专利摘要

本发明公开了一种孕甾烷型甾体生物碱及其制备方法和应用。其分子式为C30H44N2O2。制备步骤为：1)将野扇花的根茎干燥粉碎成粗粉；2)将粗粉用甲醇超声提取，得提取液；3)将提取液浓缩成浸膏，浸膏用硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层调节pH到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱；4)将总生物碱用硅胶拌样后进行柱层析分离后经SephadexLH‑20凝胶柱层析纯化即得孕甾烷型甾体生物碱。本发明的孕甾烷型甾体生物碱具有明显的抑制肿瘤细胞增殖，治疗癌症的作用。

权利要求

1.一种孕甾烷型甾体生物碱，其特征在于：其分子式为C30H44N2O2，所述孕甾烷型甾体生物碱的结构式为：

2.一种根据权利要求1所述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，其特征在于：提取的步骤如下：

1)将羽脉野扇花的根茎干燥，粉碎成粗粉；

2)将粗粉用甲醇超声提取，得提取液；

3)将提取液浓缩成浸膏，浸膏用硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层调节pH到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱；

4)将总生物碱用硅胶拌样进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺＝100:1:0、50:1:0、20:1:0、10:1:0和5:1:1的梯度洗脱,合并相同组分依次得5个部分A-E，B部分经二氯甲烷-甲醇＝20:1、10:1和5:1的梯度洗脱依次得B1-B3三个部分，B2部分经过石油醚-二氯甲烷-二乙胺＝50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1分离依次得B2-1、B2-2、B2-3和B2-4四个部分，B2-3部分经石油醚-乙酸乙酯-二乙胺＝20:1:1的系统反复柱层析后经SephadexLH-20凝胶柱层析纯化即得甾体生物碱20(S)-20(二甲胺基)-16α,17α-环氧-3α-苯甲酰胺基-5α-孕甾烷。

3.根据权利要求2所述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述甲醇选用94-96％的甲醇。

4.根据权利要求2所述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述超声提取是提取3次，每次20-30小时，将3次提取的提取物合并得所述提取液。

5.根据权利要求2所述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述硫酸溶液的浓度为0.8-1.2％。

6.一种根据权利要求1所述的孕甾烷型甾体生物碱在制备抗癌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的孕甾烷型甾体生物碱的应用，其特征在于：所述抗癌药物为抗人结肠腺癌药物、抗人肝癌药物、抗人前列腺癌药物、抗人乳腺癌药物和抗人慢性髓原白血病癌药物。

说明书

技术领域

本发明属于药物术领域，具体地，涉及一种新型甾体生物碱及其制备方法和应用，特别是一种新型孕甾烷型甾体生物碱及其制备方法和应用。

背景技术

野扇花属(Sarcococca)黄杨科(Buxaceae)植物，常绿灌木，本属约有20种，分布于亚洲南部及东部。在我国现知的有8种及几个变种分别为:羽脉野扇花(S.hookerianaBaill)、双蕊野扇花(变种)(S.hookerianavar.digyna)、野扇花(S.ruacifolia)、柳叶野扇花(S.saligna)、长叶柄野(S.longipotiolata)、东方野扇花(S.oriantalis)、长叶野扇花(S.longifolia)、云南野扇花(S.wallichii)、海南野扇花(S.vagans)、聚花野扇花(S.confertiflor)。贵州省主要产2种，野扇花和羽脉野扇花，且为贵州苗族民间习用草药，常混用，又名三两金、胃友，收录于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版(DB52/YC328-2003)。药用根、果。治胃痛、风寒湿痹、跌打损伤，每用根3～5钱，水煎服或研末，日服三次。治头晕、心悸、视力减退，每用果3～5钱，水煎服。结合该属植物在民间用药的传统，开展深入的化学成分和药理活性研究有利于充分挖掘该属植物药用价值，具有特别的现实意义。

