专利摘要
本发明提供了一种高特异性抗CD20单克隆抗体及其应用，具体地，提供了一种多肽，其特征在于，具有如式I的结构：X0-Cys-Pro-Tyr-Ala-Asn-Pro-Ser-Leu-Cys-X1-COOH，式I；其中，X0为无，或乙酰基（CH3-CO-）等保护基，X1为无，或1-10个氨基酸构成的肽段；且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性。本发明多肽可特异性结合于抗CD20单克隆抗体，从而通过ELISA准确地测定样品内极微量的利妥昔单抗(Rituximab)等抗CD20单克隆抗体，方法简单、经济，特异性强，灵敏度高。
权利要求
1.一种多肽，其特征在于，具有如式I的结构：
X0-Cys-Pro-Tyr-Ala-Asn-Pro-Ser-Leu-Cys-X1
式I；
其中，X0为无，或保护基，或1-10个氨基酸构成的肽段；X1为无，或1-10个氨基酸构成的肽段；
且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的保护基包括乙酰基（CH3-CO-）或叔丁氧羰基（Boc）；和/或
X0为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段；和/或
X1为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述抗CD20单克隆抗体包括利妥昔单抗(Rituximab)。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，式I多肽中的两个Cys之间形成链内二硫键。
5.一种偶联物，其特征在于，所述的偶联物是权利要求1所述多肽与载体蛋白偶联形成的偶联物。
6.如权利要求5所述的偶联物，其特征在于，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白或γ球蛋白。
7.权利要求1所述多肽或权利要求5所述偶联物的用途，其特征在于，用于制备检测样品中抗CD20单克隆抗体的试剂、检测板或试剂盒。
8.一种检测样品中是否含有抗CD20单克隆抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将样品与权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的偶联物接触；
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在抗CD20单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，将样品与权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的偶联物接触，并且在步骤(b)中通过ELISA法进行检测。
10.一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的偶联物。
11.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的权利要求1所述的多肽或权利要求5所述的偶联物，或者所述的试剂盒含有权利要求10所述的检测板。
说明书
技术领域
本发明涉及生物样本检测领域，具体地，涉及利妥昔单抗(Rituximab)等抗CD20单克隆抗体的检测。
背景技术
目前已有多种方法用于检测利妥昔等重组人-鼠嵌合抗CD20单克隆抗体。如利用利妥昔单抗的单克隆抗体或多克隆抗体用ELISA法检测。有报道利用未标记的羊抗利妥昔单抗多克隆抗体作为包被物，HRP-羊抗人Fc片段作为二抗建立ELISA实验来检测利妥昔单抗。也有人设计了一种鼠抗利妥昔单抗MB2A4，用该抗体作为包被物，HRP-羊抗人Fc片段作为二抗建立ELISA实验来检测利妥昔单抗。还可以利用猴血清吸附过的未标记的羊抗人作为包被物，猴血清吸附过的HRP-羊抗人作为二抗建立ELISA实验来检测利妥昔单抗。这些方法都是常规的基于抗原-抗体的ELISA法。
上述的这些方法仍存在一些缺点。比如多克隆抗体特异性不强，单克隆抗体成本较高，且利用抗原和抗体结合原理设计的常规ELISA法都存在背景较高及一定程度的交叉反应，在检测临床血样时往往尤其突出，血液中其他成分严重干扰利妥昔单抗的检测。
因此，本领域迫切需要建立一种新的用于检测抗CD20单克隆抗体的背景低、专一性强、灵敏度高、成本低的ELISA方法，以便用于检测生物样品中的CD20单克隆抗体。
发明内容
本发明提供了一种高特异性和灵敏度的检测抗CD20单克隆抗体的多肽及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种多肽，具有如式I的结构：
X0-Cys-Pro-Tyr-Ala-Asn-Pro-Ser-Leu-Cys-X1
式I；
其中，X0为无，或保护基，或1-10个氨基酸构成的肽段；X1为无，或1-10个氨基酸构成的肽段；
且所述多肽具有与抗CD20单克隆抗体结合的活性。
