IPC分类号 : A61K9/127,A61K9/00,A61K9/10,C07D487/00,C07D487/22
专利摘要
提供了包括卟啉‑磷脂缀合物的血清稳定的纳米颗粒。还提供了包括纳米颗粒的组合物。纳米颗粒可以包括诸如治疗剂和/或诊断剂(例如成像剂)的货物，并且可以用于基于NIR刺激的货物释放的药物递送方法中。
权利要求
1.一种组合物，所述组合物包含纳米囊泡，所述纳米囊泡具有双分子层，其中所述纳米囊泡的所述双分子层包含0.5至8mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与pyro缀合的磷脂、和任选的1至6mol％的聚乙二醇-脂质。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述pyro-磷脂具有以下结构：
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述未与pyro缀合的磷脂包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱DSPC和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱DOPC。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述双分子层包括0.5至1.0mol％的pyro-磷脂、35至45％的胆固醇，其余由所述未与pyro缀合的磷脂组成。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物选自由以下组成的组：
i)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP： 53:5:40:2；
ii)DSPC:DOPC:胆固醇:PoP： 55:5:40:0.5；
iii)胆固醇:DSPC:DOPC:PEG-脂质:PoP： 45:35:13:5:2；和
iv)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP： 60:5:35:2。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述纳米囊泡存在于载体中，其中所述载体是生理缓冲液。
7.如权利要求1、2或4中任一项所述的组合物，其中所述未与pyro缀合的磷脂包括DSPC和DOPC，其中所述DOPC以0.1至5mol％存在。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述纳米囊泡包含0.5至5mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、DSPC和DOPC，其中DSPC和DOPC一起为45至61mol％，并且其中DOPC为0.1至5mol％。
9.如权利要求1所述的组合物，其中货物分子存在于所述纳米囊泡中。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述货物是阿霉素、伊立替康、柔红霉素或其组合。
11.如权利要求9所述的组合物，其中所述纳米囊泡包括治疗剂和成像剂，所述治疗剂和所述成像剂是不同的分子。
12.如权利要求9所述的组合物，其中所述货物存在于所述纳米囊泡的内部水性隔室中。
13.如权利要求9所述的组合物，其中所述未与pyro缀合的磷脂与货物药物的摩尔比为10:1至5:1。
14.如权利要求1所述的组合物，还包含另一种类型的纳米囊泡，其中所述另一种类型的纳米囊泡包含0.5至8mol％的红紫素-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与红紫素缀合的磷脂、和任选的1至6mol％的聚乙二醇-脂质，其中所述红紫素-磷脂与所述pyro-磷脂具有不同的最大吸收值。
15.权利要求1至14中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于将货物递送到所需位置，包括以下步骤：
a)向个体施用所述组合物以使其进入循环系统；
b)允许纳米泡囊到达所述所需位置；和
c)将所述纳米泡囊暴露于波长为650至1000nm的近红外照射以使得所述货物从所述纳米泡囊中释放出来。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述纳米囊泡包括成像剂，并且还包括以下步骤：在施用后和使所述纳米囊泡暴露之前对所述个体进行成像，并确定所述纳米囊泡已经到达所述所需位置。
17.如权利要求15所述的用途，其中所述个体是人或非人哺乳动物。
18.如权利要求15所述的用途，其中使所述纳米囊泡暴露于658、665或671nm的波长。
19.如权利要求15所述的用途，其中使所述纳米囊泡暴露于近红外照射长达30分钟。
20.如权利要求15所述的用途，其中步骤c)进行的是多次暴露于所述近红外照射。
21.权利要求1至14中任一项所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于控制释放货物，包括：
a)提供包含在载体中的纳米囊泡的组合物，其中所述纳米囊泡的双分子层包含0.5至8mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与pyro缀合的磷脂和任选的1至6％的聚乙二醇-脂质，其中在室温至37℃的温度下不存在能够检测的货物的释放；和
b)将所述组合物暴露于来自具有10至350mW/cm
其中至少90％的所述货物在步骤b)中暴露于光后的1至8分钟内被释放出来。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述未与pyro缀合的磷脂包括DSPC和DOPC，并且其中DOPC以0.1-5mol％存在。
23.如权利要求21所述的用途，其中所述pyro-磷脂以0.5至1.0mol％存在，并且其中至少50％的所述货物在1分钟内被释放出来。
24.权利要求14所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于顺序释放多种货物，包括：
a)向个体施用至少第一类型的纳米囊泡和第二类型的纳米囊泡，
其中所述第一类型的纳米囊泡的双分子层包含0.5至8mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与pyro缀合的磷脂、和任选的1至6％的聚乙二醇-脂质，
其中所述第二类型的纳米囊泡的双分子层包含0.5至8mol％的红紫素-磷脂、35至45mol％的胆固醇、45至61.5mol％的未与红紫素缀合的磷脂、和任选的1至6％的聚乙二醇-脂质，
其中所述第一类型的纳米囊泡和所述第二类型的纳米囊泡分别含有的所述pyro-磷脂与所述红紫素-磷脂具有不同的最大吸收值；和
b)将所述组合物顺序暴露于至少两种不同波长的光，其中第一波长对应于所述第一类型的纳米囊泡含有的所述pyro-磷脂的所述最大吸收值，并且第二波长对应于所述第二类型的纳米囊泡含有的所述红紫素-磷脂的所述最大吸收值；
从而使得所述第一类型的纳米泡囊中和第二类型的纳米泡囊中的货物顺序释放出来。
25.如权利要求24所述的用途，其中至少两种类型的纳米囊泡存在于相同组合物中。
说明书
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月2日提交的申请号为62/142,105的美国临时专利申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本公开是根据由美国国立卫生研究院授予的编号为EB017270和OD017898的合同在政府的支持下完成的。政府对本发明有一定的权利。
