专利摘要

本发明公开了一种三萜化合物及其制备方法和用途，属于新化合物和其药物用途。其特征是通过有机溶剂提取结合吉拉德试剂处理、柱色谱等方法，从青龙衣的新鲜果皮中提取、分离纯化得到一种新的三萜类化合物α‑环戊酮‑21，22‑骈合3，10‑环氧‑5‑羟基‑齐墩果烷‑19，22‑二环[2，2，0]‑己烷，命名为青龙衣三萜酮A。本发明化合物经实验证实具有较好的抑制肿瘤细胞生长作用，具有抗肿瘤方面的应用前景。

权利要求

1.一种三萜化合物及其制备方法和抗肿瘤用途，其特征在于化学名为：α-环戊酮-21，22-骈合3，10-环氧-5-羟基-齐墩果烷-19，22-二环[2，2，0]-己烷，命名为青龙衣三萜酮A，具有化学结构式为：

。

2.权利要求1所述化合物青龙衣三萜酮A的制备方法，其特征在于：以核桃青皮为原料，经过醇提取→大孔树脂富集→吉拉德试剂纯化处理→乙醚萃取，萃取物再经反复柱色谱分离和重结晶手段分离纯化得到该化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：大孔树脂型号是AB-8或D101；吉拉德试剂选择吉拉德试剂P，柱色谱用载体选自正相硅胶、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，具体制备步骤如下：

（1）醇提：将核桃楸Juglans mandshurica Maxim青果皮鲜品低温40℃烘干，得到5kg的干燥品为原料，采用95%乙醇30L回流提取3次，每次2h，过滤并合并乙醇提取液，减压回收溶剂，干燥，得乙醇浸膏；

（2）富集纯化：将步骤（1）所得浸膏提取物用水分散至相对密度为1.18±0.05g/mL的溶液，经AB-8或D101型大孔树脂柱色谱富集纯化，分别以水、50%乙醇、80%乙醇依次洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调至密度为1.05g/mL的水溶液；水液反复5次穿过活性炭层（层高10cm，直径30cm）进行减压抽滤除杂，再将水液浓缩蒸干后，分别加入无水乙醇、吉拉德试剂P及12%（V/V）醋酸进行捏溶，在水浴50℃温热10h，反应结束后加水稀释，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏；

（3）正相硅胶柱色谱：取步骤（2）所得乙醚浸膏进行正相硅胶柱色谱分离，依次采用体积比为50:1、25:1、15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每一个比例洗脱3个柱体积，其中体积配比为15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂得到分离产物；

（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经步骤（3）分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱，以甲醇：水=1:2（V/V）洗脱3个柱体积弃去，再用甲醇：水=1:1（V/V）洗脱4个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液，收集后面三个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品；

（5）重结晶处理：将步骤（4）所得粗品采用甲醇重结晶两次，即可得到该化合物纯品。

4.权利要求1所述化合物青龙衣三萜酮A在在制备抗肿瘤药物方面的应用。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种具有癌细胞抑制作用的新的三萜类化合物。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的三大疾病之一，具有较高的发病率和死亡率。现代西医治疗主要以化疗为主，毒副作用较大，患者生存期质量明显下降。中医药在抗癌防癌、减少不良反应等方面发挥了独特优势，是研发新型抗肿瘤药物的宝库。目前来源于中草药的抗癌制剂，占总抗癌药30%以上，如紫杉类、喜树碱、长春新碱等已经作为对抗抗肿瘤的首选药。

青龙衣，是胡桃科胡桃属植物核桃楸 Juglands mandshurica Maxim.和核桃J.ragia L.未成熟果实的外果皮，在我国民间已有广泛的应用基础，常被用于急慢性胃痛、肠鸣腹泻、疥癣等。现代药理研究表明，它具有抗炎、镇痛、抗菌和抗肿瘤等作用，特别是抗肿瘤作用尤为显著，已被人们普遍认同。据报道青龙衣对胃癌、肺癌、肝癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤均有良好的疗效，但目前已发现的主要成分类型——萘醌类虽然抑制肿瘤生长效果显著，但毒性大，稳定性差，作为临床用药存在较大的安全隐患。为了充分利用该药用资源，本研究组继续开展了深入系统的化学成分研究，目的是从中筛选出高效、低毒、稳定的药效物质基础。在对青龙衣三萜类成分分离过程中，得到了一个新的三萜酮类化合物，已明确了该化合物的化学结构、药理活性和用途。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的三萜类化合物及其制备方法以及该新化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，解决目前青龙衣中主要抗肿瘤活性成分毒性大、稳定性差的弊端，扩大治疗肿瘤药物的来源。

本发明的新三萜类化合物是从青龙衣中提取、分离、纯化得到，化学名称为α-环戊酮-21，22-骈合3，10-环氧-5-羟基-齐墩果烷-19，22-二环[2，2，0]-己烷，俗名为青龙衣三萜酮A。

