量胰酶消化1-2min，根据细胞的增殖速度和自己实验的需要适当比例将细胞传至新的培养皿中，于37℃的培养箱中培养。

药物的配制：以2×10⁵/ml的密度将A549细胞接种于六孔板中，选择WL-3、WL-4、丹参酮IIA配制给药培养基(含1％血清)，每个样品做3个浓度梯度(5μM、10μM、20μM)，由母液逐级稀释，六孔板中每孔加入2mL含药培养基。给药12h后提取RNA。

细胞总RNA的提取：

a.取三种药物处理后的细胞，倒弃旧培养液，用PBS清洗一遍。6孔板每孔加入1000μL的 RNA isolater，用移液枪反复吹打至裂解液中无明显沉淀。将样品转至1.5mL离心管中，室温静置5min。

b.加入适量体积(大概1/5体积)氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡或涡旋15s混匀液体，4℃静置5min。12,000g下4℃离心15min(注意此步必须低温离心，否则产物会有少量基因组污染)。小心取出离心管，此时，匀浆液分为3层，即无色的上清、中间的白色蛋白层和下层红色的有机相，而RNA存在于上清液中。

c.将上清液转移至新的EP管中，切勿吸到中间的蛋白，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温或4℃静置10min，4℃下12,000g离心10min。通常可以看到白色沉淀。

d.小心弃去上清，加入1mL用DEPC水配制的75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管壁，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来，并静置3-5min，12,000g 4℃离心5min。

e.小心弃去上清液，通风橱干燥，尽量除净乙醇。

RNA浓度测定：取2μL的总RNA样品，测定样品浓度及在260nm和280nm处的吸光度比值，判断样品纯度。A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8～2.0之间视为提取的样品纯度合格。新鲜的RNA 样品用来逆转录合成cDNA，剩余样品-80℃保存。

cDNA的合成(逆转录)

mRNA的逆转录按照HiScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行，反应体系如下表。

逆转录程序为：25℃，5min；42℃，15min；85℃，5min。合成的cDNA随即用于PCR反应或者-20℃储存备用。

mRNA的逆转录的反应体系

Real-Time PCR

Roche Real-Time PCR，反应体系如下表。

反应条件

PCR所用引物序列：

提取经不同终浓度的活性化合物孵育后的EA.hy926细胞，获得完整的RNA，将其反转录为cDNA，进行HO-1、Nrf2、GCLC、GCLM的荧光实时定量PCR。结果发现，WL-3、 WL-4、丹参酮IIA三个化合物均在不同程度升高HO-1、Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA水平。这些结果说明这些活性化合物在激活Nrf2-ARE通路后，成功诱导了下游抗氧化蛋白mRNA 的表达。

WL-3、WL-4、丹参酮IIA三个化合物在1μM，5μM，10μM浓度下HO-1、Nrf2、GCLC、 GCLM的mRNA水平，如说明书附图1(WL-3)、说明书附图2(WL-4)、说明书附图3(丹参酮IIA)

WL-3、WL-4、丹参酮IIA三个化合物可以明显增加Nrf2-ARE下游抗氧化蛋白HO-1、Nrf2、GCLC、GCLM的mRNA水平，说明三个化合物是通过Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。

丹参酮IIA衍生物在制备内皮细胞保护药物中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。