技术领域
本公开大体上涉及递送组合物，更具体地涉及卟啉磷脂缀合物组合物。
背景技术
递送药物至靶组织与被递送的药物同等重要。已经研制出几种临床批准的纳米载体，以增强某些药物的生物学分布和功效。然而，这种递送受到生理屏障和释放动力学的阻碍，使得生物学分布和生物利用度几乎不可避免地都未实现最理想状态。另外，纳米载体在生理环境下的稳定性也很重要。目前，最有效的外部触发的从纳米载体释放货物的方法包括当通过直接或间接加热将周围温度升高到高于体温几度时释放其内容物的系统。然而，这种机制不易于触发侧的释放调节，并且热操作窗口较窄而阻止了在生理温度和生理环境下的高载体稳定性。
公开内容
本公开提供了包括卟啉-磷脂(PoP)缀合物的自组装纳米颗粒。包括本文公开的卟啉-磷脂缀合物、胆固醇和其它脂质的纳米囊泡，在本文中也称为卟啉-磷脂脂质体(“PoP-脂质体”)-被配制以提供以下的高效率：1)装载货物、2)在没有近红外(NIR)照射(650-1000nm)的情况下的稳定的血清货物保留、和3)在暴露于近红外照射时受控的货物释放。
一方面，本公开提供了具有双分子层的纳米囊泡，所述双分子层包括卟啉-磷脂缀合物。在一个实施方案中，纳米囊泡的双分子层包括卟啉-磷脂缀合物、磷脂、胆固醇或其类似物。在一个实施方案中，双分子层包括卟啉-磷脂缀合物、磷脂、胆固醇和聚乙二醇-脂质。在一个实施方案中，本公开提供了组合物，其包括纳米囊泡，该纳米囊泡在合适的介质如缓冲液或盐溶液中。在一个实施方案中，本公开提供了纳米囊泡，其中纳米囊泡的双分子层包括卟啉-脂质、磷脂、胆固醇或其类似物，以及任选的聚乙二醇。纳米囊泡可以存在于缓冲液或盐水溶液中，并且纳米囊泡可以包括货物(例如治疗剂、靶向剂或诊断剂或任何其它药剂)。
一方面，本公开提供了用所需的货物装载纳米囊泡的方法和用于以空间和时间控制的方式在体外或体内递送货物的方法。
在本公开中使用以下缩写：
DSPC：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
Dox：阿霉素(多柔比星)
IRT：伊立替康(irinotecan)
PoP：卟啉-磷脂缀合物(本文也称卟啉-磷脂)
Pyro-磷脂缀合物(本文也称为pyro-磷脂)：可以通过溶血磷脂酰胆碱和焦脱镁叶绿酸之间的酯化反应产生的一种卟啉-磷脂缀合物。
PoP-脂质体：卟啉-磷脂(PoP)-掺杂的脂质体(本文也称为纳米囊泡)
PEG2K-脂质：PEG-脂质，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]
DMPC：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱
DOPC：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DPPC：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
HSPC：L-α-磷脂酰胆碱，氢化的(大豆)
DSPE：1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺
DPPA：1,2-二-十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸(钠盐)
DOTAP：1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(氯盐)
DSPG：1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-外消旋甘油)(钠盐)
附图说明
图1、胆固醇使Dox能够装载进PoP脂质体中。A)Dox与脂质装载摩尔比为1:8的PoP脂质体的Dox主动装载效率。包括5mol％PEG-脂质在内与指定量的胆固醇和Pyro-磷脂以及DSPC一起完成制剂。B)含有或不含有2摩尔％pyro-磷脂的脂质体的Dox主动装载效率。Dox与脂质的装载摩尔比为1:5。数值显示为n＝3的平均值+/-S.D.。C)以摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:PEG-脂质:PoP且1:5的Dox与脂质装载比所形成的Dox-PoP脂质体的冷冻电子显微图像。采用-7至-8微米散焦之间范围的散焦采集图像。箭头指向脂质体内的Dox沉淀物。显示100纳米的比例尺。D)Pyro脂质体的装载效率在药物与脂质装载比为0.2时急剧下降，而无pyro的脂质体的装载效率逐渐降低。
图2、PoP浓度对光触发的Dox释放速率的影响。A)在665nm激光照射期间从掺入不同量的Pyro-磷脂的PoP脂质体的实时Dox释放。没有激光照射时没有可检测的释放出现。B)PoP脂质体释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间。C)光诱导的PoP脂质体释放Dox的速率。D)归一化至Pyro-磷脂的量的光诱导的Dox释放速率。数据显示为n＝3的平均值+/-标准偏差(S.D.)。记录37℃下50％牛血清中的所有测量值。
图3、胆固醇和DSPE-PEG-2K减缓了光触发的从PoP脂质体的释放。A)在665nm激光照射期间从含有2摩尔％Pyro-磷脂和不同量胆固醇的PoP脂质体的实时Dox释放。PoP脂质体释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间相对于掺入的B)胆固醇或C)DSPE-PEG-2K的函数。记录37℃下50％牛血清中的光触发的释放的测量值。D)以不同量的DSPE-PEG-2K并采用1:5的Dox与脂质摩尔比制成的脂质体中的Dox主动装载效率。所有数据显示为n＝3的平均值±S.D.。
图4、Dox与脂质装载比不影响隐形(stealth)PoP脂质体的光触发的释放速率或体外血清稳定性。采用摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:DSPE-PEG-2K:PoP形成隐形PoP脂质体。A)含有或不含有2摩尔％Pyro-磷脂的脂质体在不同药物与脂质摩尔比下的Dox主动装载效率。B)隐形PoP脂质体释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间相对于Dox与脂质摩尔比的函数。C)在50％牛血清中以指定的Dox与脂质摩尔比装载的隐形PoP脂质体在37℃下孵育4小时的血清稳定性。平均值±S.D.，n＝3。
图5、装载有Dox的隐形PoP脂质体的储存稳定性。脂质体储存在4℃下。A)Dox保留；B)脂质体尺寸；和C)脂质体多分散性。D)37℃下在50％牛血清中孵育6小时后，所装载的Dox的体外血清稳定性。E)37℃下在50％牛血清中释放50％所装载的Dox所需的激光照射时间。数据显示为n＝3份不同批次制备的脂质体的平均值±S.D.。
图6、装载在隐形PoP脂质体中的Dox的长效血液循环。装载在指定的脂质体中并通过静脉施用于CD-1小鼠的Dox血清浓度。数值显示为每组n＝4-5只小鼠的平均值±S.D.。
图7、在对侧Mia Paca-2双侧肿瘤模型中激光诱导的从隐形PoP脂质体的Dox沉积增强。静脉注射装载有Dox的隐形PoP脂质体后1小时，用665nm激光仅照射小鼠一侧胁腹上的肿瘤。照射后立即处死小鼠，并测定经过处理和未经处理的肿瘤中的Dox浓度。A)5mg/kg或10mg/kgDox的注射剂量对隐形PoP脂质体的影响。用665nm的照射以350mW/cm
