专利摘要

本发明属于医药技术领域，提供了一种C12、C13位取代齐墩果酸衍生物及其制备和应用。以齐墩果酸为原料，通过一步反应制得C12、C13位取代齐墩果酸衍生物：，其中X为H或Cl。该方法所用试剂为实验室常用试剂，反应操作简单，条件温和，经纯化可得到大量具有抗癌活性的齐墩果酸衍生物，有望用于治疗肺癌、肝癌和乳腺癌的药物。

权利要求

1.一种C12、C13位取代齐墩果酸衍生物，其特征在于：其结构通式如下：

，其中X为Cl。

2.一种如权利书要求1所述的C12、C13位取代齐墩果酸衍生物的制备方法，其特征在于：将齐墩果酸溶解于乙二醇二甲醚中，加入N-氯代琥珀酰亚胺，反应液在室温下搅拌，得到所述的C12、C13位取代齐墩果酸衍生物。

3.一种如权利书要求1所述的C12、C13位取代齐墩果酸衍生物的制备方法，其特征在于：将齐墩果酸溶解于2,2,2-三氟乙醇中，加入氯胺-T和苯基三甲基三溴化铵，反应液在室温下搅拌，得到所述的C12、C13位取代齐墩果酸衍生物。

4.一种如权利要求1所述的C12、C13位取代齐墩果酸衍生物在制备抗肺癌、肝癌和乳腺癌药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及C12、C13位取代齐墩果酸衍生物及其制备和应用。

背景技术

齐墩果酸（OA）是植物化学成分，毒性很低，具有抗病毒、消炎、增强免疫和抑制免疫(免疫双向调解作用)、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、保肝、护肾、抗艾滋病毒等多种生物活性。齐墩果酸对恶性肿瘤化疗造成的免疫功能下降的恢复和对抗结核药物的肝损害的保护意义重大。

近年来，末期官能化为医药研究提供了一条新的途径，其通过改造先导化合物某些活性位点的基团来合成一系列多样化的结构，以便于找出其中具有活性的化合物。天然产物多样化不需要通过从头合成，而是选择合适的催化剂直接对其修饰，获得目标产物。本发明针对齐墩果酸12号、13号碳，通过一步反应直接构建了C-X键，合成并获得了具有较高活性的抗肿瘤类药天然骨架小分子。

有关齐墩果酸结构修饰的研究很多，Antonio Martinez 等人报道了与本发明所述的的齐墩果酸衍生物相似的化合物，其用Br2溴化齐墩果酸及用N-溴代琥珀酰亚胺与偶氮二异丁腈处理齐墩果酸两种方法，得到的是X为Br的齐墩果酸衍生物（Tetrahedron.2015, 71, 792-800）。Banita Pattnaik 等人报道以CCl4作溶剂，用N-溴代琥珀酰亚胺处理齐墩果酸得到X为H的齐墩果酸衍生物（Bioorg. Chem.2016, 68, 152-158），即本发明中的化合物2，但是我们重复此实验，得到产物后进行X-射线单晶衍射分析实验，结果却表明产物并非X为H的齐墩果酸衍生物，而是X为Br的齐墩果酸衍生物。在我们前期研究工作中，我们采用N-碘代丁二酰亚胺处理OA，得到X为I的齐墩果酸衍生物。然而这些含溴或者碘的齐墩果酸衍生物类药性较差，而含氯的衍生物由于缺少合适的合成条件无法通过常规的合成方法得到。本发明通过筛选超过50多种反应溶剂和混合溶剂和多种氯化试剂，得到一种优秀反应条件，一步反应以高产率得到C12、C13位取代齐墩果酸衍生物，该制备方法简单，反应条件温和，无需复杂的柱层析，能耗低，收率高，实用性强，且所合成的化合物，类药性高，相对分子质量在500 以下，细胞实验证明其具有较高的体外抗肿瘤活性，有望用于制备治疗肺癌、肝癌和乳腺癌的药物，同时也为其他同类化合物的合成提供新的解决思路和方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种C12、C13位取代齐墩果酸衍生物及其制备方法和应用，该化合物能够选择性的抑制A549细胞（人非小细胞肺癌细胞）和HepG2细胞（人肝癌细胞）的生长，具有较好的药理活性，且其制备方法简单，实验条件温和，不要求高温高压等苛刻条件，反应收率高。

