专利摘要
本发明公开了一种萝卜硫素的提取方法及黑芥子酶磁性微球，该方法包含：(1)西兰花种子加热翻炒，榨油除去油脂，得到油枯饼；(2)将油枯饼粉碎成小颗粒，于水中浸泡提取，得到萝卜硫苷提取液；(3)向萝卜硫苷提取液中加入黑芥子酶磁性微球，酶解，用磁铁吸附回收黑芥子酶磁性微球，得到萝卜硫素提取液；(4)采用二氯甲烷萃取萝卜硫素，得到含有萝卜硫素的二氯甲烷萃取液，浓缩；(5)将浓缩液用乙腈溶解，倾倒出上清液，浓缩，再得到浓缩液；(6)将步骤(5)得到的浓缩液用食用乙醇溶解，倾倒出上清液，浓缩，得到萝卜硫素。本发明的方法通过固化的黑芥子酶磁性微球为催化剂，将萝卜硫苷水解成萝卜硫素，萝卜硫素纯度高达95％。
权利要求
1.一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于，该方法包含：
(1)称取西兰花种子，加热翻炒，将炒制的西兰花种子榨油除去油脂，得到油枯饼；
(2)将油枯饼粉碎成小颗粒，于水中浸泡，搅拌，倾倒出上清液，该操作进行一次以上，合并上清液，得到萝卜硫苷提取液；
(3)向萝卜硫苷提取液中加入黑芥子酶磁性微球，其中，黑芥子酶磁性微球的加入量为西兰花种子的重量的千分之五，搅拌进行酶解，用磁铁吸附回收黑芥子酶磁性微球，得到萝卜硫素提取液；
(4)采用3～6倍西兰花种子重量的二氯甲烷萃取萝卜硫素提取液，得到含有萝卜硫素的二氯甲烷萃取液，浓缩，得到浓缩液；
(5)将浓缩液用其自身重量5～10倍的乙腈溶解，倾倒出上清液，浓缩，再得到浓缩液；
(6)将步骤(5)得到的浓缩液用其自身重量3～5倍的食用乙醇溶解，倾倒出上清液，浓缩，得到萝卜硫素；
所述黑芥子酶磁性微球的制备方法如下：
S1.将氯化铁、醋酸钠和聚醚酰亚胺于乙二醇中，超声，然后在150～250℃下反应，待反应结束后，磁场分离，获得四氧化三铁磁性微球；氯化铁选用FeCl
S2.将西兰花种子于液氮中研磨成粉，加入Tris-HCl缓冲液，搅拌，过滤，滤液于0～4℃条件下离心，收集上清液，该上清液为黑芥子酶的粗提液，向黑芥子酶的粗提液中加入乙醇，搅拌，在4℃条件下离心，收集上清液，4℃条件下透析，经过透析后的液体为西兰花种子中的黑芥子酶液；
S3.将所述四氧化三铁磁性微球于戊二醛溶液中，超声，30～50℃反应，磁铁分离，然后加入所述黑芥子酶液进行固化，后处理，进行磁场分离，洗掉未结合的酶液，冷冻干燥，获得所述的黑芥子酶磁性微球。
2.根据权利要求1所述的萝卜硫素的提取方法，其特征在于，在步骤S2中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH值为7.5；所述西兰花种子的质量和Tris-HCl缓冲液的体积之比为2g：5mL；所述离心转速 为12000r/min。
3.根据权利要求1所述的萝卜硫素的提取方法，其特征在于，在步骤S3中，所述四氧化三铁磁性微球的质量与戊二醛溶液和黑芥子酶液的体积之比为1g：250mL：250mL；所述戊二醛溶液的质量体积分数为0.5％；所述固化在25℃条件下固化20h。
4.根据权利要求1所述的萝卜硫素的提取方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述加热温度为100～140℃。
5.根据权利要求1所述的萝卜硫素的提取方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述油枯饼被粉碎成10～50目的小颗粒。
说明书