图8、施用隐形PoP脂质体并进行光处理期间的肿瘤表面温度和血液流量。A)以指定的Dox剂量静脉内施用PoP脂质体后1小时，在以指示的功率的665nm激光二极管处理期间MIA Paca-2异种移植物的表面温度。B)由激光处理本身引起的肿瘤血液流量的相对变化。如图所示，以指示的注量率开启激光。C，D)在指示的激光注量率下，静脉内施用隐形PoP脂质体后1小时，小鼠肿瘤血液流量的相对变化相对于时间(C)或累积注量(D)的函数。数值表示为每组n＝3-4只小鼠的平均值和S.D.(血液流动数据是在单一竖直方向上)。
图9、施用装载有Dox的隐形PoP脂质体并进行光处理的功效。当肿瘤直径达到4-5mm时，对MIA Paca-2肿瘤荷瘤裸鼠进行处理，当肿瘤体积增加至10倍时处死裸鼠。激光处理包括施用300J/cm
图10、空PoP脂质体的结构。采用摩尔比为53:40:5:2的DSPC:CHOL:PEG-脂质:PoP形成的Dox-PoP脂质体的冷冻电子显微照片。比例尺表示100nm。
图11、Pyro-磷脂能够实现良好的血清稳定性和快速的光触发的药物释放，而HPPH-脂质不能。由含有2％HPPH-脂质和35％胆固醇、2％HPPH-脂质和40％胆固醇、或者2％Pyro-磷脂和40％胆固醇的脂质体制成的PoP脂质体释放Dox的代表性实时图。将所有脂质体在50％成熟牛血清中孵育1小时，并在1小时开始激光照射。所有脂质体均含有5mol％的DSPE-PEG-2K，并以摩尔比为1:5的药物与脂质进行装载。
图12、2％HPPH-脂质对于快速释放所装载的Dox是最佳的。所有制剂均采用35mol％胆固醇和5mol％DSPE-PEG-2K(1:8的药物与脂质比)。A)在激光照射时，含有可变量的HPPH并装载有阿霉素的HPPH脂质体的释放曲线。B)含有可变量的HPPH-脂质的HPPH脂质体达到释放50％阿霉素所需的时间。平均值±S.D.，n＝3。
图13、采用装载有Dox的隐形PoP脂质体进行的NIR光触发的血清中快速释放。A)NIR激光诱导的新型(2％Pyro-磷脂)PoP脂质体制剂的释放速率和先前报道的(10％HPPH-脂质)的PoP脂质体制剂的释放速率的比较。B)先前报道的PoP脂质制剂(10％HPPH脂质)和隐形PoP脂质体制剂(2％Pyro-磷脂)达到释放50％Dox所需的时间。先前的制剂采用10％HPPH-脂质、35％胆固醇以及1:8的药物与脂质装载比，而隐形PoP脂质体制剂由2％Pyro-磷脂、40％胆固醇、1:5的药物与脂质装载比组成。平均值±S.D.，n＝3。
图14、5％PEG-脂质保持快速释放速率和高装载效率。37℃下在50％经滤过的成熟牛血清中含有3％、5％和8％PEG-脂质的2％Pyro-磷脂、45％胆固醇的脂质体释放50％所需的时间(A)；由0％、1％、3％、5％和8％PEG-脂质、45％胆固醇(B)制成的脂质体的装载效率。平均值±S.D.，n＝3。
图15、包括DSPC、DPPC、HSPC和DOPC的各种磷脂酰胆碱(PC)脂质可用于Pyro脂质体释放，同时保持血清稳定性。在PBS中测试由53摩尔％DSPC、DPPC、HSPC和DOPC制成的装载有阿霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由53摩尔％的DSPC、DPPC、HSPC和DOPC制成的Pyro脂质体的Zeta电位(ζ电位)(B)；由53摩尔％的DSPC、DPPC、HSPC或DOPC制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下在50％经滤过的成熟牛血清中保持4小时的稳定性(D)。所有制剂均由53摩尔％的DSPC、DPPC或HSPC或DOPC、5摩尔％PEG2k，40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比制成。
图16、阳离子脂质DOTAP和磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)脂质也可用于Pyro脂质体而用于光触发释放。在PBS中测试由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的装载有阿霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)。由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下由43摩尔％DOTAP、53摩尔％DSPE或DPPA制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中保持4小时的稳定性(D)。含有DSPE或DPPA的脂质体由53摩尔DSPE或DPPA、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比制成。含有阳离子脂质DOTAP的脂质体由43摩尔％DSPC、20摩尔％DOTAP、35摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂制成。
图17、PC、磷脂酰甘油(PG)、PA和PE脂质可用于Pyro脂质体进行光触发释放。在PBS中测试由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE制成的装载有伊立替康(IRT)的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)。由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。所有制剂均由53摩尔％DMPC、DSPG、DPPA或DSPE、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的伊立替康与脂质的装载比制成。
图18、胆固醇、胆甾烷醇、谷甾醇和豆甾醇可用于形成Pyro脂质体。在PBS中测试由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的装载有阿霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)。由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下由40摩尔％胆固醇、β-胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中保持4小时的稳定性(D)。所有制剂均由53摩尔％DSPC、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇、胆甾烷醇、谷甾醇或豆甾醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比制成。
图19、阿霉素、伊立替康和柔红霉素可以被主动装载到Pyro脂质体中，并且在激光照射下被释放出来。在PBS中测试装载有阿霉素、伊立替康或柔红霉素的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试装载有阿霉素、伊立替康和柔红霉素的Pyro脂质体的Zeta电位(B)；装载有阿霉素、伊立替康或柔红霉素的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放(C)。37℃下装载有阿霉素、伊立替康或柔红霉素的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中保持4h的稳定性(D)。装载有Dox的Pyro脂质体的制剂是53摩尔％DSPC、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的阿霉素与脂质的装载比。装载有伊立替康的Pyro脂质体的制剂为50摩尔％鞘磷脂、45摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂。装载有柔红霉素的Pyro脂质体的制剂是43摩尔％DSPC、5摩尔％的PEG2k、50摩尔％胆固醇和2％Pyro-磷脂。所有药物与脂质的摩尔装载比为1:8。