根据世界卫生组织的最新实况报道，肿瘤即癌症是世界第二大死因(心血管疾病为第一大死因)。2015年因罹患癌症而死亡的案例高达880万，就全球范围而言，近六分之一的死亡是由癌症造成的。世界死亡率最高的癌症类型依次为：肺癌(2015年死亡人数接近169万)、肝癌(78.8万)、结肠直肠癌(77.4万)、胃癌(75.4万)及乳腺癌(57.1万)。其发病率和死亡率不仅与性别有关，发达地区和欠发达地区在此也表现出了明显的差异。在我国，肿瘤发病率逐年攀升，以每年10％的速度增长，每一分钟就有6人被诊断为恶性肿瘤，5人死于癌症。而且，值得关注的是我国癌症发病人数约占世界发病的五分之一；癌症死亡人数约占全球总数的四分之一。因此，对抗癌药物的深入研究具有十分重要的意义并成为国内外的一个研究热点。在恶性肿瘤的治疗中，药物治疗占有重要的地位。在合成化学类抗肿瘤药物中绝大多数都以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物，以天然产物为来源的抗肿瘤药物具有活性显著、结构独特、作用机制不同于一般的小分子化学治疗药物的优势。据报道，临床使用的抗癌药物中超过60％来源于天然，包括植物、海洋生物、微生物。在2003年销售最好的20种抗肿瘤药物中，天然产物及其衍生物占37％，如紫杉醇，多西他赛，羟基喜树碱等，由此可见，天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。从药用植物中寻找新的具有选择性细胞毒活性单体化学成分成为研制新型抗肿瘤药物的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种孕甾烷型甾体生物碱及其制备方法和应用。本发明的孕甾烷型甾体生物碱具有明显的抑制肿瘤细胞增殖，治疗癌症的作用。

本发明的技术方案：一种孕甾烷型甾体生物碱，其分子式为C30H44N2O2，所述20(S)-20(N,N二甲胺基)-16α,17α-环氧-3α-苯甲酰胺基-5α-孕甾烷的结构式如附图1所示。

一种前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，是从野扇花的根茎中提取获得。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，所述提取的步骤如下：

1)将野扇花的根茎干燥，粉碎成粗粉；

2)将粗粉用甲醇超声提取，得提取液；

3)将提取液浓缩成浸膏，浸膏用硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层调节pH到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱；

4)将总生物碱用硅胶拌样进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺＝100:1:0、50:1:0、20:1:0、10:1:0和5:1:1的梯度洗脱依次得5个部分A-E，B部分经二氯甲烷-甲醇＝20:1、10:1和5:1的梯度洗脱依次得B1-B3三个部分，B2部分经过石油醚-二氯甲烷-二乙胺＝50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1分离依次得B2-1、B2-2、B2-3和B2-4四个部分，B2-3部分经石油醚-乙酸乙酯-二乙胺＝20:1:1的系统反复柱层析后经SephadexLH-20凝胶柱层析纯化即得孕甾烷型甾体生物碱。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，步骤2)中，所述甲醇选用94-96％的甲醇。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，步骤2)中，所述超声提取是提取3次，每次20-30小时，将3次提取的提取物合并得所述提取液。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，步骤骤3)中，所述硫酸溶液的浓度为0.8-1.2％。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，步骤3)中，所述剩余的酸水层是用饱和的碳酸钠溶液调节pH到9-10。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，所述野扇花为聚花野扇花、羽脉野扇花、双蕊野扇花、长叶野扇花、长叶柄野扇花、东方野扇花、野扇花、柳叶野扇花、海南野扇花或云南野扇花。