为实现上述目的本发明采用如下技术方案：

一种C12、C13位取代齐墩果酸衍生物，其结构式如下：

，其中X为H或Cl。

其具体制备步骤包括：

称取齐墩果酸（1当量）于合适的反应瓶中，加入添加剂（0.2-1.3当量，包括N-氯代琥珀酰亚胺、氯胺-T、苯基三甲基三溴化铵、N-碘代丁二酰亚胺、三乙基硅烷中的一种或多种混合）和适量的溶剂（乙二醇二甲醚或2,2,2-三氟乙醇），反应体系在常温下搅拌反应。

应用：C12、C13位取代齐墩果酸衍生物在制备抗肺癌、肝癌和乳腺癌药物中的应用。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明通过一步反应高效合成目标化合物，其合成方法简单，操作简便，实验条件温和，反应收率高。

（2）本发明所得的C12、C13位取代齐墩果酸衍生物相对分子质量都小于500，属于小分子化合物，类药性评价高，且生物细胞实验证实该化合物具有较高的抗癌活性，因此该化合物具有用于制备治疗肺癌和肝癌药物的前景。

附图说明

图1为化合物2的球棍模型图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1（化合物1）

方法一：

在室温条件下，将齐墩果酸（0.5 mmol，228 mg）和N-氯代琥珀酰亚胺（0.55 mmol，74 mg）称至反应瓶中，加入10 mL乙二醇二甲醚（DME），反应体系在常温下搅拌反应4天。反应液旋干后，加入5mL乙醇，然后将混悬液直接加入200mL水中，得到白色固体沉淀，过滤后干燥，可得到237 mg白色固体产物，收率96%。

方法二：

在室温条件下，将齐墩果酸（0.5 mmol，228 mg）、氯胺-T（0.65 mmol，148 mg）和苯基三甲基三溴化铵（PTATB，0.1 mmol，38 mg）称至反应瓶中，加入10 mL 2,2,2-三氟乙醇，反应体系在常温下搅拌反应4天。反应液直接加入200mL水中，白色固体沉淀过滤后干燥，可得到184 mg白色固体产物，收率75%。

物理状态：白色固体；熔点: 218.4 – 219.1 oC.

TLC: Rf= 0.56 (PE/EtOAc = 4:1).

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.18 (s, 1H), 3.28 – 3.21 (m, 1H), 2.29 –2.12 (m, 3H), 2.01 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.98 – 1.90 (m, 1H), 1.73 (t, J =11.6 Hz, 3H), 1.66 – 1.61 (m, 3H), 1.55 (d, J = 11.9 Hz, 3H), 1.46 (d, J =13.7 Hz, 2H), 1.39 (s, 3H), 1.37 – 1.28 (m, 3H), 1.28 – 1.23 (m, 2H), 1.20(s, 3H), 1.08 – 1.03 (m, 1H), 0.99 (s, 6H), 0.90 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.79(s, 1H), 0.78 (s, 3H).

13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ 179.02, 91.61, 78.72, 65.10, 55.24, 51.96,45.32, 44.80, 43.03, 42.38, 39.79, 38.90, 38.52, 36.52, 34.48, 33.92, 33.24,31.81, 29.34, 28.99, 27.98, 27.50, 27.19, 23.63, 21.31, 20.20, 18.86, 17.71,16.74, 15.40.

HRMS (ESI): calcd for C30H47ClO3[M + H]+m/z 491.3286, found 491.3292.

实施例2 （化合物2）

在室温条件下，将齐墩果酸（0.5 mmol，228 mg）和N-碘代丁二酰亚胺（0.525mmol，118 mg）称至反应瓶中，加入10 mL 2,2,2-三氟乙醇和三乙基硅烷（70 mg，0.6mmol），反应体系在常温下搅拌反应3.5小时。反应液直接加入200mL水中，白色固体沉淀过滤后干燥，可得到224 mg白色固体产物，收率98%。

物理状态：白色固体；熔点: 312.7 – 313.2 oC.

TLC: Rf= 0.47 (PE/EtOAc = 4:1).

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.22 – 3.15 (m, 1H), 2.25 – 2.19 (m, 1H),1.89 – 1.81 (m, 3H), 1.80 – 1.70 (m, 2H), 1.68 – 1.60 (m, 3H), 1.59 – 1.53(m, 3H), 1.51 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 1.46 (d, J = 11.0 Hz, 3H), 1.43 – 1.35 (m,2H), 1.34 – 1.29 (m, 1H), 1.25 – 1.17 (m, 4H), 1.14 (s, 3H), 1.12 (s, 3H),1.10 – 0.99 (m, 1H), 0.96 (s, 3H), 0.92 (s, 1H), 0.86 (s, 3H), 0.86 (s, 3H),0.81 (s, 3H), 0.75 (s, 3H), 0.67 (d, J = 10.8 Hz, 1H).

