专利摘要
本发明公开了一种水溶性类胡萝卜素及其发酵制备方法，属于天然产物开发技术领域，发酵制备方法采用黑附球菌LS10H为发酵菌体，以固体和液体两种不同的培养基进行发酵并采用水浸提取的方法制备水溶性类胡萝卜素，并对提取的水溶性类胡萝卜素进行性能测试，测试表明提取水溶性类胡萝卜素易溶于水，分子量为613.3，在强酸性或强碱性或高温下稳定，对强光照射不敏感，在1％‑6％H2O2溶液或0.1％‑0.6％Na2SO3溶液中稳定。
权利要求
1.一种水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）种子培养：将黑附球菌在PDA培养基中进行划线培养，培养3-4天后使用无菌水洗下菌丝体，制得菌丝体悬液，即为发酵用种子液；
（2）发酵：取种子液接种于与发酵培养基中，然后在28-32℃条件下培养4-7天；
（3）提纯：发酵结束后，按发酵培养基质量加入5-6倍重量的去离子水，浸泡并搅拌均匀，在20-60℃水浴中浸提30-90min，浸提液经离心除杂，然后将上清液真空冷冻干燥得到水溶性类胡萝卜素粗品；将水溶性类胡萝卜素粗品在室温条件下溶解于无水乙醇中，离心除杂得乙醇上清液，将乙醇上清液在温度50-60℃下真空旋转蒸发除乙醇，得水溶性类胡萝卜素纯品；
所述黑附球菌为黑附球菌LS10H已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.13871；保藏日期：2017年06月06日；保藏地点：中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，其特征在于，所述PDA培养基，组分为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL，pH6.7-7.2。
3.根据权利要求1所述的水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为固态培养基或液态培养基。
4.根据权利要求3所述的水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，其特征在于，所述固态培养基，组分为大米10-40g，ZnSO
5.根据权利要求3所述的水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，其特征在于，所述液态培养基，组分为葡萄糖20-40g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母膏2-6g/L，KH
6.根据权利要求1所述的水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，其特征在于，所述离心条件为转速4000r/min，离心时间30min。
7.一种水溶性类胡萝卜素，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的水溶性类胡萝卜素发酵制备方法制备而成。
8.根据权利要求7所述的水溶性类胡萝卜素，其特征在于，所述水溶性类胡萝卜素在发酵过程中能分泌至细胞外并稳定的存在于发酵基质中。
说明书
技术领域
本发明属于天然产物开发技术领域，涉及发酵制备技术领域，具体涉及一种水溶性类胡萝卜素及其发酵制备方法。
背景技术
天然食用色素是指从动物和植物组织以及微生物发酵产物中提取的一类食用色素。与动物和植物组织提取相比，利用微生物发酵制备天然色素具有经济、高效和不受地理、季节或气候影响等优势，是天然色素的重要来源之一。类胡萝卜素在天然食用色素中用量居第二位，除了能为食品添色外，类胡萝卜素天然色素还具有较高营养和保健价值，几乎所有类胡萝卜素均有抗氧化、增强免疫力、防止紫外线损伤、抗心血管疾病和抗癌等功能，自然界中发现的类胡萝卜素种类繁多，大约有600多种，能溶于大部分有机试剂中,一般不溶于水，类胡萝卜素遇氧、遇酸、强光照及高温下不稳定，易降解变化或异构化，但在碱性条件下一般比较稳定。
类胡萝卜素生产方法主要有化学合成法、自然生物组织提取法和微生物发酵法，中国专利公布号CN1711240公开了一种基于双Witting缩合或双Witting-Horner化学缩合反应制备类胡萝卜素的方法。中国专利CN101054357公开了一种从黄姜中提取总类胡萝卜素的方法，利用不同有机溶剂萃取，不仅从黄姜中提取得到经济价值较高类胡萝卜素，还减少了后续皂素生产废水的处理成本，同样中国专利公开号CN105779551A公开了一种发酵生产类胡萝卜素的方法，以黄桃罐头下脚料为主要原料，在经过高产类胡萝素的海洋红酵母进行分次接种、变温发酵后发酵液中细胞生物量为38-52g/L，类胡萝卜素产量为47-61mg/L。