在另一优选例中，所述的抗CD20单克隆抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、非人源化抗体、单链抗体、抗体片段。
在另一优选例中，所述的抗CD20单克隆抗体为人-鼠嵌合抗体。
在另一优选例中，所述的抗CD20单克隆抗体来源于哺乳动物，较佳地来源与人或啮齿动物，更佳地，来源于人、小鼠或大鼠。
在另一优选例中，所述抗CD20单克隆抗体的最低浓度级别为1×10-1μg/ml。
在另一优选例中，所述的保护基包括乙酰基（CH3-CO-）或叔丁氧羰基（Boc）；和/或
X0为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段；和/或
X1为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段。
在另一优选例中，X1为乙酰基。
在另一优选例中，所述抗CD20单克隆抗体包括利妥昔单抗(Rituximab)。
在另一优选例中，式I多肽中的两个Cys之间形成链内二硫键。
在另一优选例中，所述多肽不结合于IBI302或VID等融合蛋白、 或 等单抗。
在另一优选例中，X0或X1不含有Cys残基。
本发明第二方面，提供了一种偶联物，所述的偶联物是本发明第一方面所述多肽与载体蛋白偶联形成的偶联物。
在另一优选例中，所述的偶联是通过式I多肽的羧基端偶联的。
在另一优选例中，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白或γ球蛋白。
在另一优选例中，所述蛋白质载体是血蓝蛋白或牛血清白蛋白。
本发明第三方面，提供了一种本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述偶联物的用途，用于制备检测样品中利妥昔单抗等抗CD20单克隆抗体的试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述样品包括为血液样品、血清样品、组织液样品或单抗药物样品。
本发明第四方面，提供了一种检测样品中是否含有利妥昔单抗等抗CD20单克隆抗体的方法，包括步骤：
(a)将样品与本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的偶联物接触；
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在抗CD20单克隆抗体。
本发明第五方面，提供了一种本发明第四方面所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，将样品与本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的偶联物接触，并且在步骤(b)中通过ELISA法进行检测。
本发明第六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的偶联物。
在另一优选例中，所述的测试条还含有抗体点样区。
在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。
本发明第七方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的偶联物，或者所述的试剂盒含有本发明第六方面所述的检测板。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CD20-acp肽的结构图。
图2显示了CD20-acp肽的制备及偶联操作流程。
图3显示了CD20-acp-BSA-ELISA法测定利妥昔单抗的选择性试验结果。将CD20-acp-BSA包被，浓度为100μg/孔。用含有10%人血清的IBI302、Avastin、VID、Humira和利妥昔单抗(Rituximab)等5种单克隆抗体药物（浓度为100μg/mL）做受检样品，HRP-羊抗鼠作为二抗测OD450nm吸收值。结果表明，以CD20-acp-BSA为包被物，对于利妥昔单抗单克隆抗体有高度特异性，与其它人源的抗体没有明显特异性结合，不与二抗产生明显的交叉反应，对人血清有很强的抗干扰能力。
图4显示了CD20-acp-BSA-ELISA法测定利妥昔单抗的线性范围试验结果。将CD20-acp-BSA包被，浓度为1μg/孔。制备利妥昔单抗单克隆抗体的标准样品，浓度分别为0.122、0.244、0.488、0.976、1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、和250μg/mL。结果表明，在0.122-250μg/mL范围内，利妥昔单抗单克隆抗体的浓度的对数值与免疫反应光吸收值（OD450nm值）呈线性关系。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次合成了一种高灵敏度的、高特异性结合生物样本中抗CD20单克隆抗体的多肽，本发明多肽及其ELISA方法稳定性强，灵敏度高，特异性强，能够测得样品中1×10-1μg/ml浓度级别的抗CD20单克隆抗体，作为ELISA反应中的抗原底物，从而克服常规ELISA法的背景高、交叉反应大、成本高的缺点，增强检测抗CD20单克隆抗体的专一性，并通过其高灵敏度的特性，能够检测到样品中微量的抗CD20单克隆抗体，从而实现在临床检测中的应用。在此基础上，完成了本发明。