图20、可以使用具有可变长度的酰基链的Pyro脂质来形成pyro脂质体。在PBS中测试由具有长度为14、16或18碳的链的Pyro脂质制成的装载有伊立替康(IRT)的Pyro脂质体的尺寸(A)；在蒸馏水中测试了由具有不同长度14、16或18的碳链的Pyro脂质制成的Pyro脂质体的Zeta电位(B)；(C)由具有长度为14、16或18的碳链的Pyro脂质制成的Pyro脂质体在50％经滤过的成熟牛血清中的触发释放。(D)由具有长度为16和18的碳链的Pyro脂质制成的Pyro脂质体(Dox与脂质的装载比为1:8)在50％经滤过的成熟牛血清中的光触发释放。所有制剂均由53摩尔％DSPC、5摩尔％PEG2k、40摩尔％胆固醇和2摩尔％Pyro-磷脂、以1:8的伊立替康或阿霉素与脂质的摩尔装载比制成。
图21、在含有少量DOPC和PoP的脂质体中光触发的快速Dox释放。(A)37℃下在50％牛血清中以310mW/cm
图22、增强的光触发释放是与单线态氧相关的。(A)在对PBS中的PoP脂质体进行照射(310mW/cm
图23、对PoP脂质体进行光照射导致DOPC的氧化。(A)以310mW/cm
图24、抗坏血酸盐抑制光触发的脂质氧化。在存在或不存在5mM抗坏血酸钠的情况下，用665nm激光二极管以310mW/cm
图25、含有DOPC的PoP脂质体在NIR照射时的瞬时透化。(A)在PBS中测量的进行或不进行激光照射(250mW/cm
图26、对装载有Dox的含DOPC的PoP脂质体进行体内评价。(A)静脉注射含DOPC的Dox-PoP脂质体(10mg/kg Dox)后，Dox在血清中的药代动力学。数据显示平均值±S.D.，n＝4。(B)静脉内施用Dox-PoP脂质体(6mg/kg Dox)并进行或不进行激光照射(250mW/cm
图27、DOPC有助于PoP脂质体装载Dox。DOPC有助于将Dox装载到不含PEG-脂质的PoP脂质体(2mol％PoP)中。数据表示为平均值±S.D.，n＝2-3。
图28、PEG-脂质阻止含有DOPC的PoP脂质体的光触发释放速率。(A)含有或不含有PEG的PoP脂质体(0.1mol％PoP)光触发的Dox释放曲线。(B)含有或不含有PEG-脂质的PoP脂质体(0.1mol％PoP)达到释放50％Dox所需的时间。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。
图29、Dox释放所需的总能量取决于施加的注量率。(A)在50％牛血清中以各种注量率进行照射的Dox释放。(B)达到释放90％Dox所需的时间相对于注量率的函数。(C)达到释放90％Dox所需的总注量相对于注量率的函数。数据表示为平均值±S.D.，n＝3。
图30、DOPC的顺式构型是增强光释放所需要的。(A)37℃下，在50％牛血清中的PoP脂质体(0.3mol％PoP、5mol％18:1(反式)PC、18:1(顺式)PC)在照射(310mW/cm
图31、照射时新物质的产生。(A)在照射(310mW/cm
图32、胆固醇的氧化导致货物从无DOPC的PoP脂质体中释放出来。(A)两种脂质体分别含有5mol％PEG-脂质、5mol％PoP、0％胆固醇和90mol％DSPC或5mol％PEG-脂质、5mol％PoP、40％胆固醇和50mol％DSPC。室温下，在PBS中以250mW/cm
图33、经过预照射的PoP脂质体的无效Dox装载。在250mM硫酸铵溶液中，以310mW/cm
图34、装载有Dox的含DOPC的PoP脂质体的物理表征和稳定性。(A)装载有Dox的脂质体的负染TEM图像。示出了200nm比例尺。(B)在PBS中测试的装载有Dox的脂质体的尺寸分布。(C)在4℃下储存3个月的PoP脂质体(0.3mol％PoP)中的Dox％保留量。(D)在PBS中测试的装载有Dox的PoP脂质体在3个月内的尺寸。(E)在PBS中测试的装载有Dox的PoP脂质体在3个月内的多分散性指数(PDI)。数据表示为平均值±S.D.，3份不同批次制备的脂质体。
图35、光处理后的体内参数。(A)激光处理后即刻的装载有Dox的PoP脂质体的生物学分布。图6A中(B)和图6B中(C)小鼠在四周内的体重。数据表示为平均值±S.D.，n＝5-6。
图36、多颜色多通道PoP脂质体的研制。a)pyro-PoP和红紫素-PoP的结构。b)所指示的PoP脂质体在水中的吸收光谱。示出了实验室激光激发的波长。c)在665或695nm激光下，pyro-PoP或红紫素-PoP的Dox释放。
图37、a)将不同量的Pyro-磷脂到脂质体中增加了被动装载的货物(亲水性染料SRB)的释放。b)归一化到所存在的pyro-磷脂的量的释放速率。
图38、PoP脂质体(2摩尔％PoP)同时装载有Gd-DTPA、SRB和奥沙利铂。去除游离货物并将脂质体瘤内注射到B16F10黑素瘤荷瘤小鼠中。利用SRB荧光1)引导注射并2)显示在肿瘤内分布以及3)监测释放。Gd-DTPA旨在用于MR对比，并且奥沙利铂具有治疗作用。a)由665nm激光照射触发的Gd、PT和SRB的释放相对于时间的函数。b)在没有NIR光的情况下SRB的释放。c)注射前的小鼠、注射后即刻的小鼠、注射后1小时的小鼠和激光处理后1小时的小鼠的图像。
图39、药物装载和释放。A)将Pyro-磷脂PoP滴定到由DSPC:DSPE-PEG2000:Chol(60:5:35摩尔比)组成的脂质体中来代替DSPC，以比较pyro-磷脂含量对Dox和IRT装载的影响。B)在665nm激光照射下由2％pyro-磷脂组成的脂质体释放的Dox和IRT。
图40、药物对脂质体形态的影响。由DSPC:DSPE-PEG2000:Pyro-磷脂:Chol(58:5:2:35)组成的分别装载有IRT(A)和Dox(B)的PoP-脂质体的冷冻TEM(Cryo-TEM)图像。
具体实施方式
在本公开中，提供了具有高装载效率的血清稳定的光控释放的卟啉-磷脂纳米囊泡(PoP-脂质体)。货物从PoP-脂质体的释放可以通过近红外(NIR)光直接触发，近红外光是临床适用的刺激，具有在“关闭状态”下可忽略不计的作用和对周围生物组织最小的干扰。
本公开是基于通过在纳米囊泡的制剂中包括胆固醇而可以使这些囊泡的装载效率得以提高并使血清稳定性得以改善的令人惊讶且意想不到的观察结果。本公开的纳米囊泡包括卟啉-脂质、磷脂、胆固醇和任选的PEG-脂质。本公开的纳米囊泡表现出货物的稳定装载、高装载效率、血清稳定性和控制释放。
在具体的实施方案中，本公开的PoP-脂质体的双分子层包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：卟啉缀合物、磷脂、胆固醇和任选的PEG-脂质。在一个实施方案中，本公开的PoP脂质体的双分子层包括卟啉缀合物和脂质，其中仅有的脂质-无论是否缀合至卟或作为额外的脂质存在-是磷脂和固醇。
一方面，本公开提供了包括卟啉-磷脂和胆固醇以及其它脂质组分的脂质体制剂，该脂质体制剂能够1)响应于对近红外(NIR)光的暴露而快速释放内容物；2)主动将药物装载进脂质体；3)在没有暴露于激光的情况下，在血清中稳定(例如持续6小时药物泄漏小于20％)。本公开制剂的特征在于，它最大限度地减少了装载有货物的PoP脂质体(货物-PoP-脂质体)中的PoP量，同时保持血清稳定性和快速释放的性能。这是有利的，因为增加光敏组分的量会对患者具有潜在的副作用(例如阳光敏感性)。
