专利摘要

本发明公开了一种异甾体生物碱及其衍生物，所述异甾体生物碱可从湖北贝母粗粉中直接提取分离或者由湖贝甲素合成，然后进一步制备相应的衍生物。本发明的异甾体生物碱及其衍生物具有抗肿瘤活性，具有一定的应用前景。

权利要求

1.一种具有式(Ι)结构的化合物,其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐：

其中，R1选自：OH、-OC(O)R2、-OS(O)2R3、C1-C6烷基、-NR4R5或卤素；

R2选自C1-C6烷基或任选被一个或多个R6取代如下基团：C5-C10杂芳基或C6-C10芳基；

R3选自C1-C6烷基或任选被一个或多个R6取代的C6-C10芳基；

R4和R5独立选自H或C1-C6烷基；

R6选自C1-C6烷基、-NR4R5或卤素。

2.如权利要求1所示结构的化合物,其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐，其特征在于：

R1选自：OH、-OC(O)R2、卤素或-OS(O)2R3。

3.如权利要求1所示结构的化合物,其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐，其特征在于：

R2选自C1-C6烷基、C5-C10杂芳基或任选被一个或多个R6取代的C6-C10芳基。

4.如权利要求1所示结构的化合物,其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐，其特征在于：

R3选自任选被一个或多个R6取代的C6-C10芳基。

5.如权利要求1所示结构的化合物,其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐，其特征在于：

R6选自C1-C6烷基。

6.如下结构所示的化合物，其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐：

7.一种药物组合物，包括如权利要求1-6中任意一项权利要求所述化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐。

8.如权利要求7所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括：a)药学可接受的载体和/或助剂；和/或b)一种或多种合适其他活性成分。

9.如权利要求1-6中任意一项权利要求所述化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或它们的药学可接受盐在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

10.如权利要求9所述用途，其特征在于，所述肿瘤选自：肝癌、乳腺癌、结肠腺、胰腺癌、宫颈癌或前列腺癌。

说明书

技术领域

本发明设计药物化学领域，具体涉及一种异甾体生物碱及其制备方法和用途。

背景技术

由于人口老龄化，环境污染，社会精神压力大，不健康的生活方式等因素，造成我国的恶性肿瘤发病率居高不下。据国家癌症中心发布的2017年的中国肿瘤的现状和趋势报告显示：目前中国肿瘤发病率居前五位的依次为：肺癌、胃癌、肝癌、食道癌和结直肠癌。肺癌、乳腺癌分别居中国男性、女性发病首位。因此癌症正在严重威胁到世界人民和中国人民的健康。湖北贝母中主要活性部分是生物碱，近几年对于其逆转癌细胞多药耐药，抗胆碱活性，胆碱酯酶抑制活性等相关研究较多，但抗肿瘤方面研究较少。先前的研究发现部分异甾体生物碱具有抗肿瘤的活性，如贝母素甲可抑制MCF-7/TAM(耐三苯氧胺人乳腺癌细胞)及AML-KG-1a(急性髓系白血病细胞)的增殖，并可诱导其凋亡。但是其活性均较低，在我们对湖北贝母的研究过程中发现了一类特殊的D/E环顺式的瑟文型异甾体生物碱成分，这类成分具有特征的C-5、C-6双键结构，它们具有明显的抗肿瘤活性，对此我们展开了研究，以其获取更多更有效的治疗肿瘤的活性物质，为临床应用提供更多有效的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的抗肿瘤化合物，为肿瘤疾病的治疗提供一种新的选择。

为了达到上述目的，一种具有式I结构的化合物,具有C-5、C-6双键结构，其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐：

