专利摘要

本发明属于化学医药领域，具体涉及氯喹衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种氯喹衍生物，其结构如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述氯喹胆固醇衍生物的制备方法和用途。本发明提供的氯喹胆固醇衍生物能有效抑制大鼠成纤维细胞的增殖，并能有效治疗肺纤维化，且能发挥抗炎作用，为制备抗纤维化、抗炎及抗肿瘤药物提供了新的选择。

权利要求

1.氯喹胆固醇衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

其中，R为n＝1～4。

2.根据权利要求1所述的氯喹胆固醇衍生物，其特征在于：所述氯喹胆固醇衍生物的结构式为

3.权利要求1或2所述的氯喹胆固醇衍生物药学上可接受的盐。

4.一种药物组合物，是由权利要求1或2所述的氯喹胆固醇衍生物或权利要求3所述的盐，添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

5.一种制剂，是以权利要求1或2所述的氯喹胆固醇衍生物或权利要求3所述的盐为主要成分，添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的；所述的制剂为片剂、胶囊剂、栓剂、纳米制剂或脂质体中的至少一种。

6.根据权利要求1或2所述的氯喹胆固醇衍生物、权利要求3所述的盐、权利要求4所述的药物组合物或权利要求5所述的制剂在制备治疗化学药物诱导的纤维化疾病、遗传性囊性纤维化疾病、全身性或者局部炎症反应、治疗急慢性肝炎或其辅助治疗、治疗肿瘤或肿瘤转移的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的化学药物诱导的纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、胰腺纤维化、消化道纤维化或皮肤纤维化。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的遗传性囊性纤维化疾病包括肺部囊性纤维化、肾囊性纤维化、肝囊性纤维化、胰腺囊性纤维化、消化道囊性纤维化或皮肤囊性纤维化。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：全身性或者局部炎症反应包括类风湿性关节炎、过敏性与自身免疫性炎症性疾病；所述的过敏性与自身免疫性炎症性疾病包括结缔组织病、系统性红斑狼疮、重症多肌炎、严重的支气管哮喘、皮肌炎或血管炎。

10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤转移为易转移恶性肿瘤；所述的易转移恶性肿瘤为黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、肝细胞癌、肾癌、白血病、肉瘤或淋巴瘤中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述肺癌为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。

12.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的在治疗肿瘤中的用途是用于使肿瘤中异常的血管恢复正常。

13.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：用于肿瘤化疗药物的增敏剂；所述的肿瘤化疗药物为细胞毒类肿瘤化疗药物；所述的细胞毒类肿瘤化疗药物为阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春碱、长春新碱、秋水仙碱、喜树碱、羟喜树碱、环磷酰胺，异环磷酰胺、氮芥、甲酰溶肉瘤素、磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、白消安、甲氧芳芥、甲氧氮芥、抗瘤氨酸、抗瘤新芥、硝卡芒芥、嘧啶苯芥、甲尿嘧啶氮芥、尿嘧啶氮芥、甘露醇氮芥、苯丙氨酸氮芥、二溴甘露醇、福莫司汀、邻丙氨酸硝卡芥、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素D、伊立替康、鬼臼毒素类依托泊甙或替尼泊甙中的至少一种。

14.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：用于增强肿瘤细胞的放射线敏感性。

15.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：用于逆转肿瘤细胞多药耐药现象。

说明书

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及氯喹胆固醇衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

羟基氯喹是常用的抗疟疾药物，也可用于系统性红斑狼疮治疗以及类风湿性关节炎的治疗，越来越多的文献报道其对心血管疾病发面具有明显的预防作用，新的运用方向正有待研究。因此，寻找新的产生类似作用的化合物就显得尤为重要。羟基氯喹的结构式如下：

专利CN101428025A保护了该化合物在化疗药物治疗多发性骨髓瘤中的增敏作用，其能够明显增加化疗药物阿霉素、表阿霉素、顺铂及米托蒽醌等对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。