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种萝卜硫素的提取方法及黑芥子酶磁性微球。
背景技术
西兰花是一种广受欢迎的蔬菜，其种子含有萝卜硫苷，萝卜硫苷在西兰花种子自身含有的黑芥子酶的作用下，降解为萝卜硫素，萝卜硫素是迄今为止蔬菜中发现的抗癌效果最好的活性物质，具有多种生理活性。日本营养学家福家洋子教授等通过试验验证萝卜硫素有治疗癌症的作用；英国科学家发现萝卜硫素将有助于人们对癌细胞的抵抗能力，降低患癌症的危险；美国约翰霍普金斯大学医学院的Brassica Chemooprotection实验室发现萝卜硫素可激活人体自身的抗癌物质；日本金泽大学的大田嗣人发现萝卜硫素具有抑制肥胖的作用；日本千叶大学社会精神保健教育中心于2016年8月宣布萝卜硫素具有预防抑郁症和抑郁症复发的功效；瑞典哥德堡大学研究成果发表在2017年6月的国际顶级刊物《Science Translational Medicine》上：发现萝卜硫素具有降血糖的功效。
2015年3月我国国家食品药品监督管理总局受理了美国Brassica公司的“西兰花种子提取物”为新食品原料(卫食新进申字(2015)第0002号)的申请，并于2017年6月8日正式批准“西兰花种子提取物”为新食品原料。
目前，国内外对萝卜硫素的提取工艺主要采用西兰花种子粉末中加大量水，利用其自身的黑芥子酶的作用将萝卜硫苷水解为萝卜硫素，再经过多次萃取、分离得到纯的萝卜硫素，此方法存在收率低、成本高等问题，一般每公斤西兰花种子得到0.5～1克左右的萝卜硫素，即产率为0.05％～0.1％，溶剂消耗量为西兰花种子重量的20倍左右，且种子在存放过程中有效成分会逐渐大幅降低。
而且，现有的方法得到的萝卜硫素的纯度较低，如中国专利CN108048498A，公开了一种萝卜硫素提取工艺，该工艺提取的萝卜硫素含量在20.8％，经过硅胶柱层析后萝卜硫素含量为30.1％。如中国专利CN102898341A，公开了一种高纯度萝卜硫素的提取纯化方法，该方法获得的萝卜硫素纯度为60％。如中国专利CN101544995A，公开了一种萝卜硫素的提取方法，该方法提取的萝卜硫素纯度为2.91％，经过硅胶柱层析后纯度为24.30％，经过反相硅胶柱层后纯度为95.10％，但是产率极低，1.0kg西兰花干燥种子才能得到937.5mg纯度为95.10％的萝卜硫素，即产率为0.094％。
发明内容
本发明的目的是提供一种萝卜硫素的提取方法及黑芥子酶磁性微球，该方法解决了现有方法收率低的问题，能够得到高纯度的萝卜硫素。
为了达到上述目的，本发明提供了一种黑芥子酶磁性微球的制备方法，该方法包含：
(1)将氯化铁、醋酸钠和聚醚酰亚胺于乙二醇中，超声，然后在150～250℃下反应，待反应结束后，磁场分离(外加磁铁吸附)，获得四氧化三铁磁性微球；
(2)将西兰花种子于液氮中研磨成粉，加入Tris-HCl缓冲液，搅拌，过滤，滤液于0～4℃条件下离心，收集上清液，该上清液为黑芥子酶的粗提液，向黑芥子酶的粗提液中加入乙醇，搅拌，在4℃条件下离心，收集上清液，4℃条件下透析，经过透析后的液体为西兰花种子中的黑芥子酶液；
(3)将所述四氧化三铁磁性微球于戊二醛溶液中，超声，30～50℃反应，磁铁分离，然后加入所述黑芥子酶液进行固化，后处理，进行磁场分离(外加磁铁吸附)，洗掉未结合的酶液，冷冻干燥，获得所述的黑芥子酶磁性微球。
优选地，在步骤(1)中，所述氯化铁选用FeCl3·6H2O，该FeCl3·6H2O与醋酸钠和聚醚酰亚胺的质量比为2：6：5。
