一株尾孢菌素生产菌及其应用

IPC分类号 : C12N1/14,C12P15/00,C12R1/645

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CN201810953172.9

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专利摘要

本发明公开了一株尾孢菌素生产菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明从中国浙江省丽水紫杉林的树皮中分离得到了一株尾孢菌素生产菌：尾孢菌属JNU001(Cercosporasp.JNU001)，此菌株能够生产尾孢菌素，且在一定的发酵方法下，产量可高达到190mg/L。

权利要求

1.一株尾孢菌素生产菌，其特征在于，所述尾孢菌素生产菌为尾孢菌属(Cercosporasp.)JNU001；所述尾孢菌属(Cercospora sp.)JNU001已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017842，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

2.一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述的尾孢菌属(Cercospora sp.)JNU001。

3.如权利要求2所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的尾孢菌属(Cercospora sp.)JNU001接种于发酵培养基，在温度为20～35℃、转速为80～200r/min的条件下进行培养5～20d。

4.如权利要求3所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，发酵培养基的成分包含1-15g/L的葡萄糖、0.1-3g/L的果糖、0.1-20g/L的蔗糖、1g/L的乙酸钠、0.1-10g/L的大豆蛋白胨、0.1-8mg/L的苯基丙氨酸、50-100mg/L的苯甲酸钠、0.1-5mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、0.1-5mg/L的生物素、0.1-10mg/L的Ca(NO3)2、0.1-5mg/L的吡哆醛、0.1-5mg/L的泛酸钙、0.1-5mg/L的维生素B1、0.1-10mg/L的MnCl2、0.1-6mg/L的FeCl2、0.1-5g/L的Cu(NO3)2、0.1-10mg/L的MgSO4以及0.1-10mg/L的ZnSO4。

5.如权利要求3或4所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含1g/L的葡萄糖、3g/L的果糖、6g/L的蔗糖、1g/L的乙酸钠、1g/L的大豆蛋白胨、5mg/L的苯基丙氨酸、100mg/L的苯甲酸钠、1mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、1mg/L的生物素、6.5mg/L的Ca(NO3)2、1mg/L的吡哆醛、1mg/L的泛酸钙、1mg/L的维生素B1、5mg/L的MnCl2、2mg/L的FeCl2、1g/L的Cu(NO3)2、3.6mg/L的MgSO4以及2.5mg/L的ZnSO4。

6.如权利要求3或4所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为6.5～9.5。

7.如权利要求5所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为6.5～9.5。

8.如权利要求3或4或7所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的温度为25℃。

9.如权利要求5所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的温度为25℃。

10.如权利要求6所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的温度为25℃。

11.如权利要求3或4或7或9或10所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的转速为150r/min。

12.如权利要求5所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的转速为150r/min。

13.如权利要求6所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的转速为150r/min。

14.如权利要求8所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的转速为150r/min。

15.如权利要求3或4或7或9或10或12或13或14所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的时间为11d。

16.如权利要求5所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的时间为11d。

17.如权利要求6所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的时间为11d。

18.如权利要求8所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的时间为11d。

19.如权利要求11所述的一种生产尾孢菌素的方法，其特征在于，所述培养的时间为11d。

20.权利要求1所述的一株尾孢菌素生产菌或权利要求2-19任一所述的一种生产尾孢菌素的方法在生产尾孢菌素方面的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一株尾孢菌素生产菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

尾孢菌素是一种天然存在的苝醌类色素，是从子囊菌纲和半知菌类某些真菌，如C.asparagi、C.beticola、C.nicotianae、C.zeae-maydis、C.kikuchii和C.piaropi中分离提取得到的，具有光敏活性。

尾孢菌素在光照下会吸收光能，从而获得电子激的三重态：单线态氧(1O2)和超氧自由基(O2.-)，获得了三重态的尾孢菌素可以杀死某些真菌和癌变的细胞，因此，它可以作为一类新型的光疗药物，在治疗某些由真菌引起的顽固性皮肤病以及癌症等方面有着广阔的应用前景。