在一个方面，本公开提供纳米囊泡和包括纳米囊泡的组合物。纳米囊泡的双分子层包括卟啉缀合物。构成纳米囊泡的部分或全部双分子层的卟啉缀合物包括卟啉、卟啉衍生物、卟啉类似物或其组合。示例性的卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性的卟啉衍生物包括焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素A、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、维尔丁(verdins)、罗丁(rhodins)、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟酚、托尼卟啉和苯并细菌二氢卟酚。示例性的卟啉类似物包括扩展的卟啉家族成员(例如得克萨卟啉(texaphyrins)、sapphyrins和六卟啉(hexaphyrins))和卟啉异构体(例如类卟吩(porphycenes)、错位卟啉(inverted porphyrins)、酞菁和萘酞菁)。
在某些实施方案中，卟啉缀合物包括螯合在其中的金属，优选地二价金属如Zn、Cu、Ni、Co、Pd或Mn，以及任选地金属的放射性同位素，如Cu-64。
如本文所用，“磷脂”是具有亲水性头基的脂质，亲水性头基具有通过甘油主链连接至疏水脂质尾部的磷酸基团。磷脂包括6-22个碳原子(包括其间的所有整数个碳原子和之间的范围)的酰基侧链。在某些实施方案中，卟啉缀合物中的磷脂是1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。卟啉缀合物中的磷脂可以包括以下、或基本上由以下组成：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanoloamine)、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇组成。
在某些实施方案中，自组装的纳米囊泡的双分子层还包括PEG-脂质。PEG-脂质可以是DSPE-PEG，例如DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG-5000或其它尺寸的DSPE-PEG。PEG-脂质以0.5至8mol％(包括其间至小数点后第十位的所有百分比的量)的量存在。在一个实施方案中，PEG-脂质以4-6mol％存在。在一个实施方案中，PEG-脂质以约5％(4.8至5.2mol％)存在。PEG部分的平均分子量可以在500至5000道尔顿以及其间的所有整数值和之间的范围。在一个实施方案中，PEG部分的分子量为2000道尔顿。
在多种实施方案中，除了本文公开的卟啉缀合物之外，纳米囊泡的双分子层还包括其它极性脂质。本公开组合物的磷脂的脂肪酸链可含有合适数目的碳原子以形成双分子层。例如，脂肪酸链可以含有12、14、16、18、20或22个碳原子。在不同的实施方案中，双分子层可以包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanoloamine)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和/或阳离子脂质。合适的脂质的示例包括但不限于，DSPC、DPPC、DMPC、HSPC、DSPG、DPPA、DSPE、DOTAP、鞘磷脂等。
本公开的纳米囊泡的双分子层还包括固醇。固醇可以是动物固醇或植物固醇。固醇的示例包括胆固醇、谷甾醇、豆甾醇和胆甾烷醇。例如，胆固醇可以大于30mol％。在一个实施方案中，胆固醇为35至50mol％以及其间所有的整数。在一个实施方案中，胆固醇为约45％(43-47mol％)。在一个实施方案中，胆固醇为40、41、42、43、44或45mol％。使用本公开的PoP-脂质体单体使得能够有效地将货物装载到纳米泡囊中，并且使用温和的NIR导致货物的快速且高达100％的释放。
本公开提供了包括具有以下结构的卟啉-磷脂缀合物的组合物：
在一个实施方案中，本公开的纳米囊泡的卟啉-磷脂缀合物化合物的摩尔百分比为0.1至5。在一个实施方案中，PoP-脂质体双分子层由0.5至8mol％组成。在一个实施方案中，PoP-脂质体双分子层包括1、2、3、4、5、6、7或8mol％。在一个实施方案中，PoP-脂质体包括在0.1至8.0之间的所有至小数点后第十位的摩尔百分数。
在一个实施方案中，本公开的组合物包括纳米囊泡，其中纳米囊泡包含双分子层，其中双分子层包括45至61.5mol％的磷脂、0.5至8％的卟啉缀合物、35至45％的固醇，以及任选地1至6mol％PEG-脂质。在一个实施方案中，以所需量加入卟啉缀合物、固醇以及任选地PEG-脂质PEG，然后其余部分由磷脂组成。在一个实施方案中，双分子层包括0.5至8％的pyro-磷脂、35至45％的胆固醇，以及任选地，1至6mol％的PEG-脂质，其余部分由磷脂(例如DSPC)组成。
本公开的纳米囊泡可以具有0.1至5mol％的pyro-磷脂、30至50％的固醇，任选地PEG-脂质，和其余的磷脂(其不是pyro-磷脂)。例如，纳米囊泡可具有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0mol％pyro-磷脂、30-50mol％胆固醇，任选地，1-6mol％PEG-脂质和其余的磷脂。磷脂可以是任何磷脂。例如，磷脂可以是DSPC。磷脂可以是DOPC和DSPC。在一个示例中，DSPC和DOPC都存在，并且DOPC以1至10mol％存在。例如，纳米囊泡可以具有0.1至5mol％的pyro-磷脂、30至50％的胆固醇，任选地1-6mol％的PEG-脂质、0.1至10mol％的DOPC和其余的DSPC。部分的DSPC可以被其它磷脂(例如饱和的、不饱和的、或部分不饱和的磷脂)或脂质(例如鞘磷脂)替代。当用NIR光照射制剂时，发现制剂展现出所需的货物释放(例如，用350mW/cm
磷脂(即，未与卟啉缀合的游离磷脂)可以具有两个饱和的烷基链(例如，饱和磷脂诸如，例如，DSPC)或两个不饱和的烷基链(例如，不饱和磷脂诸如，例如DOPC和DLPC)或一个饱和的烷基链和一个不饱和的烷基链(例如，部分不饱和磷脂)。不饱和磷脂可以具有至少一个或全部顺式碳-碳双键。磷脂可以是饱和磷脂、不饱和磷脂和/或部分不饱和磷脂的混合物。不饱和磷脂可以占纳米囊泡的0.1mol％至10mol％。例如，不饱和磷脂可以占纳米囊泡的0.1mol％至6.5mol％。在一个示例中，纳米囊泡包括占x mol％的不饱和磷脂，占y-xmol％的饱和磷脂(其中y＝45至61mol％，诸如，例如59至60mol％以及其间至小数点第十位的所有数值)，占30至50mol％的固醇，和占0.1至5mol％(诸如，例如，0.1至1.0mol％)的卟啉缀合物。在一个示例中，纳米囊泡包含占x mol％的DOPC，占y-x mol％的DSPC(其中y＝45至61mol％，诸如，例如，45至60、59至61或59至60mol％，以及其间至小数点第十位的所有数值)，占30至50mol％的胆固醇，和占0.1至5mol％的pyro-磷酯(诸如，例如，0.1至1.0mol％)。例如，纳米囊泡可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：0.1至1.0mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、0.1至5mol％的DOPC、其余的为DSPC。