一种前述的孕甾烷型甾体生物碱的应用，是在抗癌药物中的应用。

前述的孕甾烷型甾体生物碱的应用，具体是在人结肠腺癌、人肝癌、人前列腺癌、人乳腺癌和人慢性髓原白血病癌的抗癌药物中的应用。

本发明的有益效果

本发明是从野扇花(Sarcococca hookeriana Baill.)的根茎中的分离到的一种新型的孕甾烷型甾体生物碱，这一种新型甾体生物碱具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，特别是对人结肠腺癌、人肝癌、人前列腺癌、人乳腺癌和人慢性髓原白血病癌显著的选择性。本发明表明该甾体生物碱具有开发成抗癌药物的价值。

本发明化合物的分离与结构鉴定：

实验材料

药材于2015年7月采于贵州省赫章县韭菜坪，贵阳中医学院赵俊华教授鉴定为羽脉野扇花(Sarcococca hookeriana Baill.)的根，植物标本存放于贵阳中医学院苗医药重点实验室，编号为20150701。

仪器及试剂

ECX-500500MHz、JEOL-400MHz超导核磁共振谱仪(日本电子株式会社)；UV-2401PC岛津紫外分光光度计(日本岛津)；micrOTOF-QⅡBrukerDaltonics质谱仪(美国布鲁克·道尔顿公司)；TENSOR-27型Bruker红外光谱仪(德国布鲁克仪器公司，KBr压片)；BUCHI-R-215型旋转蒸发仪(瑞士步奇公司)；N-1001型旋转蒸发仪(EYELA，日本东京理化)；WFH-308B三色紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；ZF-2型紫外光谱仪(上海安亭电子仪器厂)；RE-5210旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D-Ⅲ型多用真空泵(郑州华仪器有限责任公司)；SK8210HP超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。柱层析硅胶(青岛海洋化工，80-100目、200-300目)；薄层层析硅胶H(青岛海洋化工)；GF254硅胶板(青岛海洋化工200×200mm)；凝胶为SephadexLH-20；显色剂为改良碘化铋甲试剂；其它试剂均为国产分析纯。

经上述实施例的方法制得化合物。

化合物呈无色针状晶体，易溶于氯仿；改良碘化铋钾显色呈橘红色。

UV(CHCl3):244.5(1.53).IR(KBr):3402,3032,2930,2853,2767,1644,1603,1521,1488,718,694.HR-ESI-MS:465.3471([M+H]+,C30H45N2O2+；计算值.465.3476).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.74(dt,J＝7.0,1.4Hz,2H,H-),7.47(m,1H),7.41(m,2H),5.99(d,J＝8.0Hz,1H),3.55(s,1H),2.24(s,6H),1.14(d,J＝6.7Hz,3H),0.87(s,3H),0.83(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ:166.7(C-1′),135.0(C-2′),131.2(C-5′),128.5(C-4′,6′),126.8(C-3′,7′),73.6(C-17),60.9(C-16),55.7(C-20),54.5(C-10),49.3(C-3),45.4(C-5),45.1(C-14),43.1(C-NMe2),42.2(C-13),37.2(C-1),35.6(C-10),35.4(C-4),33.8(C-8),32.8(C-12),31.6(C-7),28.8(C-2),28.4(C-6),27.2(C-15),20.8(C-11),15.8(C-18),13.6(C-21),12.2(C-19).1H-NMR和13C-NMR相关数据见表1。

