专利摘要

一种土壤修复用固体复合微生物微球及其制备方法，本发明提供了一种土壤修复用固体复合微生物微球及其制备方法，该方法以海藻酸钙为包埋材料，固体碳酸钙为固体致孔剂，包埋具有石油烃降解能力的真菌、细菌菌种及营养物质，制备固体复合微生物微球的方法。包括悬浊液制备、微球成型和去除致孔剂等制备步骤。该方法在保持固体载体优点的同时，不仅具备可强化传质的超大孔，而且包埋了真菌、细菌生长所必须的营养物质，呈现出高传质、保护性、营养型、施用方便、活性及稳定性高、不需多次补加等优点。这种固体复合微生物微球在石油污染土壤的生物修复过程中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种土壤修复用固体复合微生物微球，其特征在于：所述复合微生物微球以海藻酸钙为包埋材料，固体碳酸钙为固体致孔剂，包埋具有石油烃降解能力的细菌和真菌菌种、营养物质；该复合微生物微球呈蜂窝状，内部蜂窝孔孔径为10～100μm，其微球直径为0.5～3mm。

2.按照权利要求1所述的土壤修复用固体复合微生物微球，其特征在于：所述的具有石油烃降解能力的真菌为刺孢小克银汉菌或黄孢原毛平革菌中的一种或两种。

3.按照权利要求1或2所述的土壤修复用固体复合微生物微球，其特征在于：所述的具有石油烃降解能力的细菌为假单胞菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、微球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或芽孢杆菌属中的一种或几种。

4.一种制备如权利要求1所述的土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于该方法以海藻酸钙为包埋材料，固体碳酸钙为致孔剂，包埋可降解石油烃类物质的细菌、真菌菌种及营养物质，其具体步骤如下：

1)平面培养：采用微生物学方法制备马铃薯平面培养基和LB培养基，将真菌和细菌分别接种到准备好的马铃薯平面培养基和LB培养皿中，在25℃～30℃培养2～5天，保存备用；

2)摇瓶培养：按微生物学方法制备马铃薯平面培养基液体培养基和LB液体培养基，湿热灭菌，冷却至室温后分别接种真菌和细菌，在130～170rpm，25℃～30℃下培养1～5天，收集菌液后将真菌培养物与细菌培养物按1∶0.1～10的比例混合备用；

3)配制海藻酸钠-葡萄糖-无机盐溶液，其中海藻酸钠浓度为0.5％～3％，葡萄糖浓度为1％～4％，KH₂PO₄浓度为0.1％～0.2％，NH₄NO₃浓度为0.1％～0.2％，MgSO₄浓度为0.05％～0.15％；

4)将500～1000目碳酸钙微粒均匀分散于步骤3)所述溶液中，固体碳酸钙浓度为2～10％；在溶液中加入步骤2)中得到的液体菌液，菌液与溶液体积比为1～5∶5，搅拌制成分散均匀的悬浊液；

5)用滴管吸取悬浊液，滴加入浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后形成固体球形颗粒沉淀；

6)收集球形颗粒，放入不含海藻酸钠的葡萄糖-无机盐溶液中，葡萄糖与无机盐组成与步骤3)中的溶液相同；缓慢滴加0.1M HCl溶液，待无明显的气泡生成，收集除去碳酸钙固体微粒的球形颗粒，即制备成固体复合微生物微球。

5.如权利要求4所述的土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于：所述的具有石油烃降解能力的真菌为刺孢小克银汉菌或黄孢原毛平革菌中的一种或两种。

6.如权利要求4所述的土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于：所述的具有石油烃降解能力的细菌为假单胞菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、微球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或芽孢杆菌属中的一种或几种。

7.如权利要求4所述的土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于：所述的海藻酸钠-葡萄糖-无机盐溶液组成为海藻酸钠浓度为1％～3％，葡萄糖浓度为1％～3％，KH₂PO₄浓度为0.1％～0.15％，NH₄NO₃浓度为0.1％～0.15％，MgSO₄浓度为0.05％～0.10％。

8.如权利要求1所述的土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于：所述的固体碳酸钙粒径为500～800目。

9.如权利要求1所述的土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述的固体碳酸钙中浓度为2％～8％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤修复用固体复合微生物微球及其制备方法，属于石油污染土壤生物修复的微生物制剂制备技术。

背景技术

环境生物修复技术主要由三方面的内容组成：(1)利用土著微生物代谢能力的技术(Natural Attenuation)；(2)活化土著微生物分解能力的方法(Biostimulation，简称生物活化法)；(3)添加具有高速分解难降解化合物能力的特定微生物(群)的方法(Bioaugmentation，简称生物添加法)。对于石油污染土壤的生物修复过程，由于石油污染物具有组成复杂性、生物难降解性和具有较低的生物可利用度等特点，土著微生物难以有效的、快速的、彻底的降解土壤中的石油烃。生物添加法可通过添加具有高效降解石油烃能力的微生物制剂提高生物修复的效率，有效的去除石油烃污染物。目前在美国、欧洲等地开发出的市售微生物制剂，如BET BIOPETRO，MICRO-BLAZE，OPPENHEIMER FORMULA，STEP ONE等，主要以菌液和干粉为主。这类制剂在使用过程中具有不利于保存和运输，受土壤生态系统影响而导致活性诱导期长，在与土著微生物相互作用过程中活性易丧失等缺点，因而需要大量施用和多次补加，造成修复效率大大低于实验室研究水平，治理成本也高居不下。开发活性高、耐环境冲击能力强的微生物制剂是解决这一问题的关键。