黑附球菌是一种内生真菌，属半知菌纲，壳霉目，杯霉科，附球菌属，在自然界分布较广。在研究应用当中，黑附球菌及其孢子主要被应用于生物防治，Yue-Zhong Shu等在1997 年首次报道了黑附球菌可发酵产生一种新型的多烯(烃)类类胡萝卜素，但目前检索显示未出现黑附球菌发酵制备水溶性类胡罗素的相关专利。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出种水溶性类胡萝卜素及其发酵制备方法，为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种水溶性类胡萝卜素发酵制备方法，具体步骤如下：
1)种子培养：将黑附球菌在PDA培养基中进行划线培养，培养3-4天后使用无菌水洗下菌丝体，制得菌丝体悬液，即为发酵用种子液；
2)发酵：取种子液接种于与发酵培养基中，然后在28-32℃条件下培养4-7天；
3)提纯：发酵结束后，按发酵培养基质量加入5-6倍重量的去离子水，浸泡并搅拌均匀，在20-60℃水浴中浸提30-90min，浸提液经离心除杂，然后将上清液真空冷冻干燥得到水溶性类胡萝卜素粗品；将水溶性类胡萝卜素粗品在室温条件下溶解于无水乙醇中，离心除杂得乙醇上清液，将乙醇上清液在温度50-60℃下真空旋转蒸发除乙醇，得水溶性类胡萝卜素纯品。
优选的，所述PDA培养基，组分为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL，pH6.7-7.2。
优选的，所述发酵培养基为固态培养基或液态培养基。
优选的，所述固态培养基，组分为大米10-40g，ZnSO4 0.01-0.05g，NaCl 0.5-1g/L，K2HPO4 0.2-0.5g/L，MgSO4 0.3-0.6g/L，去离子水10-40mL，pH 4-6。
优选的，所述液态培养基，组分为葡萄糖20-40g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母膏2-6g/L， KH2PO4 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.3-0.6g/L，pH3-7。
优选的，所述离心条件为转速4000r/min，离心时间30min。
优选的，所述黑附球菌为黑附球菌Epicoccum nigrumLS10H已被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.13871；保藏日期：2017年06月06日；保藏地点：中国科学院微生物研究所。
一种水溶性类胡萝卜素，采用水溶性类胡萝卜素发酵制备方法制备而成。
优选的，所述水溶性类胡萝卜素在发酵过程中能分泌至细胞外并稳定的存在于发酵基质中。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明采用黑附球菌LS10H发酵制备水溶性类胡萝卜素，具有发酵活力高，发酵工艺简单，发酵过程易于控制且不易染菌等特点。
2.本发明采用水直接浸提法，提纯水溶性类胡萝卜素，具有提取率高、提取过程简单和提取成本低的特点。
3.本发明采用黑附球菌LS10H发酵制备水溶性类胡萝卜素，提取的水溶性类胡萝卜色素具有优良的理化性质，具有抗氧化活性、对光照不敏感、在高温条件下稳定性好、在酸碱条件下稳定好等特征。
附图说明
图1水溶性类胡萝卜素紫外可见光区域全波长扫描图；
图2水溶性类胡萝卜素浓度与吸光值OD450nm关系曲线图；
图3水溶性类胡萝卜素溶液二级质谱检测图；
图4水溶性类胡萝卜素浓度与自由基清除率关系曲线图。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1
本实施例采用黑附球菌LS10H固态发酵产水溶性类胡萝卜素：
1)种子培养：将黑附球菌LS10H在由马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL构成的pH为7的PDA培养基中进行划线培养，培养4天后使用10mL无菌水洗下菌丝体8cm