无色针状晶体，易溶于氯仿。改良碘化铋钾显色剂显色呈橘红色。HR-ESI-MS显示分子量为465.3471([M+H]+,C30H45N2O2+；计算值.465.3476).推断出其分子式为C30H44N2O2，不饱和度为9；结合13C NMR和DEPT信号可知该化合物的30个碳分别为5个甲基碳，8个亚甲基碳，12个次甲基碳和5个季碳。红外光谱在3402,1644,1603,1521,1488和718cm-1处的吸收峰，表明化合物结构中有仲胺基，酰胺羰基和苯环。1H-NMR显示有一个苯环上的5个质子信号δ(H)7.74(dt,J＝7.0,1.4Hz,2H,H-3′,7′),7.47(m,1H,H-5′),7.41(m,2H,H-4′,6′)；一个氮上的质子信号δ(H)5.99(d,J＝8.0Hz,1H,NH)；一个与氧相连的次甲基质子信号δ(H)3.55(s,1H,H-16)，两个连在氮上的甲基信号δ(H)2.24(s,6H,NMe2)和三个角甲基信号δ(H)1.14(d,J＝6.7Hz,3H,H-21),0.87(s,3H,H-18),0.83(s,3H,H-19)。13C-NMR在δ(C)135.0(C-2′),131.2(C-5′),128.5(C-4′,6′),126.8(C-3′,7′)的信号表明结构中有取代苯环，δ(C)166.7(C-1′)表明结构中有羰基碳，同时在δ(C)73.6(C-17),60.9(C-16)提示结构中有两个连氧碳。以上数据与氢谱数据相互应证。

通过二维谱来对化合物的结构进一步解析，1H-1H COSY(图2)中的H-3与H-2相关；H-3′,7′与H-4′,6′相关；H-5′与H-4′,6′相关；H-9与H-8和H-11相关。H-20与H-21相关。结合HMBC中，H-(NH)与(C-3)、(C-1')相关；H-3′,7′与(C-1')相关；H-5′与(C-3')、(C-7')相关，可推断苯甲酰基结构连在(C-3)位上。H-19与(C-1)、(C-5)、(C-9)、(C-10)均有相关可推断出A环和B环的结构。H-18与(C-12)、(C-13)、(C-14)、(C-17)相关；而H-15与(C-14)、(C-16)、(C-17)相关，因此可推断出C环和D环的结构。H-21与(C-17)、(C-20)相关；H-NMe2与(C-20)相关，可推断表明N,N-二甲胺基连在(C-20)位上。通过文献[22]对照发现，该化合物的NMR数据与已知化合物epipachysamine D相似，只是位于低场区的(C-16)和(C-17)的化学位移值δ(C)73.6(C-17)、60.9(C-16)差别较大，提示(C-16)和(C-17)位有环氧基。由(C-17)与H-18、H-21、H-15相关；(C-16)与H-15相关。因此可推断与epipachysamine D相比具有较高化学位移值的(C-16)和(C-17)位上有环氧基。而其相对构型则需通过ROESY谱来确定，根据ROESY(图3)谱中的信号可知，N-H和Hα-C(5)相关，而Hβ-C(16)和N-Me相关，因此推断化合物2的C(3)和环氧基的C(16)和C(17)为α构型。通过以上光谱数据分析，确定该化合物的结构为(20S)-20-(dimethylamino)-16α,17α-epoxy-3α-benzoylamino-5α-pregnane(如附图2和3所示)。

表1.化合物的1HNMR和13C NMR数据(CDCl3,δin ppm,J in Hz.)

aData recorded in CDCl3at 500MHz for1H and 125MHz for 13C NMR.

细胞毒活性研究：

实验材料

1.1受试品：本发明制备的甾体生物碱20(S)-20(二甲胺基)-16α,17α-环氧-3α-苯甲酰胺基-5α-孕甾烷(20S)-20-(dimethylamino)-3α-phenylacetylamino-5α-pregnane。化合物配制：称取一定量化合物，加入适量DMSO，配制为100mM的化合物溶液，此为母液。用完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μM的工作液。

1.2阳性对照药：顺铂(DDP)，批号：SJJMI-IE，东京化成工业株式会社；5-氟尿嘧啶(5-FU)，批号：HFBM160120325008，Amresco公司。阳性对照药配制：称取DDP或5-FU约2mg，用新鲜完全培养基配制成100mM的母液，再用新鲜完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μM的工作液。

1.3主要材料：人结肠腺癌细胞(SW480)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、人前列腺癌细胞(PC3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人慢性髓原白血病细胞(K562)。高糖DMEM培养基(规格：500ml/瓶，批号：AB10201637，HyClone公司)，FBS(规格：500ml/瓶，批号：M048-6，美国Sciencell公司)，CCK-8(规格：100ml/瓶，批号：B34304，美国Bimake公司)。