其中，R1选自：OH、-OC(O)R2、-OS(O)2R3、C1-C6烷基、-NR4R5或卤素；

R2选自C1-C6烷基或任选被一个或多个R6取代如下基团：C5-C10杂芳基或C6-C10芳基；

R3选自C1-C6烷基或任选被一个或多个R6取代的C6-C10芳基；

R4和R5独立选自H或C1-C6烷基；

R6选自C1-C6烷基、-NR4R5或卤素。

在上述技术方案中，R1优选自：OH、-OC(O)R2、卤素或-OS(O)2R3。

在上述任意技术方案中，R2选自C1-C6烷基、C5-C10杂芳基或任选被一个或多个R6取代的C6-C10芳基。

在上述任意技术方案中，R3选自任选被一个或多个R6取代的C6-C10芳基。

在上述任意技术方案中，R6选自C1-C6烷基。

本发明还提供一种药物组合物，包括本发明的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐。

作为优选，上述药物组合物还包括：a)药学可接受的载体和/或助剂；和/或b)一种或多种合适其他活性成分。

本发明还提供本发明的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

优选所述的肿瘤疾病为真核生物肿瘤细胞增殖。

更优选所述的肿瘤治疗疾病为肝癌、乳腺癌、结肠腺、胰腺癌、宫颈癌或前列腺癌。

术语定义和解释：

除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。

除非另有说明，当本文中使用“本发明化合物”或“本发明的化合物”时，至少旨在涵盖式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物或它们的药学可接受盐。

术语“卤素”指F、Cl、Br和I。换言之，F、Cl、Br和I在本说明书中可描述为“卤素”。

术语“C1-C6”应理解为优选表示具有1-6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。

术语“C6-C10芳基”是指含有6至10个碳原子的衍生至芳烃的基团。此类基团的实例包括但不限于苯基、苄基、萘基。

术语“C5-C10杂芳基”是指在其环中含有5至10个碳原子并含有1至4个各自独立地选自O、S和N的杂原子的芳族杂环基团。条件是所述基团的环上不含两个相邻的O原子或两个相邻的S原子。该杂环基团包括苯并稠环体系。C5-C10杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、咪唑基、呋喃基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异恶唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、二氮杂萘基、异吲哚基、嘌呤基、苯并噻吩基、苯并噻唑基。

本发明所提及的化合物药学上可接受的盐可以是酸性盐，也可以是碱性盐。药学上可接受的盐可以是例如在链或环中具有氮原子的具有足够碱性的本发明的化合物的酸加成盐，例如与如下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸，或硫酸氢盐、或者与如下有机酸形成的酸加成盐：例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。另外，具有足够酸性的本发明的化合物的另一种适合的药学上可接受的盐是碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)、铵盐，或与提供生理学可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与如下物质形成的盐：钠离子、钾离子、N-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、葡甲胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、1-氨基-2,3,4-丁三醇。

本发明的药物组合物可以口服给药，例如是片剂、包衣片、锭剂、硬或软胶囊剂、溶液、乳剂或悬液的形式。给药还可以通过直肠方式进行，例如使用栓剂；局部或经皮方式，例如使用软膏剂、霜剂、凝胶或溶液；或者肠胃外方式，例如静脉内、肌内、皮下、鞘内或透皮，例如使用可注射的溶液。此外，给药可以通过舌下方式或者作为眼科制剂或气雾剂进行，例如是喷雾剂的形式。

关于片剂、包衣片、锭剂或硬胶囊剂的制备，可以将本发明化合物与药学上惰性的无机或有机赋形剂混合。适合于片剂、锭剂或硬胶囊剂的赋形剂实例包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石或硬脂酸或其盐。

适用于软胶囊剂的赋形剂例如包括植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等；不过根据活性成分的性质，也可以是这样的情况，软胶囊剂根本不需要赋形剂。

关于溶液和糖浆剂的制备，可以使用的赋形剂例如包括水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。

关于可注射溶液的制备，可以使用的赋形剂例如包括水、醇、多元醇、甘油和植物油。

关于栓剂和局部或经皮用药，可以使用的赋形剂例如包括天然或硬化的油、蜡、脂肪和半固体或液体多元醇。

术语药学上可接受的载体和/或助剂的实例为：糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉类，例如玉米淀粉、木薯淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和甲基纤维素；磷酸钙类，例如磷酸二钙和磷酸三钙；硫酸钠；硫酸钙；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；硬脂酸碱土金属盐，例如硬脂酸镁和硬脂酸钙；植物油类，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；非离子、阳离子和负离子表面活性剂；聚乙二醇；脂肪醇类；和谷物水解固形物以及其它无毒的可相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧剂、润滑剂、着色剂等在药物制剂中常用到的辅料。

具体实施方式

实施例1：CW-1的制备

1)将干燥的湖北贝母(Fritillariahupehensis Hsiao et K.C.)打成粗粉后，80％乙醇加热回流提取2次，每次3h。将两次的提取液合并后减压浓缩，得到总浸膏；