目前，主要的产尾孢菌素的菌为甜菜尾孢菌、玉米尾孢菌和烟草尾孢菌，但这些菌在生产尾孢菌素时，均具有很明显的缺陷，如《Isolation,Characterization,andProduction of Red Pigment from Cercospora piaropi a Biocontrol Agent forWaterhyacinth》文献中提到的C.piaropi菌株，产量十分低下、并且发酵周期长。

因此，急需找到一株在生产尾孢菌素时，具有产量高，培养周期短优势的菌。

发明内容

未解决上述问题，本发明从中国浙江省丽水紫杉林的树皮中分离得到了一株尾孢菌素生产菌：尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)，此菌株能够生产尾孢菌素，且在一定的发酵方法下，产量可高达到160mg/L。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一株尾孢菌素生产菌，所述尾孢菌素生产菌为尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)；所述尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017842，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

所述尾孢菌素生产菌JNU001(Cercospora sp.JNU001)是从中国浙江省丽水紫杉林的树皮中分离得到的，该菌株经测序分析，其18S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，得到比对结果后，将与菌株相似度高的菌株序列挑选10个左右进行进化树的构建，使用MEGA7.0软件进行构建，运用最小邻近法构建系统发育树，鉴定结果为尾孢菌属。

其菌落特征为：分生孢子明显聚集，分枝较疏；孢子疤痕明显，分生孢子呈孤立状，呈棒状。

其生长特性为：在PDB平板上生长缓慢，从生长第四天开始，菌落开始分泌红色色素，且色素量逐渐增加，生长第10天开始，菌体表面长出白色的菌毛。

本发明提供了一种生产尾孢菌素的方法，所述方法为使用权利要求1所述的尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将权利要求1所述的尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)接种于发酵培养基，在温度为20～35℃、转速为80～200r/min的条件下进行培养5～20d。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的成分包含1-15g/L的葡萄糖、0.1-3g/L的果糖、0.1-20g/L的蔗糖、1g/L的乙酸钠、0.1-10g/L的大豆蛋白胨、0.1-8mg/L的苯基丙氨酸、50-100mg/L的苯甲酸钠、0.1-5mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、0.1-5mg/L的生物素、0.1-10mg/L的Ca(NO3)2、0.1-5mg/L的吡哆醛、0.1-5mg/L的泛酸钙、0.1-5mg/L的维生素B1、0.1-10mg/L的MnCl2、0.1-6mg/L的FeCl2、0.1-5g/L的Cu(NO3)2、0.1-10mg/L的MgSO4以及0.1-10mg/L的ZnSO4。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含1g/L的葡萄糖、3g/L的果糖、6g/L的蔗糖、1g/L的乙酸钠、1g/L的大豆蛋白胨、5mg/L的苯基丙氨酸、100mg/L的苯甲酸钠、1mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、1mg/L的生物素、6.5mg/L的Ca(NO3)2、1mg/L的吡哆醛、1mg/L的泛酸钙、1mg/L的维生素B1、5mg/L的MnCl2、2mg/L的FeCl2、1g/L的Cu(NO3)2、3.6mg/L的MgSO4以及2.5mg/L的ZnSO4。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含10g/L的葡萄糖、1g/L的乙酸钠、1g/L的大豆蛋白胨、5mg/L的苯基丙氨酸、100mg/L的苯甲酸钠、1mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、1mg/L的生物素、6.5mg/L的Ca(NO3)2、1mg/L的吡哆醛、1mg/L的泛酸钙、1mg/L的维生素B1、5mg/L的MnCl2、2mg/L的FeCl2、1g/L的Cu(NO3)2、3.6mg/L的MgSO4以及2.5mg/L的ZnSO4。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中，磷酸二氢钾缓冲液的浓度为1mol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中，磷酸二氢钾缓冲液的pH为6～7。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中，磷酸二氢钾缓冲液的pH为6.8。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为6.5～9.5。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为8.5～9。

在本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为25℃。

在本发明的一种实施方式中，所述培养的转速为150r/min。

在本发明的一种实施方式中，所述培养为振荡培养。

在本发明的一种实施方式中，所述培养的时间为11d。

本发明提供了上述一株尾孢菌素生产菌或上述一种生产尾孢菌素的方法在生产尾孢菌素方面的应用。

有益效果：

(1)本发明提供了一种尾孢菌素生产菌，可生产尾孢菌素且产量可高达190mg/L；

(2)本发明菌株在生产尾孢菌素时具有培养周期短的优势。

生物材料保藏

一株尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)，分类学命名为尾孢菌属JNU001(Cercospora sp.JNU001)，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017842，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1为本发明菌株生长10天左右的平板正面图；