优选地，在步骤(2)中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH值为7.5；所述西兰花种子的质量和Tris-HCl缓冲液的体积之比为2g：5mL；所述离心转度为12000r/min。
优选地，在步骤(3)中，所述四氧化三铁磁性微球的质量与戊二醛溶液和黑芥子酶液的体积之比为1g：250mL：250mL；所述戊二醛溶液的质量体积分数为0.5％；所述固化在25℃条件下固化20h。
本发明还提供了一种黑芥子酶磁性微球，在四氧化三铁磁性微球上负载黑芥子酶。
优选地，该磁性微球通过所述的制备方法获得。
本发明还提供了一种所述的黑芥子酶磁性微球的用途，该黑芥子酶磁性微球用于作为水解萝卜硫苷的催化剂。
本发明还提供了一种萝卜硫素的提取方法，该方法包含：
(1)称取西兰花种子，加热翻炒，将炒制的西兰花种子榨油除去油脂，得到油枯饼；
(2)将油枯饼粉碎成小颗粒，于水中浸泡，搅拌，倾倒出上清液，该操作进行一次以上，合并上清液，得到萝卜硫苷提取液；
(3)向萝卜硫苷提取液中加入如权利要求5或6所述的黑芥子酶磁性微球，其中，黑芥子酶磁性微球的加入量为西兰花种子的重量的千分之五，搅拌进行酶解，用磁铁吸附回收黑芥子酶磁性微球，得到萝卜硫素提取液；
(4)采用3～6倍西兰花种子重量的二氯甲烷萃取萝卜硫素提取液，得到含有萝卜硫素的二氯甲烷萃取液，浓缩，得到浓缩液；
(5)将浓缩液用其自身重量5～10倍的乙腈溶解，倾倒出上清液，浓缩，再得到浓缩液；
(6)将步骤(5)得到的浓缩液用其自身重量3～5倍的食用乙醇溶解，倾倒出上清液，浓缩，得到萝卜硫素。
优选地，在步骤(1)中，所述加热温度为100～140℃，温度过高会破坏西兰花种子中萝卜硫苷的结构，导致后续萝卜硫素的提取率降低，温度过低提取效率不高。
优选地，在步骤(2)中，所述油枯饼被粉碎成10～50目的小颗粒。
本发明的萝卜硫素的提取方法及黑芥子酶磁性微球，解决了现有方法收率低的问题，具有以下优点：
(1)本发明的方法通过制备四氧化三铁磁性微球，然后以之为载体，固定化西兰花种子中的黑芥子酶，成功得到可以多次重复使用的固定化的黑芥子酶磁性微球，以黑芥子酶磁性微球为催化剂，将萝卜硫苷水解成萝卜硫素，并通过有机溶剂萃取、多次处理后得到高纯度的萝卜硫素，经高效液相色谱检测，本发明提取的萝卜硫素的纯度高达95％；
(2)本发明的方法不需要柱层析或反相柱层析，只需有机溶剂萃取即可得到高纯度的萝卜硫素，其操作方便，简单，且纯度高；
(3)本发明的方法相比现有的提取方法，提取率得到了提高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、四氧化三铁磁性微球制备
向600mL乙二醇中加入20g FeCl3·6H2O和60g醋酸钠，超声搅拌5分钟后，再分别加入50g聚醚酰亚胺(简称PEI)，搅拌5分钟。然后，转入反应釜中，在200℃下反应24h，待反应结束后冷却至室温，将产物依次用乙醇和水分别清洗三次，磁场分离后，磁性成分于60℃下干燥，得到四氧化三铁磁性微球。
2、黑芥子酶液制备
称取200g西兰花种子，倒入研钵中，加入液氮，研磨成粉，加入500mL提取缓冲液(0.2mol/LTris-HCl缓冲液，pH 7.5)，搅拌3分钟后用多层纱布过滤，滤液于4℃条件下，高速离心20分钟，收集上清液，该上清液为黑芥子酶的粗提液。向黑芥子酶的粗提液中加入2倍体积的乙醇，缓慢地边加边搅拌，然后在4℃条件下静置90分钟，然后于4℃条件下，高速(转速为12000r/mim)离心20分钟，收集上清液,4℃条件下透析15小时，经过透析后的液体为西兰花种子中的黑芥子酶液。