在货物(例如药物)装载之前，纳米泡囊基本上是球形的。在货物(例如药物)装载之后，纳米泡囊可以是非球形的。纳米囊泡(装载的或未装载的)可以具有直径为50nm至250nm(以及其间nm级别的所有整数和之间的范围)的尺寸(例如，最长尺寸)。在一个实施方案中，纳米囊泡的尺寸为75-175nm。在一个实施方案中，组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的纳米囊泡具有50至250nm、75至175nm、或80-100nm的尺寸。在一个实施方案中，在PBS中进行观察这些尺寸。
组合物可以包括载体中的一个或多个纳米囊泡。例如，组合物还包括载体。载体可以是适合用于施用给包括人的个体的水性载体。载体可以是无菌的。载体可以是生理缓冲液。合适的载体的示例包括蔗糖、葡萄糖、生理盐水和/或pH缓冲因子(例如缓冲至例如pH5-9、pH 6至8，(诸如6.5)的pH的缓冲因子)，例如组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐。
一方面，本公开提供了组合物，其包括本公开的纳米囊泡和用于施用给包括人的个体的合适的无菌载体-例如生理缓冲剂如蔗糖、葡萄糖、生理盐水、pH缓冲(例如pH 5至9，pH7至8，pH 7.2至7.6(例如7.4))因子，例如组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐。在一个实施方案中，组合物包括至少0.1％(w/v)的本公开的PoP-脂质体。在多个实施方案中，组合物包括0.1至100％的PoP-脂质体。部分的药物分子(货物)可以嵌入双分子层中。
一方面，可以将本公开的PoP脂质体提供在基于血清的介质或载体中。因此，例如，PoP脂质体可存在于经过稀释的、经过浓缩的或未经稀释的血清中。
PoP脂质体制剂可以在生理温度(例如37℃)下在缓冲液(包括生理缓冲液或含血清的介质)中孵育4至24小时的时间段，而不释放其中大部分的货物。在多个示例中，PoP脂质体制剂可以在生理缓冲液或含血清的介质中在生理温度(例如37℃)下孵育4至24小时的时间段，而不会释放60％或更多、70％或更多、80％或更多、或者90％或更多其中的货物。
纳米泡囊在经过稀释的(例如，50重量％的血清和50重量％的水性缓冲液)或未稀释的血清中是稳定的。在多个示例中，在生理温度(例如37℃)下保存6小时至24小时后，纳米泡囊释放20％或更少、15％或更少、或者10％或更少的其中的货物。
可以将各种各样的货物装载到本公开的纳米囊泡中，并利用近红外光将其递送到所需的位置。例如，生物活性或治疗剂、诊断剂、靶向剂、药用物质和/或药物可以被封装在PoP-脂质体内部。这包括水溶性药物以及可以通过化学梯度而被装载并浓缩在纳米囊泡的水性核心中的弱酸或弱碱的药物。因此，在多个实施方案中，纳米囊泡包括封装在其中的活性剂，例如治疗剂或诊断剂，所述活性剂可以是化疗剂如阿霉素。在一个实施方案中，化学治疗剂阿霉素和/或伊立替康可以被主动装载并通过NIR照射并释放出来，从而利用PoP纳米囊泡提供强效且直接的光触发的释放。
货物可以是被动装载的，并且可以是，包括但不限于，亲水性成像和治疗性化合物例如钆螯合物、例如Gd-DTPA，荧光成像染料如ICG、SRB或荧光素，以及被动装载的药物例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、甲氨蝶呤、磷酸泼尼松龙、庆大霉素或治疗性蛋白质和治疗性核酸。货物可以是主动装载的货物，如弱两亲性药物，其中弱碱性部分或弱酸性部分在脂质体内形成沉淀物，并且包括但不限于布比卡因、表阿霉素(表柔比星)、柔红霉素、长春花碱、氢吗啡酮、长春新碱、丝裂霉素C、多巴胺、血清素、肾上腺素、可待因、哌替啶、美沙酮、吗啡、阿托品、丙咪嗪、阿米替林、多塞平、地昔帕明、奎尼丁、吖啶橙。
在一个实施方案中，脂质与药物(或任何其它货物药剂)的比例为10:1至5:1(以摩尔为单位)。在多个实施方案中，脂质与药物/货物的比例为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1或5:1。在一个实施方案中，用于这些测定的脂质值考虑了所有脂质-包括与卟啉缀合的脂质、另外的磷脂、固醇和与PEG(如果存在)缀合的脂质。
术语“治疗剂”是指作为生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。也称为“药物”的治疗剂的示例在公知的文献参考例如Merck Index，Physicians DeskReference和Pharmacological Basis of Therapeutics中有所描述，并且它们包括但不限于：药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或感染(illness)的物质；影响机体结构或功能的物质；或前药，它们在被放置于生理环境中后变得具有生物活性或更有活性。可以使用各种形式的治疗剂，它们能够在施用于受试者时从目标组合物被释放到相邻组织或液体中。已知通过主动梯度被装载的药物包括阿霉素、伊立替康、吉西他滨、表阿霉素、拓扑替康、长春新碱、米托蒽醌、环丙沙星、顺铂和柔红霉素。这些药物可以被装载到PoP脂质体中并从PoP脂质体中释放出来。治疗性货物还包括各种抗生素(如庆大霉素)或其它有效抵抗由细菌、真菌、寄生虫或其它生物引起的感染的药剂、抗炎剂或抗病毒剂。
“诊断”或“诊断剂”是可用于诊断的任何化学部分。例如，诊断剂包括成像剂，例如含有放射性同位素诸如铟或锝的成像剂；含有碘或钆螯合物的造影剂。
在某些实施方案中，纳米囊泡还包括靶向分子，例如抗体、肽、适配体或叶酸。“靶向分子”是可以将纳米囊泡导向特定靶标的任何分子，例如通过结合至被靶向细胞表面上的受体或其它分子。靶向分子可以是蛋白质、肽、核酸分子、糖或多糖、受体配体或其它小分子。通过选择靶向分子可以调节特异性程度。例如，抗体通常表现出高特异性。这些可以是多克隆、单克隆、片段、重组体或单链，其中许多是可商购获得的或使用标准技术容易地获得的。
一方面，本公开提供了制备纳米囊泡的方法，其包括在缓冲液中混合卟啉-磷脂缀合物，其中卟啉-磷脂缀合物如本文所述，并且挤出混合物以产生包括所需量的卟啉-磷脂缀合物的双分子层的卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡。除了卟啉-磷脂(例如2mol％)之外，混合物中还可以包括其它磷脂或脂质以制备PoP-脂质体。例如，在一个实施方案中，可以使用DSPE-PEG-2K(例如，5mol％)；胆固醇(例如，40mol％)和脂质(例如，DSPC 53mol％)。卟啉-磷脂缀合物可以通过将含羧酸的四吡咯酯化成溶血磷脂来制备。例如，Pyro-磷脂可以在室温下利用EDC和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，Fisher#AC14827-0250)与1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(溶血-C16-PC，Avanti#855675P)在氯仿中以摩尔比为1:1:2:2的溶血C16-PC:Pyro:EDC:DMAP酯化。