细胞固定化(immobilization)技术是20世纪70年代从固定化酶发展起来的。它是一种用化学或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间领域，并使其保持活性，反复利用的方法。细胞固定化技术有利于提高生物反应器内的微生物细胞浓度和纯度、保持高效菌种、微生物流失少、耐受环境冲击强、操作稳定性好、利于除氮和除去高浓度有机物或某些难降解物质。细胞固定化技术作为一项高效低耗、操作管理容易的技术已引起人们高度的重视。细胞固定化技术在环境治理方面已取得一定的进展。1997年Pometto等人公布了利用聚乙烯或聚丙烯等合成高分子材料与植物材料制备微生物细胞固定化载体的专利，得到的载体可用于生物膜反应器处理废气和废水(US 5595893)。但这种载体为有机高分子合成载体，其生物相容性和生物可降解性较差，废弃后易对环境产生二次污染。王新、李培军等人在《环境科学》第23卷中报道了采用聚乙烯醇和硼酸复合载体包埋动胶杆菌降解土壤中菲、芘污染物的方法，结果表明，固定化微生物在含有土著菌的自然土壤中，对污染物的降解占有绝对优势。另一方面，在细胞固定化应用过程中，由于包埋材料在一定程度阻碍底物和氧扩散，对大分子底物尤其不适用。因此，在利用凝胶等材料保护内部微生物的同时，也势必对物质的传递造成阻碍，如何解决好二者之间的关系是制备高效生物制剂过程中所必须解决的问题。

发明内容

针对现有微生物制剂制备技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种土壤修复用固体复合微生物微球及其制备方法。该固体复合微生物微球具有高效传质、保护性、营养型、施用方便、活性及稳定性高、不需多次补加等优点。制备方法以海藻酸钙为包埋材料，固体碳酸钙为固体致孔剂，包埋可降解石油烃类物质的细菌、真菌菌种及营养物质，经过悬浊液制备、微球成型和去除致孔剂的制备步骤，得到固体复合微生物微球。

本发明可通过下述方案加以实现：

一种土壤修复用固体复合微生物微球，其特征在于：所述复合微生物微球以海藻酸钙为包埋材料，固体碳酸钙为固体致孔剂，包埋具有石油烃降解能力的细菌和真菌菌种、营养物质；该复合微生物微球呈蜂窝状，内部蜂窝孔孔径为10～100μm，其微球直径为0.5～3mm。

本发明提供了一种制备土壤修复用固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于该方法以海藻酸钙为包埋材料，固体碳酸钙为致孔剂，包埋可降解石油烃类物质的细菌、真菌菌种及营养物质，其具体步骤如下：

1)平面培养：采用微生物学方法制备马铃薯平面培养基(PDA)和LB培养基，将真菌和细菌分别接种到准备好的PDA和LB培养皿中，在25℃～30℃培养2～5天，保存备用；

2)摇瓶培养：按微生物学方法制备PDA液体培养基和LB液体培养基。分装到容积为300～500ml的三角瓶中，每瓶培养基量为100～200ml，在121℃下高温灭菌15分钟，冷却至室温，然后在无菌工作台中分别接种真菌和细菌，将平面培养基培养好的菌体转移到摇瓶中，将摇瓶置于空气摇床中，调节摇床转速130～170rpm，25℃～30℃下培养1～5天，收集菌液后将真菌培养物与细菌培养物按1∶0.1～10的比例混合备用；

3)配制海藻酸钠—葡萄糖—无机盐溶液，其中海藻酸钠浓度为0.5％～3％，葡萄糖浓度为1％～4％，KH₂PO₄浓度为0.1％～0.2％，NH₄NO₃浓度为0.1％～0.2％，MgSO₄浓度为0.05％～0.15％；

4)在常温下，将500～1000目碳酸钙微粒均匀分散于步骤3)所述溶液中，碳酸钙浓度为2～10％；在溶液中加入步骤2)中得到的液体菌液，菌液与溶液体积比为1～5∶5，搅拌制成分散均匀的悬浊液；

5)用滴管吸取悬浊液，滴加入浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后形成固体球形颗粒沉淀；

6)收集球形颗粒，放入不含海藻酸钠的葡萄糖—无机盐溶液中，葡萄糖与无机盐组成与3)相同。缓慢滴加0.1M HCl溶液，待无明显的气泡生成，收集除去碳酸钙固体微粒的球形颗粒，即制备成固体复合微生物微球；

采用的具有石油烃降解能力的真菌为刺孢小克银汉菌或黄孢原毛平革菌中的一种或两种。

采用的具有石油烃降解能力的细菌为假单胞菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、微球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或芽孢杆菌属中的一种或几种。