2)发酵：取5mL上述菌丝体悬液接种于40g由大米20g，ZnSO4 0.04g，NaCl 0.5g/L，K2HPO4 0.4g/L，MgSO4 0.5g/L，去离子水20mL构成的pH为6，经121℃灭菌20min，冷却的固态发酵培养基中，搅拌均匀后于30℃条件下静置培养6天，期间每隔1天使用无菌玻璃棒对发酵基质进行一次均匀搅拌处理；
3)提纯：发酵结束后，按固态发酵的质量加入5倍体积去离子水，浸泡并搅拌均匀后于 40℃水浴中浸提30min，浸提液于4000r/min条件下离心30min，去除固形物并收集上清液，将上清液通过真空冷冻干燥法干燥得水溶性类胡萝卜素粗品，将水溶性类胡萝卜素粗品在室温条件下溶解于50mL无水乙醇中，离心去除不能溶解于无水乙醇的固形物并收集上清液，将获得的色素的乙醇溶解液在60℃下通过真空旋转蒸发法去除乙醇即可得到水溶性类胡萝卜素纯品，在上述发酵条件下，提取液中色素含量以438nm处的光密度OD438表示，OD438可达到2.3，换算成色素与发酵基质的质量分数比则为1.29mg/g。
实施例2
本实施例采用黑附球菌LS10H液态发酵产水溶性类胡萝卜素：
1)种子培养：将黑附球菌LS10H在由马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，去离子水1000mL构成的pH为7的PDA培养基中进行划线培养，培养4天后使用10mL无菌水洗下菌丝体8cm
2)发酵：取8mL上述菌丝体悬液接种于42mL由葡萄糖25g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L， KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.3g/L构成的pH为5，经121℃灭菌20min冷却的液体培养基，于30℃转速200r/min的搅拌条件下培养5天；
3)提纯：发酵结束后，菌体和发酵液通过离心方式进行分离，按液态发酵的质量加入5 倍体积去离子水，浸泡并搅拌均匀后于40℃水浴中浸提30min，浸提液于4000r/min条件下离心30min，并收集上清液，将上清液通过真空冷冻干燥法干燥得水溶性类胡萝卜素粗品，将水溶性类胡萝卜素粗品在室温条件下溶解于50mL无水乙醇中，离心去除不能溶解于无水乙醇的固形物并收集上清液，将获得的色素的乙醇溶解液在60℃下通过真空旋转蒸发法去除乙醇即可得到水溶性类胡萝卜素纯品，在上述发酵条件下，发酵液中色素含量以438nm处的光密度OD438表示，OD438可达到2.3，换算成色素含量与发酵液的质量体积分数比则为0.93mg/mL。
提取的水溶性类胡萝卜素性能测试如下：
1.对实施例1或2发酵提取的水溶性类胡萝卜素使用紫外可见分光光度计对所提取色素进行全波长扫描，在可见光区域内该色素在438nm处具有最大吸收峰值，如图1所示。
2.将提纯的色素样品在60℃烘箱中烘干至恒重后，准确称取50.0mg干燥样品溶解于1L 去离子水中获得色素的标准样品，将色素的标准样品稀释至浓度分别为5mg/L、10mg/L、 15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L和45mg/L的溶液并于438nm测定吸光值OD438nm，以色素浓度为纵坐标，以OD438nm为横坐标绘制关于色素浓度和438nm处吸光值的标准曲线，如图2所示。
以上述获得的标准曲线为基础，则实施例1中所得发酵基质中色素含量(Y)可以按照以下公式(1)进行计算：公式(1)：Y＝(403.41*X*N+0.2127)*V/G(mg/g)，公式(1)中 N为浸提液的稀释倍数，X为浸提液稀释N倍后在438nm处的吸光值，以去离子水作为空白对照，V为浸提液总体积，G为固态发酵基质重量。
以上述获得的标准曲线为基础，则实施例2中所得发酵液中色素含量(Y)可以按照以下公式(2)进行计算：公式(2)：Y＝403.41*X*N+0.2127(mg/mL)，公式(2)中N为发酵液的稀释倍数，X为发酵液稀释N倍后在438nm处的吸光值，以未发酵的发酵培养基作为空白对照。
3.水溶性类胡萝卜素分子量的测定：采用仪器WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS进行测定检测波长为200-700nm，时间为10min；流动相A相为乙腈；B相为0.1％甲酸；柱温为45℃，流速为0.3mL/min，进样量为3μL；梯度洗脱程序如下表：