活性多肽
在本发明中，术语“本发明多肽”、“CD20-acp”、“本发明抗CD20单克隆抗体结合肽”可互换使用，均指含有式I结构且能够与抗CD20单克隆抗体特异性结合的多肽，一种优选的本发明多肽如SEQ ID NO.:1所示。
此外，所述术语还包括具有与抗CD20单克隆抗体结合功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：X0为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段；和/或X1为8-9个、6-7个、4-5个或2-3个，更佳地1-2个氨基酸构成的肽段。应理解，通常，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常不会改变蛋白质的结构和功能。对本发明SEQ ID NO.:1所示多肽的氨基端或羧基端分别进行1-10个氨基酸的添加，并不会影响本发明多肽的基本功能。
本发明多肽中还包括一链内二硫键，其由天然或非天然氨基酸形成，优选的为链内两个Cys在适当的条件下形成。Cys之间形成二硫键的条件为本领域通用的条件。
在实际应用中，还可对本发明多肽进行进一步修饰以加强其稳定性。优选的例子包括对所述多肽加入保护基团，如乙酰基、叔丁氧羰基等。
本发明还包括附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的衍生蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的另一方面，还包括将本发明蛋白与载体蛋白偶联形成的蛋白偶联物。
如本文所用，本发明中的“蛋白质载体”或“载体蛋白”是指任何在免疫学上可接受的用于形成完全抗原的蛋白质，其可为例如，血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或γ球蛋白等。本发明的载体蛋白通常可连接于本发明多肽的羧基端。
发明还提供CD20-acp多肽的类似物。这些类似物与CD20-acp多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
抗CD20单克隆抗体
CD20是非糖基化的跨膜磷酸蛋白,分子质量为35kD,表达在大多数成熟B细胞表面,分化为浆细胞后,CD20表达消失。CD20可能参与B细胞成熟与分化的调节,作为钙离子通道发挥某些生物学作用。更为重要的是,95%以上的B细胞淋巴瘤表达CD20,且无显著内化及脱落。这些特点使其成为单克隆抗体疗法的理想靶抗原。临床试验结果表明,抗CD20单克隆抗体既可单独应用,亦可作为放射性同位素或细胞毒制剂的载体,其疗效显著,且使用安全,副反应小。
为了进一步评价抗CD20单抗的药代动力学和药效动力学，目前广泛开展了对抗CD20单抗的测定研究，需要一个更理想的高特异性、高灵敏度的方法。
本发明的目的在于通过制备与抗CD20单克隆抗体具有特异性结合功能的多肽，从而达到在极其微量的情况下，也能够准确地测定抗CD20单克隆抗体。
在本发明中，术语“抗CD20单克隆抗体”指特异性结合于细胞表面尤其是B细胞表面CD20抗原的单克隆抗体。可与本发明多肽结合的抗CD20单克隆抗体包括嵌合抗体、人源化抗体、非人源化抗体、单链抗体、抗体片段。一种优选的抗CD20单克隆抗体为人鼠嵌合CD20单克隆抗体，如利妥昔单抗。
制备方法
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一优选例中，本发明多肽CD20-acp，按其序列，采用固相合成的方法制备，经高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
当然，也可以采用重组表达等常规技术手段获得本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸用来表达或生产重组的CD20-acp多肽。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码CD20-acp多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
酶联免疫吸附测定法ELISA
酶联免疫吸附测定法ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
在本发明中，本发明多肽可作为固定在固相载体表面的抗原，并与样品中的CD20单克隆抗体接触，从而形成抗原-抗体复合物。
一种优选的酶标记二抗包括辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠或羊抗人二抗。在一优选例中，当生成抗原-抗体复合物且加入了HRP后，可加入HRP的底物TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）显色。显色的强度与固相载体上的HRP酶量正相关，也就与标本中受检的抗CD20单克隆抗体的量间接正相关。