2)向总浸膏中先加入3％的盐酸溶液使其酸化，充分搅拌后静置，取上清液，氨水碱化至pH值大于9。用水饱和后的石油醚(10L×3)，石油醚/醋酸乙酯(1:1，10L×3)以及醋酸乙酯(10L×3)对碱液依次分段萃取；

3)水饱和的石油醚萃取部分的生物碱，以环己烷/醋酸乙酯/二乙胺通过正相硅胶色谱柱反复分离纯化得到CW-1(湖贝丙素)。

湖贝丙素氢碳谱数据：

实施例2：CW-2的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(140μL,1mmol),醋酐(66μL,0.7mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)，该反应在室温下搅拌5h。TCL监测反应完全后，向反应液中加水淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的NaHCO3洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物200.7mg，产率91％。ESI-MS,m/z:440.20[M+H]+

实施例3：CW-3的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入正丁酸(91μL,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应2h。TCL监测反应完全后，加10％的NaHCO3溶液搅拌淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaCl2洗两遍，再用H2O2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物210.5mg，产率90.1％。ESI-MS,m/z:468.20[M+H]+

实施例4：CW-4的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水的CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(280μL,2mmol),三甲基乙酰氯(123μL,1mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)，反应溶液在氮气的保护下，室温下反应5h。TCL监测反应完全后，向反应液中加水淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaHCO3洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝4:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物211.2mg，产率87.7％。ESI-MS,m/z:482.30[M+H]+

实施例5：CW-5的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入正己酸(179μL,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应2h。TCL监测反应完全后，加10％的NaHCO3溶液搅拌淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaCl2洗两遍，再用H2O2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物221.7mg，产率89.5％。ESI-MS,m/z:496.30[M+H]+。

实施例6：CW-6的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入2-噻吩甲酸(128mg,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应3.5h。TCL监测反应完全后，加10％的NaHCO3溶液搅拌淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaCl2洗两遍，再用H2O2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物231.4mg，产率91.2％。ESI-MS,m/z:508.20[M+H]+

实施例7：CW-7的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入2-呋喃羧酸(112mg,1mmol)，0℃下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI,575mg,3mmol)，最后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)。反应溶液在氮气的保护下，室温下反应6h。TCL监测反应完全后，加10％的NaHCO3溶液搅拌淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaCl2洗两遍，再用H2O2洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝6:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物223.5mg，产率91％。ESI-MS,m/z:492.20[M+H]+。

实施例8：CW-8的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水的CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(280μL,2mmol),苯甲酰氯(116μL,1mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP,12mg,0.1mmol)，反应溶液在氮气的保护下，室温下反应过夜。TCL监测反应完全后，向反应液中加水淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaHCO3洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱机比例为石油醚：丙酮＝5:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物238.2mg，产率95％。ESI-MS,m/z:502.20[M+H]

实施例9：CW-9的制备

称取CW-1(200mg,0.5mmol)于10ml圆底烧瓶，向其中加入无水的CH2Cl2(5ml)作溶剂，再加入三乙胺(280μL,2mmol),对甲基苯磺酰氯(286mg,1.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP,60mg,0.5mmol)，反应溶液在氮气的保护下，室温下反应过夜。TCL监测反应完全后，向反应液中加10％NaHCO3淬灭反应。反应液加H2O2和CH2Cl2(1:1)进行萃取(2次)，合并CH2Cl2层，用1:1的饱和NaCl洗两遍，再用水洗两遍，最后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得到粗产品。硅胶柱色谱分离，洗脱剂比例为石油醚：丙酮＝8:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物238.2mg，产率95％。ESI-MS,m/z:552.20[M+H]+。

实施例10：CW-10的制备

取化合物CW-9(300mg,0.53mmol)10ml圆底烧瓶，加入干燥的苯(1.59ml)，再加入DMSO(2.65ml)，在氮气保护下加入叔丁醇钾(500mg，5.3mmol)，60℃下反应1h，TLC检测反应完全，原料消失。用饱和NaHCO3淬灭，EA萃取三次，EA层分别经饱和食盐水和水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂。粗品经过硅胶柱层析纯化，洗脱剂比例为PE：EA＝7:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物化合物176mg，产率85％。ESI-MS,m/z:380.20[M+H]+。