图2为本发明菌株生长10天左右的平板反面图；

图3为本发明菌株产生的红色素正常状态下以及在碱性和酸性条件下的理化性质；

图4为1200倍下本发明菌株显微下的形态特征；

图5为2400倍下本发明菌株显微下的形态特征；

图6为5000倍下本发明菌株显微下的形态特征；

图7为本发明构建的构建系统发育树；

图8为本发明菌株产生的红色素的氢谱分析结果；

图9为尾孢菌素纯度标准曲线；

图10为pH对尾孢菌素产量的影响；

图11为时间对尾孢菌素产量的影响；

图12为碳源对尾孢菌素产量的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下：

PDA培养基：10g/L葡萄糖、20g土豆、15-20g琼脂；

PDB培养基：10g/L葡萄糖、20g土豆；

S-7培养基：1g/L的葡萄糖、3g/L的果糖、6g/L的蔗糖、1g/L的乙酸钠、1g/L的大豆蛋白胨、5mg/L的苯基丙氨酸、100mg/L的苯甲酸钠、1mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、1mg/L的生物素、6.5mg/L的Ca(NO3)2、1mg/L的吡哆醛、1mg/L的泛酸钙、1mg/L的维生素B1、5mg/L的MnCl2、2mg/L的FeCl2、1g/L的Cu(NO3)2、3.6mg/L的MgSO4以及2.5mg/L的ZnSO4。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

1、尾孢菌素的萃取

当菌体培养到一定时间后，收集发酵液中的菌体，首先将菌丝体与发酵液混合用布氏漏斗分离，在分离过程中，盖上锡箔纸，抽滤30min，收获的菌丝体在磁力搅拌器用二氯甲烷萃取1小时，重复三次，过滤提取物，然后在36℃下减压蒸发二氯甲烷溶剂；将干燥的残余物溶于4ml甲醇(HPLC纯度等级)中，在HPLC之前通过0.22μL滤器过滤甲醇提取物。

2、尾孢菌素的纯化

获得粗尾孢菌素后，用葡聚糖凝胶柱纯化，纯化之前，用0.22滤膜过滤粗样，用甲醇溶解，上样，甲醇作为流动相，进行纯化，纯化收集的样品进行高效液相检测纯度，其中，粗样的液相峰面积一般为70％左右，当经过葡聚糖凝胶柱纯化后，达到95％。

3、尾孢菌素的鉴定

将纯化后得到高纯度样品进行LC-MS分析和H NMR分析，经过质谱分析得到该物质的分子量为534，然后再结合氢谱分析，分析各个键位的化学位移，判定此红色素为尾孢菌素。

4、标准曲线的制作

纯化的样品挑选纯度最高的制作标准曲线，将样品稀释六个梯度，分别是0.02mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L，用MEOH作为溶剂，置于96孔板中，200μ的体积，在472nm下进行测量吸光度，重复三遍，得到标准曲线(如图9)。

5、含量的测定

对发酵液以及菌体用一定体积的二氯甲烷进行萃取，萃取重复多次，直到色素萃取完全，用量筒衡量二氯甲烷的体积为Xml，从中吸取Yml，将取得的萃取物Yml进行真空旋干，然后用200μL的甲醇溶解，取200μL甲醇作为空白对照，置于96孔板，在472nm下测量其吸光值，重复三次，减去空白对照，取平均值，将得到的吸光值代入标准曲线，计算得到产量。

实施例1：本发明菌株的筛选及鉴定

筛选：

本发明的菌株JNU001是从红豆杉树皮(2×2cm)分离的40种内生真菌中的一株，这些内生真菌是从中国浙江省丽水市的南方红豆杉采集得到的，将采集的树皮放入密封的无菌塑料袋中，存放在低温医用储存箱中，运至实验室，4℃冰箱内保存。