1.4主要仪器：3111型CO2培养箱(编号：024，美国Thermo公司)，DMIL型倒置显微镜(编号：027，德国Leica公司)，CJ-1F型医用净化工作台(编号：058，苏州冯氏实验动物设备有限公司)，Spectramax-i3x型酶标仪(编号：525，美国MolecularDevices公司)。

2试验方法

2.1细胞培养

取已长满的SW480、SMMC-7721、PC3、MCF-7、K562细胞，采用含10％FBS的高糖DMEM完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况，1～2d传代或换液，至对数生长期备用。

2.2CCK-8法检测化合物对癌细胞的细胞毒性试验

取对数期生长的SW480、SMMC-7721、PC3、MCF-7、K562细胞以每孔3×103个细胞接种于96孔细胞培养板中，待12h细胞贴壁后，设置正常对照组、阳性对照药(DDP)组、阳性对照药(5-FU)组、化合物组(100、30、10、3、1、0.3μM)，每组3个复孔。正常对照组以新鲜完全DMEM培养基孵育细胞，化合物组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μM化合物的新鲜完全DMEM孵育细胞，DDP和5-FU组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μM化合物的新鲜完全DMEM孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞72h后在每孔中加入CCK-810μl，，继续培养1h后在450nm处测量各孔的吸光度。以正常对照组OD值为100％细胞活力，其余各组OD值与正常对照组OD值的比值为相对活力。以相对活力评价化合物对SW480、SMMC-7721、PC3、MCF-7、K562细胞的毒性。

3结果评价

显微镜下观察不同浓度的化合物处理细胞后，出现细胞增殖速度减慢，细胞碎片增多、细胞间隙增大、细胞出现沙粒状空泡，且具有剂量-效应关系。结果详见下表：

表2化合物体外药物筛选药效学研究结果(IC50,μM)。

aAll results are expressed as mean±SD；n＝3 for all groups.bIC50:50％inhibitory concentration.c DDP and 5-FU was the positive control.

通过CCK-8法检测本发明化合物对癌细胞的细胞毒性试验证明本发明化合物具有显著的人结肠腺癌细胞(SW480)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、人前列腺癌细胞(PC3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人慢性髓原白血病细胞(K562)毒活性，表明其具有开发成抗癌药物的价值。

附图说明

附图1为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的结构示意图；

附图2为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的结构图；

附图3为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的结构图；

附图4为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的紫外光谱图；

附图5为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的红外光谱图；

附图6为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的HES-ES-MS谱图；

附图7为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的1H-NMR谱图；

附图8为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的13C-NMR谱图；

附图9为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的HQC谱图；

附图10为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的COSY谱图；

附图11为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的HMBC谱图；

附图12为本发明的孕甾烷型甾体生物碱的ROESY谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

本发明的实施例

实施例1：一种孕甾烷型甾体生物碱，其分子式为C30H44N2O2，不饱和度为9，结构式如附图1所示。

上述的孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，是从野扇花(羽脉野扇花(S.hookerianaBaill)、双蕊野扇花(变种)(S.hookerianavar.digyna)、野扇花(S.ruacifolia)、柳叶野扇花(S.saligna)、长叶柄野扇花(S.longipotiolata)、东方野扇花(S.oriantalis)、长叶野扇花(S.longifolia)、云南野扇花(S.wallichii)、海南野扇花(S.vagans)和聚花野扇花(S.confertiflor)中的任一种)的根茎中提取获得，具体步骤如下：

1)将野扇花的根茎干燥，粉碎成粗粉；

2)将粗粉用95％的甲醇超声提取3次，每次24小时，将3次提取的提取物合并得所述提取液；

3)将提取液浓缩成浸膏，浸膏用浓度为1％的硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层用饱和的碳酸钠溶液调节pH到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱；