在一个实施方案中，PoP-脂质体通过卟啉-脂质、胆固醇和其它脂质以及任选地PEG-脂质组分的分散体形成。例如，在一个实施方案中，Pyro-磷脂脂质体可以通过将DSPC、DSPE-PEG2K、Pyro-磷脂和胆固醇溶解在溶剂中并加热(例如到60至70℃)来制备。然后可以将缓冲的硫酸铵或柠檬酸钠加入到反应混合物中同时保持温度。形成脂质体时，可以将脂质体在高压下(例如利用依次层叠的聚碳酸酯膜)挤出以获得所需尺寸的脂质体。可以除去(如通过透析)残留的原料，例如硫酸铵或柠檬酸钠。将货物装载进纳米囊泡可以通过加入所需比例的货物然后孵育来进行。如果需要，可以通过光散射技术测定脂质体尺寸和Zeta电位。通过使脂质体溶液流过柱子可以确定装载效率，并定量药物在含有脂质体的洗脱液(fraction)中的百分比。利用荧光光谱法可以测量药物的量。通过利用激光二极管可以实现光触发的释放。如果需要，通过测量暴露于激光之前和之后的释放可以评估货物释放。
一方面，本公开提供了将作为货物含有在纳米囊泡中的药剂递送到所需位置的方法。虽然在本公开中货物有时被描述为药物，但是该描述同样适用于用于治疗和/或递送到所需位置所含有的任何药剂，术语“药物”旨在表示任何药剂。所述试剂的整体或部分可以含有在PoP-脂质体内或PoP-脂质体中，无论是存在于水性隔室、双分子层或二者中。因此，另一方面，本公开提供了用于递送纳米囊泡的货物的方法，包括以下步骤：1)提供包括本公开纳米囊泡的组合物，该纳米囊泡包括货物(例如活性剂)；2)使纳米囊泡到达选定的或所需的目的地；3)在使得至少一部分货物从纳米囊泡中释放出来的条件下，用具有近红外波长的照射对纳米囊泡进行照射。
可以在体外或体内进行本公开的方法。当在体内进行该方法时，在一个实施方案中，采用近红外照射的照射使得周围组织的温度升高不超过10℃。在多个实施方案中，周围组织的温度升高不超过5、6、7、8、9和10、11和12℃。在其它实施方案中，周围组织的温度升高小于5℃。本公开的方法可以用于包括动物和人的任何年龄的任何个体。
利用功率为5至1000mW/cm
货物的释放取决于激光功率。在一个实施方案中，在生理温度(约37℃)下，在生理缓冲液或基于血清的培养基中的本公开的制剂在没有光触发的情况下表现出不可检测到的货物释放。然而，当来自300mW/cm
货物的释放程度也取决于暴露时间。一般来说，长达30分钟或更短的时间就足够了。可以在体外或体内对纳米囊泡照射0.5至30分钟和其间至小数点后第十位的所有数值。例如，可以用665nm激光二极管照射纳米囊泡长达10分钟。通过改变激光功率和/或激光时间，实现对从纳米囊泡中释放出多少药物的控制。此外，控制照射以实现可以导致更低的全身药物释放并且不会损害具有广泛脉管系统的器官(例如胰腺)中的重要血管的“仅小血管”的光释放策略。通过在所需区域上照射激光可以将红外照射直接递送到该区域，或者可以利用光纤探针。在肿瘤的情况下，可以将光纤探针插入肿瘤(即，通过导管或内窥镜装置)以向局部区域提供照射。暴露于激光后，可以重新封闭纳米泡囊。以这种方式，纳米泡囊的打开和关闭可以是可逆的。
该方法可以利用装载有成像剂和治疗剂进入脂质体的纳米囊泡。这些脂质体可以施用于个体(例如，注射到肿瘤中)，并且成像剂用于验证纳米囊泡的位置和/或肿瘤的分布，并且被照射的纳米囊泡引发药剂的释放。
所述方法可以通过照射具有至少一种不同卟啉缀合物的两种或更多种类型的纳米囊泡，来选择递送/顺序递送两种或更多种货物。选择递送/顺序递送的示例在示例4中进行了描述。例如，如果所施用的纳米囊泡中的各个卟啉缀合物的最大吸收值允许从一种类型的纳米泡囊中触发释放、而没有从其它纳米囊泡的可检测的触发释放。例如，通过用触发从一种或多种类型的纳米囊泡释放而不触发超过20％的货物从至少一种其它类型的纳米颗粒释放的波长的光照射至少两种不同纳米囊泡，可以选择递送或顺序递送含有至少一种不同的卟啉缀合物的至少两种不同的纳米囊泡(具有相差10nm或更大的吸收最大值)。在多个示例中，通过用触发从一种或多种类型的纳米囊泡释放而不触发超过10、5、4、3、2、1或0.5％的货物从至少一种其它类型的纳米颗粒释放的波长的光照射至少两种纳米囊泡，可以选择递送或顺序递送含有至少一种不同的卟啉缀合物的至少两种纳米囊泡(具有相差15、20、25或50nm或更大的吸收最大值)。在一个示例中，通过用触发从一种或多种类型的纳米囊泡释放而不触发任何可检测的货物从至少一种其它类型的纳米颗粒释放的波长的光照射至少两种纳米囊泡，可以选择递送或顺序递送含有至少一种不同的卟啉缀合物的至少两种纳米囊泡(具有相差10、15、20、25或50nm或更大的吸收最大值)。可以通过本领域已知的方法和本文公开的方法检测货物的释放。
本公开的纳米囊泡的有益性质是在37℃下在含有血清的介质中孵育直到将近红外光投射到纳米囊泡时，活性剂的释放最小(即，每小时释放小于5％的内容物)。在一个实施方案中，以足够的激光功率照射靶标组织中的活性剂(货物)，100％的活性剂(货物)从纳米囊泡中释放出来。当活性剂在体内从纳米囊泡中释放出来时，组织周围的温度不会显著增加。通过选择所施加的NIR强度，可以控制在给定位置或给定时间释放出的货物的量。因此，可以在所需的位置和时间从纳米囊泡中释放出1至100％(及其间的所有整数)之间任何值的货物。在一个实施方案中，货物的释放(1至100％之间任何值的货物)是在一个或多个步骤中实现的。例如，可以以所需的时间间隔进行脉冲的NIR暴露以使得货物逐步释放出来。
可以将包括在合适载体中的纳米囊泡的组合物通过任何合适的途径施用于个体。在一个实施方案中，通过静脉内输注来施用组合物，以使得其会进入脉管系统(循环系统)。可以全身施用组合物，或者可以将组合物直接施用到供应给特定器官或组织或肿瘤的血液中。当被NIR照射时，PoP-脂质体的内容物可以在循环系统内释放出来，然后可以进入周围组织。在某些实施方案中，可以将PoP-脂质体直接提供给相关组织。
另外，PoP-脂质体的血清稳定性实现了在更长时间点进行触发释放的选择(稳定性较低的递送系统在施用后一定会被立即触发)。
在一个实施方案中，本公开提供了包括至少0.5mol％至8mol％和其间至小数点第十位的所有百分比的卟啉-磷脂缀合物的双分子层的纳米囊泡。在具体实施方案中，纳米囊泡含有1至8mol％、0.5至5.0mol％、0.5至3mol％、1至3mol％、约2mol％(1.5至2.5mol％)和2mol％的卟啉-磷脂缀合物，其中卟啉-磷脂缀合物可以是Pyro-磷脂的结构。在一个实施方案中，本公开提供了包括在合适的载体中的纳米囊泡的组合物。在另一实施方案中，本公开提供了将药剂递送至所需位置的方法，包括以下步骤：将作为货物的药剂装载到本公开的PoP-脂质体中，将PoP-脂质体施用于个体，并通过当纳米泡囊在所需位置通过脉管系统时使近红外照射向其投射而使货物从纳米囊泡释放出来，从而使得货物(药剂)在所需位置释放出来。在一个实施方案中，进行NIR照射时，当纳米泡囊移动通过小血管(例如毛细血管)时，可以实现货物(药剂)释放。以这种方式，药物释放可以仅限于靶组织中较小的血管，而不会在较大血管的附近。
在下面的附加项(Statements)中，描述了本公开的组合物和方法的各种示例：
1、在一个示例中，组合物包括纳米囊泡(例如，具有双分子层的纳米囊泡)，其中纳米囊泡的双分子层包括0.1至5mol％的卟啉-磷脂、30至50％的固醇、45至61.5mol％的未与卟啉缀合的磷脂，以及任选地1至6％的聚乙二醇-脂质。
2、在另一示例中，组合物是附加项1的组合物，其中卟啉-磷脂具有以下结构(pyro-磷脂)：
3、在另一示例中，组合物是附加项1或2的组合物，其中固醇是胆固醇。
4、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中磷脂包括DSPC和DOPC。
5、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中双分子层包括0.1至1.0mol％的卟啉-磷脂、35至45％的胆固醇，其余的由磷脂组成。
6、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡组合物选自由以下组成的组：