在分离内生真菌之前，在流动的自来水下彻底洗涤树皮采集得到的碎片，然后用无菌蒸馏水洗涤；然后通过浸入70％乙醇水溶液中浸泡3分钟以此来将树皮表面的微生物杀死达到灭菌的效果，然后将树皮在无菌蒸馏水中漂洗4-5次，然后切成片(1×1cm)的碎片；使用火焰消毒的锋利刀片，去除已经用酒精灭过菌的树皮的表层皮。将树皮切成大小1×1cm的树皮，然后小心地铺在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的表面上，所述培养基由剥皮和切割马铃薯200g/L，葡萄糖10g/L和琼脂15g/L组成；然后，在PDA培养基中加入50mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素以消除任何细菌的生长；将培养皿在25℃下培养14-20天，并定期检查内生真菌菌落的生长状况；通过从PDA平板挑取单个真菌菌丝尖端并置于新鲜的PDA培养基上并在25℃孵育10天获得纯分离菌体；仔细检查每个真菌培养物的纯度，并通过菌丝尖端法转移到另一个PDA平板；

观察本发明菌株在PDA平板培养基上的菌落特征，如图1-2，图1显示的是菌落的平板正面照，可以看出菌落的周围有一圈白的菌毛，且有红色的物质分泌，由边缘向中间集聚出现白色的菌块；图2是由菌落分泌的色素。

将分离得到的菌丝通过S-7培养基培养在25℃，光照条件下，150r/min条件培养两周左右得到培养液，图3所展示的是菌株分泌的红色素的理化性质，左边是色素溶解在甲醇的状态，中间为色素溶解在碱性甲醇中所显示的，可以看出在碱性条件下，色素由红色变为绿色，右边是色素在酸性条件下的状态。

图4-6是将生长7天左右的菌落送至江南大学生物工程学院电镜室做的菌落电镜图分别在1200、2400和5000倍数下的菌落菌落状态。

鉴定：

配制一定量的S-7培养基，分装到三角摇瓶中各100ml，pH值自然条件，然后将生长7天左右的菌株用打孔器，每100ml的培养基加入相同数量的菌片2-3片，菌片直径约为1.5cm培养一周左右，将发酵液进行抽滤的到菌体用于DNA的提，将收集得到的菌块接种于500ml锥形瓶中，加入200ml的S-7培养基，将所有培养物在25℃150转速下培养10天，在20000g/min转速下李离心收获菌丝体，使用无菌研钵将菌丝体在液氮中研磨成细粉末，基因组DNA通过试剂盒提取；

用NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NS4(5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3')PCR扩增菌体18s rDNA的保守序列；

PCR条件如下：

组分体积(μ)Prime star max25FW1.5RW1.5模板12O]]>21

PCR反应程序如下：

PCR结果由上海天霖生物公司进行测序。

测序结果如SEQ ID NO.1所示。

将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，得到比对结果后，将与JNU001相似度高的菌株序列挑选10个左右进行进化树的构建，使用MEGA7.0软件进行构建，运用最小邻近法构建系统发育树，构建结果如图7。

鉴定属于尾孢菌。

实施例2：本发明菌株的发酵培养

将保存于-80℃的尾孢菌属JNU001菌株接种接到PDA(pH自然)平板上，在25℃条件下培养7d后，用直径1.5cm的打孔器打孔，重复三次打孔操作，得到发酵菌片；

分别配制100mL的PDB培养基、S-7培养基(两者培养基的pH均不做调整)；

将发酵菌片分别接种至PDB培养基以及S-7培养基，并于25℃，150r/min，光照条件下发酵培养14d，得到发酵液。

将得到的发酵液中的红色素进行萃取、纯化、鉴定以及产量检测。

鉴定结果为：经过质谱分析得到该物质的分子量534，然后再结合氢谱图分析(氢谱分析结果如图8)，分析各个键位的化学位移，与网上已经公布分核磁H谱进行分析可以判定发酵液中的物质确实为尾孢菌素。

产量检测结果为：产量检测结果为：PDB培养基培养得到的发酵液中的尾孢菌素产量为15mg/L、相同条件下S-7培养基培养得到的发酵液中的尾孢菌素产量为38mg/L。