采用质谱条件：离子化方式为ESI+，毛细管电压为3.5kV，锥孔电压为30V，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为700L/Hr，碰撞能量为6eV，质量范围为800，检测电压为1800V，二级质谱1选择离子为613，碰撞能量为6eV；二级质谱2选择离子为613，碰撞能量为25eV，检测结果显示在水溶性类胡萝卜素提纯样品中检测出一种分子量为613.3的类胡萝卜素，如图3所示。
4.水溶性类胡萝卜素的抗氧化活性测定：用DPPH法测定水溶性类胡萝卜素的抗氧化活性，通过测定加入所测样品并测定517nm处的吸光值变化，可求出样品对DPPH自由基的消除率，用无水乙醇配置0.1mmol/L的DPPH溶液并避光保存，使用无水乙醇配制浓度分别为0.04mg/L、0.08mg/L、0.12mg/L、0.16mg/L、0.2mg/L、0.24mg/L、0.28mg/L、0.32mg/L、0.36mg/L、和0.40mg/L的水溶性类胡萝卜素溶液，取3mL DPPH溶液并加入2mL水溶性类胡萝卜素溶液，摇匀并于室温下静置30min后测定吸光值Ai，同时测定3mL DPPH溶液与2mL 溶剂蒸馏水混合后的吸光值A0，以及2mL色素溶液与3mL无水乙醇混合后的吸光值Aj。水溶性类胡萝卜素对DPPH的自由基清除率S按以下公式(3)进行计算：
公式(3)：清除率(S)＝{1-(Ai-Aj)/A0}*100％，公式中(3)中所有吸光值均在517nm处测定得到。在上述条件下获得水溶性类胡萝卜素对DPPH自由基清除率曲线如图4所示。根据曲线拟合公式计算得到水溶性类胡萝卜色素对DPPH自由基的半清除浓度IC50为0.37g/L。
5.水溶性类胡萝卜素的温度稳定性测定：使用去离子水配制浓度为125mg/L的水溶性类胡萝卜素水溶液并测定该溶液的吸光值A0，将上述水溶性类胡萝卜素溶液分别取置于30℃、 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴中保温1小时后测定色素溶液的吸光值At；色素的热稳定性以色素残留率/％表示，色素残留率按公式(4)计算：公式(4)：色素残留率/％＝At/A0*100％，公式(4)中吸光值均指在438nm处的吸光值，以去离子水作为空白对照。在上述条件下测定得到水溶性类胡萝卜素温度稳定性如下表所示：
实验数据表明，色素在80℃以下非常稳定，在沸水中也具有较好的稳定性，如在70℃处理1个小时后色素残留率为100％，在沸水浴中煮沸1个小时后色素残留率为91％。
6.水溶性类胡萝卜素酸碱稳定性测定：分别使用pH值为1-14的0.1mol/L HCl-NaOH溶液配制浓度为125mg/L的色素溶液并测定该溶液的吸光值A0；将上述色素溶液于室温放置 1-12小时后测定吸光值At；色素的酸碱稳定性以色素残留率/％表示，色素残留率按实施例6 中的公式(4)计算，在上述条件下测定得到水溶性类胡萝卜素的酸碱稳定性如下表所示：
7.水溶性类胡萝卜素在强氧化剂和强还原剂存在下的稳定性测定：选择H2O2作为强氧化剂处理试剂，选择Na2SO3作为还原剂处理试剂，使用去离子水分别配制1％-6％浓度的H2O2溶液和0.1％-0.6％浓度的Na2SO3溶液，分别使用不同浓度的H2O2和Na2SO3溶液配制色素溶液，使色素的终浓度均为125mg/L并测定该溶液的吸光值A0。将色素溶液于室温静置1个小时后测定吸光值At。色素在强氧化剂或强还原剂中的稳定性以色素残留率％表示，色素残留率按公式(4) 计算，在上述条件下测定得到水溶性类胡萝卜素在强氧化剂H2O2和强还原剂Na2SO3溶液中的稳定性分别如下表：
色素在H2O2溶液中的稳定性
色素在Na2SO3溶液中的稳定性
实验数据表明，水溶性类胡萝卜素在强氧化剂H2O2和低浓度强还原剂Na2SO3溶液中具有良好的稳定性，在高浓度>0.2％强还原剂Na2SO3稳定下稍差。
上面结合具体实施例对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
一种水溶性类胡萝卜素及其发酵制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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