13C NMR(101 MHz, CDCl3) δ 179.25, 89.65, 78.88, 55.12, 50.04, 47.32,44.96, 43.79, 41.38, 38.98, 38.88, 36.91, 36.14, 35.19, 34.73, 33.03, 31.60,29.86, 27.99, 27.70, 27.31, 26.56, 25.95, 23.09, 19.52, 18.17, 18.02, 17.79,16.22, 15.39.

HRMS (ESI): calcd for C30H48O3[M + H]+m/z 457.3676, found 457.3679.

活性测试

（1）化合物对A549肿瘤细胞增殖和存活的抑制作用

材料：人非小细胞肺癌细胞株A549；

受试药物：最终化合物1、2和齐墩果酸；

细胞培养方法：取出液氮中冻存的A549细胞，在37 ℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5 mL 离心管中，置于离心机中，1500 rpm 离心5 min，弃去上清液，加入1 mL RPMI1640 完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3 mL RPMI 1640 完全培养液，将培养皿置于5 % CO2、37 ℃培养箱中培养。

细胞毒性实验：将A549细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，加入不同浓度的化合物，将其置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中培养72 小时。取出培养板，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，将培养板继续置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中孵育3 小时后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，避光振荡10 min 使结晶物充分溶解；以酶标仪检测450 nm 处的吸收度OD450，并按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率% =（处理组OD450/对照组OD450）×100%，然后使用 SPSS 13.0 软件对数据进行处理，并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）。

（2）化合物对HepG2肿瘤细胞增殖和存活的抑制作用

材料：人肝癌细胞株HepG2；

受试药物：最终化合物1、2和齐墩果酸；

细胞培养方法：取出液氮中冻存的HepG2细胞，在37 ℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5 mL 离心管中，置于离心机中，1500 rpm 离心5 min，弃去上清液，加入1 mL RPMI1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3 mL RPMI 1640 完全培养液，将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养。

细胞毒性实验：将HepG2细胞以2×104 个细胞/孔的密度接种到96 孔培养板中，加入不同浓度的化合物，将其置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中培养。取出培养板，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，将培养板继续置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中孵育3 小时后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，避光振荡10 min 使结晶物充分溶解；以酶标仪检测450 nm 处的吸收度OD450，并按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率% =（处理组OD450/对照组OD450）×100%，然后使用 SPSS 13.0 软件对数据进行处理，并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）。

（3）化合物对MDA-MB-231肿瘤细胞增殖和存活的抑制作用

材料：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231；

受试药物：最终化合物1、2和齐墩果酸；

细胞培养方法：取出液氮中冻存的231细胞，在37 ℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5 mL 离心管中，置于离心机中，1500 rpm 离心5 min，弃去上清液，加入1 mL RPMI1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3 mL RPMI 1640 完全培养液，将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养。

细胞毒性实验：将231细胞以2×104 个细胞/孔的密度接种到96 孔培养板中，加入不同浓度的化合物，将其置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中培养。取出培养板，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，将培养板继续置于37 ℃、5 %二氧化碳培养箱中孵育3 小时后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，避光振荡10 min 使结晶物充分溶解；以酶标仪检测450 nm 处的吸收度OD450，并按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率% =（处理组OD450/对照组OD450）×100%，然后使用 SPSS 13.0 软件对数据进行处理，并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）。

实施例1、实施例2所得最终化合物1、2和齐墩果酸的活性参数如表1所示，IC50值为化合物1、2和齐墩果酸作用于癌细胞72小时后对应癌细胞半数有效抑制浓度。

表1. 化合物的活性参数

由表1可见，修饰过的齐墩果酸衍生物更好抑制了癌细胞的生长，对A549细胞、HepG2细胞、MDA-MB-231细胞均表现较好的活性，与齐墩果酸比，其半数抑制浓度IC50降低了约24-100倍。

缩略词说明：

DME（乙二醇二甲醚）；PTATB（苯基三甲基三溴化铵）；CF3CH2OH（2,2,2-三氟乙醇）；TESH（三乙基硅烷）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

一种C12、C13位取代齐墩果酸衍生物及其制备和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。