i)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：53:5:40:2；
ii)DSPC:DOPC:胆固醇:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：54.7:5:40:0.3；
iii)胆固醇:DSPC:DOPC:PEG-脂质:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：50:32:11:5:2；和
iv)DSPC:PEG-脂质:胆固醇:PoP(例如pyro-磷脂缀合物)：：60:％:35:2。
7、在另一示例中，组合物是上述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡存在于载体(例如生理缓冲液或含血清的溶液)中。
8、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中磷脂包括DSPC和DOPC，其中DOPC以0.1至5mol％存在。
9、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡包括0.1至5mol％的pyro-磷脂、35至45mol％的胆固醇、DSPC和DOPC，其中DSPC和DOPC一起为59至61mol％，并且其中DOPC为0.1至5mol％。
10、在另一示例中，组合物是前述任何一附加项的组合物，其中货物分子(例如，单一类型的货物，单一类型的货物的混合物，或两种或更多种不同类型的货物的混合物)存在于纳米囊泡中。
11、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中货物是阿霉素、伊立替康、柔红霉素或其组合。
12、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡包括治疗剂和成像剂，并且治疗剂和成像剂是彼此分开的不同的分子。
13、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中货物存在于纳米泡囊的内部水性隔室中。
14、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中磷脂与货物药物的比例为10:1至5:1。
15、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡具有至少两种类型，其中每种类型的纳米囊泡含有不同的卟啉-脂质，并且每种不同的卟啉-脂质具有不同的最大吸收值。
16、在另一示例中，组合物是前述任一附加项的组合物，其中纳米囊泡具有两种类型，其中一种类型中的卟啉-磷脂是pyro-磷脂，而第二种类型中的卟啉-磷脂是红紫素-磷脂。
17、在一个示例中，将货物递送到所需位置的方法包括以下步骤：a)向个体施用前述任一附加项所述的组合物以使其进入循环系统；b)使纳米泡囊到达所需位置；和c)将纳米泡囊暴露于波长为650至1000nm的近红外照射以使得货物从纳米泡囊中释放出来。
18、在另一示例中，方法是附加项17的方法，其中纳米囊泡包括成像剂，并且所述方法还包括在施用后和暴露纳米囊泡之前对个体进行成像，和确定纳米囊泡已经到达所需位置。
19、在另一示例中，方法是附加项17或18中任一项的方法，其中个体是人或非人哺乳动物。
20、在另一示例中，方法是附加项17至19中任一项的方法，其中使纳米囊泡暴露于658、665、671或695nm的波长。
21、在另一示例中，方法是附加项17至20中任一项的方法，其中使纳米囊泡暴露于近红外照射长达30分钟。
22、在另一示例中，方法是附加项17至21中任一项的方法，其中c)进行的是多次暴露于近红外照射。
23、在一个示例中，货物的控制释放的方法包括：a)提供包括在载体中的纳米囊泡的组合物，其中纳米囊泡的双分子层包括0.1至5mol％的卟啉磷脂、30至50％的固醇、45至61.5mol％的未与卟啉缀合的磷脂，以及任选地1至6％的聚乙二醇-脂质，其中在室温至37℃的温度下(例如，在生理缓冲液或基于血清的培养基中)，不存在可检测的货物的释放；b)将组合物暴露于来自具有10至350mW/cm
24、在另一示例中，方法是附加项23的方法，其中未与卟啉缀合的磷脂是DSPC和DOPC，并且其中DOPC以0.1-5mol％存在。
25、在另一示例中，方法是附加项23的方法，其中pyro-磷脂以0.1至1.0mol％存在，并且其中至少50％的货物在1分钟内释放出来。
26、在一个示例中，多个货物的顺序释放方法包括：a)向个体施用至少第一类型的纳米囊泡和第二类型的纳米囊泡，其中第一纳米囊泡和第二纳米囊泡的双分子层各自包括0.1至5mol％的卟啉磷脂、30-50％的固醇、45-61.5mol％的未与卟啉缀合的磷脂、以及任选地1至6％的聚乙二醇-脂质，其中第一类型的纳米囊泡和第二类型的纳米囊泡含有具有不同最大吸收值的不同的卟啉磷脂，和b)将组合物顺序暴露于至少两种不同波长的光，其中第一波长对应于第一类型纳米囊泡的卟啉-磷脂的最大吸收值，并且第二波长对应于第二类型纳米囊泡的最大吸收值，从而使得第一类型的纳米泡囊中和第二类型的纳米囊泡中的货物顺序释放出来。
27、在另一示例中，方法是附加项26的方法，其中至少两种类型的纳米囊泡存在于相同的组合物中。
28、在另一示例中，方法是附加项26或27中任一项的方法，其中个体是人或非人哺乳动物。
29、在另一示例中，方法是附加项26至28中任一项的方法，其中使纳米囊泡暴露于658、665、671、695nm或其组合的波长。
30、在另一示例中，方法是附加项26至29中任一项的方法，其中对于各个单独的暴露，使纳米囊泡依次暴露于近红外照射长达30分钟。
提供以下示例以说明本公开。它们并不意图以任何方式进行限制。
示例1
本示例描述了PoP-脂质体的制备以及货物的装载和释放。
材料和方法。PoP脂质体的制备。除非另有说明，脂质是从Avanti获得的，而其它材料是从Sigma获得的。如前所述合成HPPH-脂质和Pyro-磷脂。各种脂质体制剂均是使用相同的方法制备的。最终获得的隐形PoP脂质体制剂包括53mol％1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC，Avanti#850365P)、40mol％胆固醇(Avanti#700000P)、2mol％Pyro-磷脂和5mol％1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG-2K，Avanti#880120P)。为了产生100mg PoP脂质体(5mL的批次)，将57.1mg DSPC、19.1mgDSPE-PEG-2K、2.76mg Pyro-磷脂和21.1mg胆固醇在60-70℃下完全溶解在1mL乙醇中，然后将4mL 250mM硫酸铵(pH 5.5)缓冲液注射到混合脂质中(注射时将混合脂质和硫酸铵缓冲液二者均保持在60-70℃)。将脂质和缓冲液充分混合。利用高压氮气挤出机(NorthernLipids)使溶液在60-70℃下通过依次堆叠的孔径分别为0.2、0.1和0.08μm的聚碳酸酯膜10次。通过在800mL含有10mM组氨酸(pH 6.5)的10％蔗糖溶液中透析来去除游离的硫酸铵，其中更换至少2次缓冲液。
PoP脂质体的货物装载和释放。通过加入指定比例的药物并在60℃下孵育1小时来装载阿霉素(Dox；L
血清稳定组合物和用于光触发的材料释放的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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