发明内容

本发明提供了一种氯喹胆固醇衍生物，其结构如式Ⅰ所示：

其中，R为 n＝1～8。

作为本发明优选的方案，R为 n＝1～4。

进一步优选的，R为 n＝1～4。

作为本发明最优的方案，所述氯喹胆固醇衍生物的结构式为

本发明还提供了上述氯喹胆固醇衍生物的制备方法，包括以下步骤：

先将胆固醇与HO-R-OH通过缩合连接，再与碱化后的羟基氯喹缩合得到氯喹胆固醇衍生物，其合成路线如下：

其中，R为 n＝1～8。

上述氯喹胆固醇衍生物制备方法的具体操作步骤为：

将胆固醇和HO-R-OH溶于二氯甲烷中，以DMAP(4-二甲氨基吡啶)为催化剂，常温反应12～48小时，得到中间体1；将中间体1与羟基氯喹溶于二氯甲烷中，用DMAP、EDCI(1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)作为催化剂，常温反应36～50小时，得到氯喹胆固醇衍生物。所述胆固醇和HO-R-OH的摩尔比为1︰1～10。所述胆固醇和DMAP的摩尔比为1︰1～10。所述中间体1与羟基氯喹的摩尔比为1～10︰1。所述DMAP、EDCI与中间体1的摩尔比为1～10︰1～10︰1。

本发明还提供了上述氯喹胆固醇衍生物药学上可接受的盐或水合物。

一种药物组合物，是由式Ⅰ所示的氯喹胆固醇衍生物及其盐或水合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

一种制剂，是以式Ⅰ所示的氯喹胆固醇衍生物及其盐或水合物为主要成分，添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的；所述的制剂为片剂、胶囊剂、栓剂、纳米制剂或脂质体中的至少一种。

本发明还提供了上述式Ⅰ所示的氯喹胆固醇衍生物、其盐或水合物、药物组合物或制剂在治疗化学药物诱导的纤维化疾病、遗传性囊性纤维化疾病、全身性或者局部炎症反应、治疗急慢性肝炎或其辅助治疗、治疗肿瘤或肿瘤转移中的用途。

所述的化学药物诱导的纤维化疾病包括肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、胰腺纤维化、消化道纤维化或皮肤纤维化。

所述的遗传性囊性纤维化疾病包括肺部囊性纤维化、肾囊性纤维化、肝囊性纤维化、胰腺囊性纤维化、消化道囊性纤维化或皮肤囊性纤维化。

全身性或者局部炎症反应包括类风湿性关节炎、过敏性与自身免疫性炎症性疾病；所述的过敏性与自身免疫性炎症性疾病包括结缔组织病、系统性红斑狼疮、重症多肌炎、严重的支气管哮喘、皮肌炎或血管炎。

所述的肿瘤转移为易转移恶性肿瘤；所述的易转移恶性肿瘤为黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾癌、白血病、肉瘤或淋巴瘤中的至少一种。

所述的在治疗肿瘤中的用途是用于使肿瘤中异常的血管恢复正常。

所述的在治疗肿瘤中的用途还可以用于肿瘤化疗药物的增敏剂。所述的肿瘤化疗药物为细胞毒类肿瘤化疗药物。所述的细胞毒类肿瘤化疗药物为阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、长春碱、长春新碱、秋水仙碱、喜树碱、羟喜树碱、环磷酰胺，异环磷酰胺、氮芥、甲酰溶肉瘤素、磷酰胺氮芥双甘氨酸乙酯、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、塞替派、白消安、甲氧芳芥、甲氧氮芥、抗瘤氨酸、抗瘤新芥、硝卡芒芥、嘧啶苯芥、甲尿嘧啶氮芥、尿嘧啶氮芥、甘露醇氮芥、苯丙氨酸氮芥、二溴甘露醇、福莫司汀、邻丙氨酸硝卡芥、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素D、伊立替康、鬼臼毒素类依托泊甙或替尼泊甙中的至少一种。