4)将总生物碱用硅胶拌样进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺(100:1:0，50:1:0，20:1:0，10:1:0，5:1:1)梯度洗脱得5个部分A-E，B部分经二氯甲烷-甲醇＝20:1、10:1和5:1的梯度洗脱依次得B1-B3三个部分，B2部分经过石油醚-二氯甲烷-二乙胺＝50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1分离依次得B2-1、B2-2、B2-3和B2-4四个部分，B2-3部分经石油醚-乙酸乙酯-二乙胺＝20:1:1的系统反复柱层析后经凝胶柱层析纯化即得孕甾烷型甾体生物碱。

实施例2：一种孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，具体步骤如下：

1)将野扇花的根茎干燥，粉碎成粗粉；

2)将粗粉用94％的甲醇超声提取3次，每次20小时，将3次提取的提取物合并得所述提取液；

3)将提取液浓缩成浸膏，浸膏用浓度为0.8％的硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层用饱和的碳酸钠溶液调节pH到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱；

4)将总生物碱用硅胶柱拌样进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺(100:1:0，50:1:0，20:1:0，10:1:0，5:1:1)梯度洗脱得5个部分A-E，B部分经二氯甲烷-甲醇＝20:1、10:1和5:1的梯度洗脱依次得B1-B3三个部分，B2部分经过石油醚-二氯甲烷-二乙胺＝50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1分离依次得B2-1、B2-2、B2-3和B2-4四个部分，B2-3部分经石油醚-乙酸乙酯-二乙胺＝20:1:1的系统反复柱层析后经SephadexLH-20凝胶柱层析纯化即得孕甾烷型甾体生物碱。

实施例3：一种孕甾烷型甾体生物碱的制备方法，具体步骤如下：

1)将野扇花的根茎干燥，粉碎成粗粉；

2)将粗粉用94-96％的甲醇超声提取3次，每次20-30小时，将3次提取的提取物合并得所述提取液；

3)将提取液浓缩成浸膏，浸膏用浓度为0.8-1.2％的硫酸溶液溶解后用乙酸乙酯萃取得非生物碱部分，剩余的酸水层用饱和的碳酸钠溶液调节pH到9，再用二氯甲烷萃取得总生物碱；

4)将总生物碱用硅胶柱拌样进行柱层析分离，用二氯甲烷-甲醇-二乙胺(100:1:0，50:1:0，20:1:0，10:1:0，5:1:1)梯度洗脱得5个部分A-E，B部分经二氯甲烷-甲醇＝20:1、10:1和5:1的梯度洗脱依次得B1-B3三个部分，B2部分经过石油醚-二氯甲烷-二乙胺＝50:1:1、20:1:1、10:1:1和5:1:1分离依次得B2-1、B2-2、B2-3和B2-4四个部分，B2-3部分经石油醚-乙酸乙酯-二乙胺＝20:1:1的系统反复柱层析后经凝胶柱层析纯化即得孕甾烷型甾体生物碱。

实用例1：取实施例1-3任一种的孕甾烷型甾体生物碱100g，与40g淀粉混合装入胶囊，制成1000粒即得。

用法用量：口服，一日3次，每次使用剂量以孕甾烷型甾体生物碱计为3mg。

功能与主治：抗结肠癌、肝癌和慢性髓原白血病癌。

实用例2：取实施例1-3任一种的孕甾烷型甾体生物碱，加注射用水溶解并灌封于相应容器内，115℃热压灭菌30分钟，冷却后，抽滤，滤液加注射用水稀释，垂熔滤球过滤，灌封，115℃再热压30分钟，制备成注射液。用法用量：肌肉注射，静脉注射或静脉滴注，每日用量以孕甾烷型甾体生物碱计为2mg。

一种孕甾烷型甾体生物碱及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。