3、黑芥子酶磁性微球制备
称取10g四氧化三铁磁性微球，加入2500mL浓度为0.5％的戊二醛溶液，超声搅拌5分钟，40℃反应4小时，然后用磁铁分离，用蒸馏水洗涤3次，然后再加入2500mL黑芥子酶液，25℃固定化20小时，然后用磷酸缓冲液多次清洗，磁场分离，洗掉未结合的酶液，剩余固体(含有固定化酶的磁性微球)进行冷冻干燥，即得到固定化的黑芥子酶磁性微球。
4、萝卜硫素的提取方法
(1)称取1000克西兰花种子，置于炒锅中，设置炒锅温度为110℃，翻炒25分钟，将炒制的西兰花种子用榨油机榨油，除去油脂，得到油枯饼；
(2)将油枯饼粉碎成10目左右的小颗粒，置于浸泡桶中，向桶中加入4公斤蒸馏水，室温搅拌40分钟，倾倒出上清液，得到第一次滤液，再次向桶中加入2公斤蒸馏水，室温搅拌20分钟，倾倒出上清液，得到第二次滤液，合并第一次滤液和第二次滤液，得到萝卜硫苷提取液；
(3)向萝卜硫苷提取液中加入5克固定化的黑芥子酶磁性微球，室温缓慢搅拌30分钟进行酶解，然后用磁铁吸附回收黑芥子酶磁性微球，得到萝卜硫素提取液；
(4)向萝卜硫素提取液中加入4升二氯甲烷，萃取2次，静置分液，得到含有萝卜硫素的二氯甲烷萃取液，减压浓缩回收二氯甲烷后，得到油状液体；
(5)将油状液体用20毫升乙腈溶解，倾倒出上清液，将上清液浓缩成油状液体，再次重复该操作2次，得到淡黄色油状液体；
(6)将淡黄色油状液体用15毫升食用乙醇溶解，倾倒出上清液，将上清液浓缩后得到3.8克淡黄色油状液体，收率为0.38％。
采用高效液相色谱检测，通过常规的峰面积归一法确定该化合物的纯度，结果显示：该油状液体的峰面积占总峰面积的95％以上，表示该油状液体即为纯度高达95％的萝卜硫素。
实施例2
黑芥子酶磁性微球制备的制备方法同实施例1，萝卜硫素的提取方法具体如下：
(1)称取500克西兰花种子，置于炒锅中，设置炒锅温度为110℃，翻炒25分钟，将炒制的西兰花种子用榨油机榨油，除去油脂，得到油枯饼；
(2)将油枯饼粉碎成10目左右的小颗粒，置于浸泡桶中，向桶中加入1.5公斤蒸馏水，室温搅拌40分钟，倾倒出上清液，得到第一次滤液，再次向桶中加入1公斤蒸馏水，室温搅拌20分钟，倾倒出上清液，得到第二次滤液，合并第一次滤液和第二次滤液，得到萝卜硫苷提取液；
(3)向萝卜硫苷提取液中加入2.5克固定化的黑芥子酶磁性微球，室温缓慢搅拌50分钟进行酶解，然后用磁铁吸附回收黑芥子酶磁性微球，得到萝卜硫素提取液；
(4)向萝卜硫素提取液中加入1.5升二氯甲烷，萃取2次，静置分液，得到含有萝卜硫素的二氯甲烷萃取液，减压浓缩回收二氯甲烷后，得到油状液体；
(5)将油状液体用10毫升乙腈溶解，倾倒出上清液，将上清液浓缩成油状，再次重复该操作2次，得到淡黄色油状液体；
(6)将淡黄色油状液体用食用7毫升乙醇溶解，倾倒出上清液，将上清液浓缩后得到1.8克淡黄色油状液体，收率为0.36％。
采用高效液相色谱检测，采用常规的峰面积归一法确定该化合物的纯度，结果显示：该油状液体的峰面积占总峰面积的95％以上，表示该油状液体即为纯度高达95％的萝卜硫素。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
一种萝卜硫素的提取方法及黑芥子酶磁性微球专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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