所述的在治疗肿瘤中的用途还可以用于增强肿瘤细胞的放射线敏感性。

所述的在治疗肿瘤中的用途还可以用于逆转肿瘤细胞多药耐药现象。

本发明提供的氯喹胆固醇衍生物能有效抑制大鼠成纤维细胞的增殖，并能有效治疗肺纤维化，且能发挥抗炎作用，为制备抗纤维化、抗炎及抗肿瘤药物提供了新的选择。

附图说明

图1不同浓度化合物1处理的大鼠成纤维细胞，在24h时570nm波长下吸光度值。

图2化合物1和硫酸羟基氯喹用做抗肺纤维化治疗药物的动物实验研究结果。其中，A图是H&E染色，B图是评价胶原沉积水平的Masson染色。

图3大鼠肺组织裂解后总蛋白水平的western blot(蛋白印迹实验)分析表明，化合物1能够抑制NF-κB的表达，发挥抗炎作用，以达到部分抗肺纤维化作用。

具体实施方式

实施例1 2-(4-(7-氯喹林-4-氨基)戊基-(乙基)氨乙基)-胆固醇丁二酸酯(化合物1)的合成

将胆固醇、丁二酸酐、DMAP按摩尔比1︰2.5︰2.5比例投于适量二氯甲烷中，常温搅拌48小时，反应结束时用1mol/L HCl萃取5次，再用200mL水洗5次，除去大部分二氯甲烷，浓缩，加入100mL冰醋酸，再除去所有溶剂至干，在布氏漏洞中用少许冰醋酸多次洗涤产物，直至洗到白色，60℃烘干过夜，即得到胆固醇琥珀酸单脂。

将硫酸羟基氯喹用NaOH溶液进行脱盐烘干处理后，羟基氯喹、胆固醇琥珀酸单脂、DMAP、EDCI(1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)按照摩尔比1︰1.2︰1.2︰1.2比例投料反应。先将羟基氯喹与0.6倍EDCI溶于少量二氯甲烷中搅拌30分钟，将余下的EDCI与DMAP和胆固醇琥珀酸单脂投入反应烧瓶中，补充适量二氯甲烷后进行常温搅拌反应48小时。用流动相(体积比为二氯甲烷︰甲醇＝7︰1)对反应进行点板监测，反应结束时将反应液浓缩，然后用柱层析分离，流动相为二氯甲烷︰甲醇＝100︰1(体积比)，得到淡黄色半固体化合物1。

1H-NMR(400Hz,CDCl3):δ8.1(d,J＝5.2Hz,1H)，7.95(d,J＝2Hz,1H)，7.71(d,J＝8.8Hz,1H)，7.35(dd,J＝8.8,2Hz,1H)，6.42(d,J＝5.6Hz,1H)，5.33(s,1H)，5.16(d,J＝7.2Hz,1H)，4.60(m,2H)，4.17(t,J＝6Hz,2H)，3.73(m,1H)，3.69(s,1H)，2.70(t,J＝6Hz,2H)，2.62(t,J＝2.8Hz，1H)，2.59-2.49(m,8H)，2.29(d,J＝7.6Hz,2H)，2.02-1.92(m,3H)，1.84-1.40(m,13H)，1.32(d,J＝6Hz,3H)，1.26-1.1(m,7H)，1.08(s,1H)，1.00-0.97(m,8H)，0.91(d,J＝6.4Hz,3H)，0.87(d,J＝1.6Hz,3H)，0.86(d,J＝1.6Hz,3H)，0.67(s,1H)，0.66ppm(s,3H)。

本发明以下实施例中的A549细胞购于ATCC(美国模式培养物集存库)，SD大鼠和BALB/c裸鼠购于北京维通利华，Annexin V/PI凋亡试剂盒购于凯基基因，LC3B抗体、CD11b抗体、NF-κB抗体和Gr1抗体购于abcam公司。博莱霉素购于美国sigma公司。

实施例2本发明化合物对大鼠成纤维细胞增殖抑制试验

从大鼠肺组织分离成纤维细胞，使用4-8代细胞进行试验，经过Vimentin(波形蛋白)免疫荧光染色鉴定确实为成纤维细胞。用含10％FBS(胎牛血清，购自GIBCO)的DMEM培养基对细胞进行培养。

96孔板每孔接种4000个成纤维细胞，贴壁后加入化合物1处理，分为DMSO对照组，设置浓度梯度从1～100μM，处理24h，加入MTT(四唑溴盐)孵育后结晶紫溶于DMSO(二甲基亚砜)在570nm波长下检测吸光度值。

实验结果见图1所示：不同浓度化合物1处理的大鼠成纤维细胞，在24h时570nm波长下吸光度值，随着浓度增加，生长抑制作用就越明显，其IC50值大约在10μM左右。