实施例3：本发明菌株的发酵培养

将保存于-80℃的尾孢菌属JNU001菌株接种接到PDA(pH自然)平板上，在25℃条件下培养7d后，用直径1.5cm的打孔器打孔，重复三次打孔操作，得到发酵菌片；

分别配制100mL的pH值分别为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0的S-7培养基；

将发酵菌片接种至不同pH的S-7培养基中，并于25℃，150r/min，光照条件下发酵培养14d，得到发酵液。

将得到的发酵液进行产量检测，检测结果如图10。

如图10，当培养的pH值在7.5以上时产量明显增高，且8.5左右达到最高，为160mg/L，pH偏酸性时产量很低，因此，选用pH为8.5的S-7培养基作为发酵培养基。

实施例4：本发明菌株的发酵培养

将保存于-80℃的尾孢菌属JNU001菌株接种接到PDA(pH自然)平板上，在25℃条件下培养7d后，用直径1.5cm的打孔器打孔，重复三次打孔操作，得到发酵菌片；

配制一定量的pH为8.5的S-7培养基；

将发酵菌片接种至S-7培养基中，于25℃的发酵培养温度，150r/min的转速，光照条件下进行发酵培养15d，得到发酵液。

从第三天开始，每天取样5ml发酵液，检测发酵液中的尾孢菌素产量，检测结果如图11。

由图11可知，在生长第11d时尾孢菌素产量达到最高，为160mg/L，从第11天后发现，分泌量开始减少，说明菌体开始停止分泌产物，因此，选用11d作为发酵时间。

实施例5：本发明菌株的发酵培养

将保存于-80℃的尾孢菌属JNU001菌株接种接到PDA(pH自然)平板上，在25℃条件下培养7d后，用直径1.5cm的打孔器打孔，重复三次打孔操作，得到发酵菌片；

配制一定量的pH为8.5的S-7培养基；

将发酵菌片接种至S-7培养基中，分别于20、23、25、28、30、33、35℃的发酵培养温度，150r/min的转速，光照条件下发酵培养11天，处理发酵液。

将得到的发酵液进行产量检测。

产量检测结果为：20℃条件下菌株生长缓慢，尾孢菌素产量基本为0；23℃时尾孢菌素产量为80mg/L；25℃时尾孢菌素产量达到最大，为160mg/L；在28℃、30℃、33℃和35℃尾孢菌素产量基本为0，且菌体呈现墨绿色球状，因此，25℃为最优发酵温度。

实施例6：本发明菌株的发酵培养

首先将保存于-80℃的菌株接种接到PDA(pH自然)平板上，在25℃条件下培养，培养大概七天左右作为发酵培养的菌体。在确定了最适温度25℃、最适培养基S-7、最适发酵周期11天以及最适pH值之后，针对培养基中的碳源做进一步的优化。在初始培养基S-7中，碳源为葡萄糖、果糖和蔗糖。现在添加麦芽糖和半乳糖。将这五种碳源物质分别加入到培养基中，培养基的pH都为8.5，在25℃、150r/min、S-7培养基200ml光照条件下培养，培养11天，处理发酵液。

将得到的发酵液进行产量检测，检测结果如图12。

如图12所示，将所有碳源用葡萄糖取代时色素分泌量最高，且葡萄糖价格低廉，大大降低了培养成本。

为了得到更直观的数据体现，将菌株接至1L的S-7培养液中发酵培养，其中所有碳源按照全部换位葡萄糖进行配置培养基，在光照的条件下，25℃，pH值8.5左右，150r/min的条件下培养11天，进行处理，最终产量为190mg/L。

此时，培养基配方为10g/L的葡萄糖、1g/L的乙酸钠、1g/L的大豆蛋白胨、5mg/L的苯基丙氨酸、100mg/L的苯甲酸钠、1mL/L的磷酸二氢钾缓冲液、1mg/L的生物素、6.5mg/L的Ca(NO3)2、1mg/L的吡哆醛、1mg/L的泛酸钙、1mg/L的维生素B1、5mg/L的MnCl2、2mg/L的FeCl2、1g/L的Cu(NO3)2、3.6mg/L的MgSO4以及2.5mg/L的ZnSO4。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株尾孢菌素生产菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcaactata cggtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt atttgatagt 60