化学结构式为：

本发明还提供了青龙衣三萜酮A的制备方法：以核桃青皮为原料，依次醇提取、大孔树脂富集、吉拉德试剂纯化处理以及柱色谱分离等制备得到。

上述柱层析依次包括大孔树脂柱、正相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱。

本发明青龙衣三萜酮A具体制备步骤如下：

（1）醇提：将核桃楸Juglans mandshurica Maxim青果皮鲜品低温40℃烘干，得到5kg的干燥品为原料，采用95%乙醇30L回流提取3次，每次2h，过滤并合并乙醇提取液，减压回收溶剂，干燥，得乙醇浸膏；

（2）富集纯化：将步骤（1）所得浸膏提取物用水分散至相对密度为1.18±0.05g/mL的溶液，经AB-8或D101型大孔树脂柱色谱富集纯化，分别以水、50%乙醇、80%乙醇依次洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调至密度为1.05g/mL的水溶液。水液反复5次穿过活性炭层（层高10cm，直径30cm）进行减压抽滤除杂，再将水液浓缩蒸干后，分别加入无水乙醇、吉拉德试剂P及12%（V/V）醋酸进行捏溶，再水浴50℃温热10h，反应结束后加水稀释，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏；

（3）正相硅胶柱色谱：取步骤（2）所得乙醚浸膏进行正相硅胶柱色谱分离，依次采用体积比为50:1、25:1、15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每一个比例洗脱3个柱体积，其中体积配比为15:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂得到分离产物；

（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经步骤（3）分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱，以甲醇：水=1:2（V/V）洗脱3个柱体积弃去，再用甲醇：水=1:1（V/V）洗脱4个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液，收集后面三个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品；

（5）重结晶处理：将步骤（4）所得粗品采用甲醇重结晶两次，即可得到该化合物纯品。

本发明还提供了青龙衣三萜酮A在制备抗肿瘤药物方面的应用。在体外细胞毒实验中能够抑制人胃癌细胞BGC-823、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549的增殖，具有细胞毒作用，可以作为制备预防和治疗人胃癌、肝癌和肺癌药物的应用。

本发明的有益效果和意义在于：通过结合吉拉德试剂预处理技术，能够高效率的纯化和富集青龙衣药材中的羰基物质，克服了传统溶剂提取过程中其他类型的杂质对该类成分干扰大，造成其收率低的应用局限；且本发明寻找到具有特殊结构骨架特征的三萜类化合物，也为进一步抗肿瘤临床研究提供了重要的药效物质来源。

附图说明

图1为本发明化合物的化学结构式；

图2为本发明化合物的正性HR-ESI-MS谱图；

图3为本发明化合物的¹H-NMR谱图；

图4为本发明化合物的¹³C-NMR谱图；

图5为本发明化合物的DEPT谱图；

图6为本发明化合物的HSQC谱图；

图7为本发明化合物的HMBC谱图；

图8为本发明化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图9为本发明化合物的HMBC谱和¹H-¹H COSY谱主要相关关系图；

图10为本发明化合物与顺铂对三种不同类型癌细胞IC₅₀值比较。

具体实施方式

根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员很清楚本发明的其他实施方案，下述实施方案仅作示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种调整和改进。这些变化应在本发明的保护范围内。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施案例一本发明化合物的制备方法：

（1）醇提：将核桃楸Juglans mandshurica Maxim青果皮鲜品低温40℃烘干，得到5kg的干燥品为原料，采用95%乙醇30L回流提取3次，每次2h，过滤并合并乙醇提取液，减压回收溶剂，干燥，得乙醇浸膏328g；

（2）富集纯化：将步骤（1）所得浸膏提取物用水分散至相对密度为1.18±0.05g/mL的溶液，经AB-8或D101型大孔树脂柱色谱富集纯化（色谱柱规格为内径×长度=6.5cm×1.5m，树脂有效高度为1.0 m），分别以水、50%乙醇、80%乙醇依次洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，调至密度为1.05g/mL的水溶液，水液反复5次穿过活性炭层（层高10cm，直径30cm）进行减压抽滤除杂，再将水液浓缩蒸干后，分别加入无水乙醇、吉拉德试剂P及12%（V/V）醋酸进行捏溶，再水浴50℃温热10h，反应结束后加水稀释，加入同体积乙醚萃取三次，得到乙醚浸膏25.8 g；

（3）正相硅胶柱色谱：取步骤（2）所得乙醚浸膏进行正相硅胶柱色谱分离（色谱柱规格为内径×长度=3.0cm×1.5m，硅胶有效高度1.0m），依次采用二氯甲烷-甲醇（50:1，V/V，3柱体积）→二氯甲烷-甲醇（25:1，V/V，3柱体积）→二氯甲烷-甲醇（15:1，V/V，3柱体积）进行系统梯度洗脱，将其中二氯甲烷-甲醇体积配比为15:1的混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂至干，称重，得到分离产物1.26g；

（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经步骤（3）硅胶分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱（色谱柱规格为内径×长度=1.5cm×1.8m，凝胶有效高度为1.2 m），以甲醇：水=1:2（V/V）洗脱3个柱体积弃去，再用甲醇：水=1:1（V/V）洗脱4个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液，收集后面三个柱体积洗脱液，回收溶剂至干，得粗品0.06g；