实施例11：CW-11的制备

取化合物CW-1(200mg,0.5mmol)溶于干燥的CH2Cl2(5ml)中，在0℃下缓慢滴加二氯亚砜(SOCl2，0.36ml，5mmol)，加完后，反应液移至室温，在氮气的保护下反应3h，TLC检测反应完全，原料消失。向反应液中滴加饱和NaHCO3至无气泡产生，分层萃取，水层用CH2Cl2萃取两次，合并有机相，有机层分别经饱和食盐水和水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂。粗品经过硅胶柱层析纯化，洗脱剂比例为PE：EA＝10:1，同时在洗脱剂中加入1‰的三乙胺，最终得到产物200mg，产率96％。ESI-MS,m/z:416.10[M+H]+

生物活性试验

1、抗人非小细胞肺癌细胞(A549)增殖活性试验

1)试验材料：本发明实施例的化合物、贝母中常见的异甾体生物碱、5-氟尿嘧啶及人非小细胞肺癌细胞(A549)

2)癌细胞株培养

将A549细胞置于10％的FBS、1％的青霉素、1％的链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，移去就培养基，加PBS清洗，再用2.5％的胰蛋白酶消化3min，加入含血清的培养基终止消化，用枪头将细胞由培养瓶低吹打下来，1200r/min下离心3min去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用于实验。

3)A549细胞的体外抗肿瘤活性实验

A实验分组及药物处理

本实验各个测试化合物都分为8个组，其中包括6个给药组，1个对照组，和1个空白组。

B接种癌细胞于96孔板

选用对数生长期的癌细胞，经胰蛋白酶消化完成后将A549细胞从瓶底吹打下来，转移到离心管中，1200r/min下离心3min去除培养基，每孔株加入对应的培养基配制成5×104/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱培养24h。

C给药于96孔板

细胞铺板24h后即可进行细胞给药，对照组与调零组分别加入不含药物，含有对应溶解药物的溶剂的的培养基100μL，实验组加入不同药物浓度梯度的培养液100μL，每个剂量设6个平行孔，给完药后在5％CO2，37℃的饱和湿度的无菌恒温箱中培养48h。

D比色法实验

培养48h，孔加入20ul新鲜配制的5mg/ml的MTT无菌溶液，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150ulDMSO溶解紫色结晶沉淀，将96孔板放在摇床上避光慢速、水平震荡10min，然后用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光值。

计算各个浓度下的生长抑制率，GI(生长抑制率)＝1-药物对照组OD值/对照组OD值×100％，其中各项OD值均已扣除空白组实验值。本实验以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照，每个化合物重复三次取平均值，实验结果用平均值±标准偏差表示

表1化合物的给药浓度及IC50

从表1可知，本发明的化合物抗人非小细胞肺癌细胞(A549)增殖活性明显高于其他贝母衍生物及阳性对照5-氟尿嘧啶。

2、抗白血病K562细胞株增殖活性试验

1)试验材料：本发明实施例的化合物、贝母中常见的异甾体生物碱、三尖杉酯碱及人慢性髓系白血病细胞株(K562)

2)癌细胞株培养

将K562细胞置于10％的FBS、1％的青霉素、1％的链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，将细胞用枪头吹打下来，1200r/min下离心3min去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用于实验。

3)K562细胞的体外抗肿瘤活性实验

A实验分组及药物处理

本实验各个测试化合物都分为8个组，其中包括6个给药组，1个对照组，和1个空白组。

B接种癌细胞于96孔板

选用对数生长期的癌细胞，将K562细胞从瓶底吹打下来后，转移到离心管中，1200r/min下离心3min去除培养基，每孔株加入对应的培养基配制成5×104/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱培养24h。C给药于96孔板

细胞铺板24h后即可进行细胞给药，对照组与调零组分别加入不含药物，含有对应溶解药物的溶剂的的培养基100μL，实验组加入不同药物浓度梯度的培养液100μL，每个剂量设6个平行孔，给完药后在5％CO2，37℃的饱和湿度的无菌恒温箱中培养48h。

D比色法实验

培养48h，孔加入20ul新鲜配制的含5mg/mlMTT的无菌溶液，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150ulDMSO溶解紫色结晶沉淀，将96孔板放在摇床上避光慢速、水平震荡10min，然后用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光值。

计算各个浓度下的生长抑制率，GI(生长抑制率)＝1-药物对照组OD值/对照组OD值×100％，其中各项OD值均已扣除空白组实验值。本实验以三尖杉酯碱为阳性对照，每个化合物重复三次取平均值，实验结果用平均值±标准偏差表示(x±s)。