检测板及其材料
本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。
此外，本发明检测抗CD20单克隆抗体的检测板，还可包括含有由可检测标记预先处理的本发明多肽的检测板，其包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的抗CD20单克隆抗体，优选被胶体金标记的抗CD20单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线。
检测方法与结果判定
平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约120μL，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。
阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；
阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；
无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明的抗CD20单克隆抗体或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的抗CD20单克隆抗体，优选被胶体金标记的抗CD20单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线。
在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的抗CD20单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的抗CD20单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为50μL/cm2；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μL/cm2。
检测方法与结果判定
平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约50-200μL，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。
阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；
阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；
无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。
在现有技术中，已有多种检测抗CD20单克隆抗体的检测试剂，其最低检测浓度约为50μg/ml左右。但在临床上，样本中抗CD20单克隆抗体的浓度往往远低于该浓度下限，因此造成了即使特异性很高，也无法测定较低浓度的CD20单克隆抗体。
因此，本发明基于式I所述的多肽，能够进行低浓度的抗CD20单克隆抗体的检测。实验证明，本发明多肽可检测最低达到1×10-1μg/ml的抗CD20单克隆抗体，因此可在临床上推广和应用。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明多肽或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明有益效果：
(1)灵敏度高：本发明多肽可结合的抗CD20单克隆抗体最低浓度达到1×10-1μg/ml，并在0.122-250μg/mL检测范围具有很好的线性关系，能够灵敏地测得样本中极微量的抗CD20单克隆抗体，克服了现有技术中无法精确测量微量抗体的缺陷，从而能够得以实际应用。在进行乙酰化封闭等优化后的本发明多肽效果更佳。
(2)背景极低，CD20-acp对重组人-鼠嵌合抗CD20单克隆抗体有很强的专一性作用，排除了杂蛋白的干扰，尤其是血清的干扰。因为本方法合成的肽很短，基本不对血清中其他蛋白质产生吸附作用。常规的方法一般采用单克隆抗体或多克隆抗体作为包被物。抗体常常有背景干扰。
(3)选择性强，对IBI302或VID等融合蛋白， 和 等临床使用的单抗药品没有交叉反应。本方法合成的多肽基本不对其他抗体产生非特性吸附作用。而常规的方法一般采用单克隆抗体或多克隆抗体作为包被物。这大分子蛋白质抗体对其他检测物蛋白质不可避免有不同程度的非特异性吸附。
(4)成本低廉，常规方法制备多克隆抗体或单克隆抗体，周期长，成本高。本方法简单，快速，成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1CD20-acp的合成
采用市售的多肽合成仪合成了CD20-acp多肽，其序列如SEQ ID NO.:1所示，(CPYANPSLC)。