实施例3化合物1抗肺纤维化动物实验

SD大鼠，雌性，体重约250克，对大鼠气管内单次给予大剂量博莱霉素(5mg/kg体重)进行肺纤维化造模处理，次日开始给药，设置PBS(磷酸盐缓冲溶液)对照组、空脂质体对照组、硫酸羟基氯喹对照组(8mg/kg/day)、化合物1治疗组(20mg/kg/day)。试验每组15只大鼠。分别在第7天、第14天、第28天处死大鼠，取出肺组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋后，切片，H&E(苏木精-依红)染色和Masson染色(三色染色)，进行治疗效果评价。

实验结果见图2所示：化合物1和硫酸羟基氯喹用做抗肺纤维化治疗药物的动物实验研究结果，A图是H&E染色，B图是评价胶原沉积水平的Masson染色，试验结果表明，化合物1和硫酸羟基氯喹都能抑制肺纤维化的发展，达到治疗目的。

实施例4磷酸化NF-κB蛋白的免疫印迹检测

SD大鼠，雌性，体重约250克，对大鼠气管内单次给予大剂量博莱霉素(5mg/kg体重)进行肺纤维化造模处理，次日开始给药，设置PBS(磷酸盐缓冲溶液)对照组、空脂质体对照组、硫酸羟基氯喹对照组(8mg/kg/day)、化合物1治疗组(20mg/kg/day)。试验每组5只大鼠。在第14天处死大鼠，取出肺组织，大鼠肺组织裂解后NF-κB总蛋白以及磷酸化水平的western blot检测。

实验结果见图3所示：分析表明，化合物1能显著抑制磷酸化NF-κB的表达，发挥抗炎作用。

实施例5化合物1诱导A549细胞凋亡检测

A549细胞每孔5*10^5个接种于6孔板，贴壁以后加入化合物1以20μM、30μM、50μM、100μM浓度处理48h后进行Annexin V、PI染色，用流式细胞仪器进行检测，以Annexin V(+)/PI(-)作为凋亡细胞进行统计分析。

实验结果：发现对照组、20μM、30μM、50μM、100μM浓度下凋亡细胞的比例分别为0.28％(±0.04％)、0.49％(±0.28％)、0.78％(±0.18％)、14.53％(±6.17％)、29％(±7.13％)。

实验结果说明，较高浓度(50μM及以上)的化合物1能诱导肿瘤细胞凋亡达到抗肿瘤作用。

实施例6化合物1抗非小细胞肺癌动物实验

将A549细胞培养后收集，用1640双无培养基重悬，从尾静脉注射肿瘤细胞进行原位肺癌模型建立，每只老鼠接种3*10^6个细胞，两天后开始给药，设置生理盐水对照组、空脂质体对照组、硫酸羟基氯喹组(8mg/kg/2days)、化合物1治疗组(40mg/kg/2days)，每组6只老鼠。给药10次后，处死裸鼠，取出肺组织，4％多聚甲醛固定，在体视显微镜下对肺组织肿瘤结节进行计数。

实验结果：生理盐水对照组、空脂质体对照组、硫酸羟基氯喹组、化合物1治疗组肿瘤结节数分别为199(±53.1)、187.7(±43.1)、14.6(±9.3)、28(±3.3)。

实验结果说明，硫酸羟基氯喹和化合物1在小鼠体内有很好的抗肿瘤效果。

实施例7裸鼠肺组织MDSC细胞检测

接种A549肿瘤细胞的裸鼠，两天后开始给药，设置生理盐水对照组、空脂质体对照组、硫酸羟基氯喹组(8mg/kg/2days)、化合物1治疗组(40mg/kg/2days)，每组6只老鼠。给药10次后，处死裸鼠，取出肺组织，用胶原酶消化2h，将红细胞裂解处理后将细胞计数，每管收集1×106个细胞(包含肿瘤细胞以及肺组织细胞)，进行CD11b、Gr1染色，流式细胞以检测，MDSC细胞为CD11b(+)/Gr1(+)细胞,进行统计学分析。

实验结果：生理盐水对照组、空脂质体对照组、硫酸羟基氯喹组、化合物1治疗组CD11b(+)/Gr1(+)细胞比例分别为13.07％(±4.13％)、15.27％(±3.86％)、10.33％(±3.43％)、5.84％(±0.43％)。

实验结果说明，化合物1治疗后的小鼠肿瘤微环境中促肿瘤生长的MDSC细胞被明显抑制。

氯喹胆固醇衍生物及其制备方法和用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。