表2化合物的给药浓度及IC50

从表2可知，本发明的化合物抗白血病K562细胞的增殖活性明显高于作为对照的其他贝母衍生物。

3、抗人髓状甲状腺导管肿瘤细胞(TT)增值活性试验

1)试验材料：本发明实施例的化合物、贝母中常见的异甾体生物碱、5-氟脲嘧啶及人髓状甲状腺导管肿瘤细胞(TT)

2)癌细胞株培养

将TT细胞置于10％的FBS、1％的青霉素、1％的链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，移去就培养基，加PBS清洗，再用2.5％的胰蛋白酶消化3min，加入含血清的培养基终止消化，用枪头将细胞由培养瓶低吹打下来，1200r/min下离心3min去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞制成细胞悬液，用于实验。

3)TT细胞的体外抗肿瘤活性实验

A实验分组及药物处理

本实验各个测试化合物都分为9个组，其中包括7个给药组，1个对照组，和1个空白组。

B接种癌细胞于96孔板

选用对数生长期的癌细胞，经胰蛋白酶消化完成后将TT细胞从瓶底吹打下来，转移到离心管中，1200r/min下离心3min去除培养基，每孔株加入对应的培养基配制成2×104/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱培养24h。

C给药于96孔板

细胞铺板24h后即可进行细胞给药，对照组与调零组分别加入不含药物，含有对应溶解药物的溶剂的的培养基100μL，实验组加入不同药物浓度梯度的培养液100μL，每个剂量设6个平行孔，给完药后在5％CO2，37℃的饱和湿度的无菌恒温箱中培养48h。

D比色法实验

培养48h，孔加入20ul新鲜配制的5mg/mlMTT的无菌溶液，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养4h。小心弃去上清液，并加入150ulDMSO溶解紫色结晶沉淀，将96孔板放在摇床上避光慢速、水平震荡10min，然后用酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光值。

计算各个浓度下的生长抑制率，GI(生长抑制率)＝1-药物对照组OD值/对照组OD值×100％，其中各项OD值均已扣除空白组实验值。本实验以5-氟尿嘧啶为阳性对照，每个化合物重复三次取平均值，实验结果用平均值±标准偏差表示

表3化合物的给药浓度及IC50

从表3可知，本发明的化合物人髓状甲状腺导管肿瘤细胞(TT)增殖活性明显高于其他贝母衍生物及阳性对照5-氟尿嘧啶。

4、HepG2、MCF7、174T、PANC-1、Hela抑制性试验

1)试验材料：CW-1化合物；人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF7、人结肠腺癌细胞174T、人胰腺癌细胞PANC-1、人宫颈癌细胞Hela及人前列腺癌细胞PC-3。

2)癌细胞株传代与培养

HepG2、MCF7、174T、PANC-1、Hela细胞置于含10％的FBS、1％的青霉素、1％的链霉素的DMEM培养基中培养，PC-3细胞置于10％的FBS、1％的青霉素、1％的链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞长满瓶底后，弃去培养液，用适量的PBS洗去残留培养基，加入0.25％的胰蛋白酶适量消化1-3分钟，加入含有胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶消化，离心去除上清液，更换培养液，分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验

3)体外抗肿瘤活性实验

实验分组及药物处理：每个癌细胞株分为8个组，组1为空白组(培养板孔中不接种癌细胞，仅加入培养基，其他操作和实验组一致)，组2为阴性对照组(培养板上接种癌细胞，不加入受试药物，其他操作和实验组一致)，组3～8为实验组，根据预实验结果，实验组分别设6个剂量，各种药物的溶剂均为每种细胞相对应的培养基。使用广谱抗癌药物5-F-脲嘧啶作为阳性对照。给药剂量见表4。

接种癌细胞于96孔板：选用对数生长期的癌细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化数分钟后，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，离心去除培养基，每种细胞株加入对应的培养基配制成合适的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100ul，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱培养24h，使其贴壁。

表4化合物的给药浓度及IC50

由表4的实验结果可知，CW-1对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF7、人结肠腺癌细胞174T、人胰腺癌细胞PANC-1、人宫颈癌细胞Hela及人前列腺癌细胞PC-3这六种癌都有明显抑制作用，与5-氟脲嘧啶的细胞活性检测结果有显著差异(P<0.05)，对HepG2、PANC-1及PC-3癌细胞抑制作用是5-氟脲嘧啶的5倍以上。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

一类特殊的异甾体生物碱及其衍生物的用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。