实施例2CD20-acp的乙酰基封闭、成环鉴定、以及与载体蛋白的偶联
2.1乙酰基封闭
多肽固相合成到N末端氨基酸时，使用N-乙酰-氨基酸作为原料，这样合成的多肽的N末端就带了乙酰基。
2.2成环鉴定
多肽合成后，在pH8-9的溶液中进行氧化，形成二硫键。ELLMAN法用DTNB[5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）]试剂测定游离的巯基的方法可以鉴定是否成环。DTNB在412nm没有吸收，与游离的巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）。TNB在412nm有很强的吸收，故可以定量测定游离的巯基。
2.3与载体蛋白（BSA）的偶联
采用EDC进行偶联反应。一定量的带羧基的合成肽加入DMF溶解，再加DEC，超声振荡1h之后，离心取上清液，缓慢加入到BSA的磷酸盐缓冲液中，在室温下超声搅拌，反应过夜之后用磷酸盐缓冲液透析24h，除去未偶联的肽和多余的试剂。
实施例3通过ELISA法测定CD20-acp-BSA与利妥昔单抗的特异性
将CD20-acp-BSA包被ELISA孔板，浓度为100μg/孔。用含有10%人血清的IBI302、Avastin、VID、Humira和利妥昔单抗等5种单克隆抗体药物（浓度为100μg/mL）做受检样品，HRP-羊抗鼠作为二抗测OD450nm吸收值。
结果见图3，利妥昔单抗的OD450nm吸收值是其它几种单克隆抗体药物的6-10倍。
结论：以CD20-acp-BSA为包被物，对于利妥昔单抗单克隆抗体有高度特异性，与其它人源的抗体没有明显特异性结合，不与二抗产生明显的交叉反应，对人血清有很强的抗干扰能力。
实施例4通过ELISA法测定CD20-acp-BSA与利妥昔单抗的线性范围
将CD20-acp-BSA包被ELISA孔板，浓度为1μg/孔。制备利妥昔单抗单克隆抗体的标准样品，浓度分别为0.122、0.244、0.488、0.976、1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、和250μg/mL。
结果表明(图4)，在0.122-250μg/mL范围内，利妥昔单抗单克隆抗体的浓度的对数值与免疫反应光吸收值（OD450nm值）呈线性关系。
由此可见，本发明多肽对单克隆抗体的最低检出值可低达0.122μg/ml，远低于现有技术中的50μg/ml的最低检出值，能够充分应用于临床检验。
实施例5根据实施例4的标准曲线回归方程计算出利妥昔单抗单克隆抗体的检出量
按照实施例4的方法用含10%人血清的稀释液将单克隆抗体利妥昔单抗制成10、2.5、0.625μg/mL等3个浓度梯度的质控样品并进行测定，重复5次实验，由同一板上的标准曲线回归方程计算出的浓度为利妥昔单抗单克隆抗体的检出量。回收率用于验证该ELISA方法的检出率，同时也验证了该方法的重复性。
由表1可见，质控样品按照上述方法检测出的回收率在95.3%～113.9%的范围，变异系数范围在4.3%～8.6%之间。
表1.CD20-acp-BSA-ELISA法测定利妥昔单抗样品结果
实施例6CD20-acp衍生多肽的制备和鉴定
按照实施例1中的方法，合成制备了CD20-acp的衍生多肽。其序列如下所示：
实施例7衍生多肽的修饰和鉴定和偶联
7.1对实施例6中合成的SEQ ID NO.:2-6的多肽进行进一步修饰，其中对SEQ ID NO.:2-4的多肽进行乙酰基封闭，对SEQ ID NO.:5-6的多肽进行BOC修饰(碱性环境下)。
7.2按照实施例2.2中的方法对SEQ ID NO.:2-6的多肽进行成环鉴定。
7.3按照实施例2.3中的方法对SEQ ID NO.:2-6的多肽进行与载体蛋白的偶联。其中SEQ ID NO.:2-4的多肽偶联于KLH，SEQ ID NO.:5-6的多肽偶联于BSA。
实施例8衍生多肽蛋白偶联物的结合特异性测定
按照实施例3，对实施例7中制得的衍生多肽-蛋白偶联物进行抗CD20单抗的特异性测定，其中，SEQ ID NO.:2-6的多肽-蛋白偶联物与利妥昔单抗结合后的OD450值都能够达到0.5以上，且均高于SEQ ID NO.:2-6多肽-蛋白偶联物与其他单抗(Avastin、Humira)的结合力(OD450值为0.1-0.2)。
实施例9衍生多肽蛋白偶联物的结合灵敏度测定
按照实施例4的方法，将实施例7中制得的衍生多肽-蛋白偶联物包被ELISA孔板，浓度为1μg/孔。制备利妥昔单克隆抗体的标准样品。
结果表示，在0.100-250μg/mL范围内，利妥昔单克隆抗体的浓度的对数值与免疫反应光吸收值（OD450nm值）也能够呈良好的线性关系。
由此可见，SEQ ID NO.:2-6这些多肽的长度虽然经过一定扩展，但只要是具有如SEQ ID NO.:1所示多肽的衍生多肽，其所形成的多肽-蛋白偶联物也能够检出相当低浓度单克隆抗体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一种高灵敏度抗CD20单克隆抗体及其应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
动态评分
0.0