（5）重结晶处理：将步骤（4）所得粗品采用30mL甲醇重结晶两次，即可得到该化合物纯品35.5mg。

实施案例二本发明化合物的结构鉴定：

本发明化合物为白色无定形粉末(MeOH)。正性HR-ESI-MS谱中，如图2所示，在m/z494.3498处可见[M]⁺离子峰，表明该化合物的分子量为494。结合¹H-NMR、¹³C-NMR及DEPT谱等推测其分子式为C₃₃H₅₀O₃，计算其不饱和度为9。

在该化合物的¹H-NMR (Methanol-d₄, 400MHz)谱，如图1所示，显示8个甲基质子分别为δ_H0.92 (H-26)、0.96 (H-26)、1.04 (H-30)、1.05 (H-27)、1.07 (H-29)、1.12 (H-24)、1.15 (H-28)和1.15 (H-23)，一个与氧相连的次甲基质子信号在δ_H3.67 (H-3)。¹³C-NMR (Methanol-d₄, 100MHz)谱结合DEPT谱中，如图4、图5所示，显示有33个碳信号，包括8个甲基、10个亚甲基、5个次甲基、10个季碳（其中包含2个含氧季碳和1个羰基）。

在该化合物的HMBC谱中，如图7所示，可明显观察到3位，24位和25位构成了³J的远程相关，说明羟基在5位上，且C-5和C-4，C-6，C-10与从Kleinia odora 分离出来的化合物klodorol A的波谱数据基本一致(Tori M, Matsuda R, Sono M, Asakawa Y. 1988. ¹³C NMR assignment of dammarane triterpenes and dendropanoxide:application of 2D long-range ¹³C–^lH correlation spectra. Magn Reson Chem. 26:581–590. Estrada S, Acevedo L, Rodriguez M, Toscano R, Mata R. 2002. New triterpenoids from the orchids Scaphyglottis livida and Nidema boothii. Nat Prod Res. 16:81–86.)，说明该羟基为α构型。本发明中的化合物与已知化合物klodorol A仅部分化学结构相似，二者E，F环存在较明显的差异性。在HMBC谱中，可观察到与H-18，H-29，H-30存在相关关系的C-19，以及与H-21，H-28，H-32，H-33相关的C-22的类型发生了改变，分别由原来的仲碳转变为叔碳和季碳，由此推测C-19与C-22之间存在C-C单键。同时在¹H-¹H COSY谱中，如图8所示，可观察到33位δ_H1.94与32位δ_H2.48相关，说明32，33位存在乙基片段，且有羰基δ_C220.1和上述片段存在远程相关，推测该化合物存在-CH₂-CH₂-C=O结构，并与21，22位形成五元的F环，具体相关见图9。综上，本发明化合物的化学结构确定为α-环戊酮-21，22-骈合3，10-环氧-5-羟基-齐墩果烷-19，22-二环[2，2，0]-己烷，即青龙衣三萜酮A，化学结构式如图1所示。

表1 本发明化合物NMR信号归属

效果实施例——体外抑制肿瘤细胞增殖作用

（1）材料和方法

1）细胞系和试剂 人胃癌细胞株BGC-823、人肝癌细胞株HepG-2、人肺癌细胞株A549细胞株，上述瘤株购自赛尔试剂公司。将上述这些肿瘤细胞置于含10% L-谷氨酰胺的胎牛血清的RPMI 1640培养液中（另含有100μg/mL盘尼西林，100μg/mL链霉素），于37℃、5%饱和湿度的CO₂培养箱中培养。本发明化合物来自于实施案例一制备而获得的。

2）细胞增殖分析 取对数生长期的BGC-823、HepG-2、A549细胞，根据细胞株的不同按一定密度接种于96孔板中，每孔为100μL的细胞悬液，接种细胞后立即加入不同浓度药物（样品溶解于DMSO中，用培养基逐步稀释，加入细胞中药液的DMSO终浓度低于1%），使细胞液终浓度达到5、10、20、40、80、160μM，空白对照组为100μL的RPMI1640加10μL无药溶剂作为对照组，每组设3个复孔；孵育48 h后，每孔加入5mg/mL 的MTT 20μL，37℃继续培养4 h后离心（2000 rpm，10 min），小心吸去上清液，每孔加入150μL DMSO混匀，各组均在570nm波长处测定每孔的OD值，以只加DMSO孔为调零孔，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率%=[1-(药物处理孔平均OD值-调零孔OD值)/（细胞对照孔平均OD值-调零孔OD值）]×100%。使用Logit法计算药物的IC₅₀值。

（2）结果

经线性回归计算IC₅₀值显示该化合物对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌细胞HepG-2和人肺癌细胞A549细胞作用IC₅₀值分别为52.96±4.22μM、32.15±3.19μM和22.95±2.19μM，顺铂作为阳性对照药对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌细胞HepG-2和人肺癌细胞A549细胞作用IC₅₀值分别为6.23±1.08μM、4.88±0.59μM和5.12±2.02μM，见图10。

结果表明本发明化合物对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549细胞的生长均有较强的抑制作用，具有制备临床肿瘤预防和治疗药物的前景。

青龙衣中一种三萜类化合物及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。