所述的海藻酸钠—葡萄糖—无机盐溶液组成可优化为海藻酸钠浓度为1％～3％，葡萄糖浓度为1％～3％，KH₂PO₄浓度为0.1％～0.15％，NH₄NO₃浓度为0.1％～0.15％，MgSO₄浓度为0.05％～0.10％。所述的固体碳酸钙粒径可优化为500～800目。所述的固体碳酸钙中浓度可优化为2％～8％。

上述内容描述了本发明所述的固体复合微生物微球及其制备方法。本发明制备的超大孔固体复合微生物微球与现有的微生物制剂相比，其明显的优点是，将制备超大孔技术和细胞固定化技术有机地结合，将二者的优势整合，即具有保护性又有高传质性。在保证菌体密度高，微生物活性保持时间长，耐环境冲击能力强的同时，超大孔的存在强化了传质，有利于微生物的快速生长；包埋过程中加入细菌真菌生长所需的营养物质，使制剂在投放到污染土壤环境后能够首先通过制剂内繁殖迅速提高微生物数量和活性，在与土著微生物的相互作用中占据优势地位；超大孔固体微生物制剂在污染土壤中见效快，保持作用时间长，避免了多次补加造成的成本提高。此外，制剂制备过程简单经济，所使用的包埋材料为天然材料，成本低廉、生物相容性及生物可降解性好，具有环境友好性。本发明在石油污染土壤的生物修复过程中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为光学显微镜下本发明制备的超大孔固体微生物微球的照片(碳酸钙已除，放大倍数为40倍)。

图2描述了本发明的超大孔固体微生物微球与未致孔的海藻酸钙微生物微球在25℃～30℃下经过48小时培养后的脱氢酶活性，其中1对应超大孔固体微生物微球中微生物的脱氢酶活性，2对应未致孔的海藻酸钙微生物微球中微生物的脱氢酶活性。

具体实施方式

本发明所述的具有石油烃降解能力的真菌和细菌可通过从石油污染的土壤中进行筛选或者从各国菌种保藏中心购买已知的石油烃降解菌株的方式得到。

下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明，但不限制本发明。

实施例1

1)平面培养：采用刺孢小克银汉菌和假单胞菌作为包埋的真菌和细菌。采用微生物学方法制备马铃薯平面培养基(PDA)和LB培养基，将刺孢小克银汉菌接种到准备好的PDA平面培养基上，在28℃培养4天，保存备用；将假单胞菌接种到准备好的LB平面培养基上，在30℃培养2天，保存备用；

2)摇瓶培养：按微生物学方法制备PDA液体培养基100ml和LB液体培养基100ml，分别装到容积为300ml的三角瓶中，在121℃下高温灭菌15分钟，冷却至室温，然后在无菌工作台中分别接种刺孢小克银汉菌和假单胞菌，将摇瓶置于空气摇床中，真菌培养条件为28℃，160rpm，培养4天；细菌培养条件为30℃，160rpm培养1天；收集菌液，以细菌和真菌菌液体积比为10∶1混合备用。

3)配制海藻酸钠—葡萄糖—无机盐溶液，其中海藻酸钠浓度为1％，葡萄糖浓度为1％，KH₂PO₄浓度为0.1％，NH₄NO₃浓度为0.10％，MgSO₄浓度为0.05％。

4)在常温下，将500目碳酸钙微粒均匀分散于步骤3)所述溶液中，碳酸钙浓度为8％；在溶液中加入步骤2)中得到的混合菌液，菌液与溶液体积比为1∶5，充分搅拌制成分散均匀的悬浮液。

5)用滴管吸取悬浮液，滴加入浓度为1％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后立即形成固体球形颗粒沉淀。

6)收集球形颗粒，放入不含海藻酸钠的葡萄糖—无机盐溶液中，葡萄糖与无机盐组成与3)相同。缓慢滴加0.1M HCl溶液，待无明显的气泡生成，收集除去碳酸钙固体微粒的球形颗粒，即制成固体复合微生物微球(如图1所示)。得到的复合微生物微球呈蜂窝状，内部蜂窝孔孔径为50～100μm，其微球直径为1.5～3mm。

实施例2

实施例2与实施例1不同之处在于：

1)平面培养：采用刺孢小克银汉菌、黄孢原毛平革菌和红球菌作为包埋的真菌和细菌。采用微生物学方法制备马铃薯平面培养基(PDA)和LB培养基，将真菌接种到准备好的PDA平面培养基上，在25℃培养5天，保存备用；将细菌接种到准备好的LB平面培养基上，在30℃培养2天，保存备用。

2)摇瓶培养：按微生物学方法制备PDA液体培养基200ml和LB液体培养基100ml，分别装到容积为300ml的三角瓶中，在121℃下高温灭菌15分钟，冷却至室温，然后在无菌工作台中分别接种刺孢小克银汉菌、黄孢原毛平革菌和红球菌，将摇瓶置于空气摇床中，真菌培养条件为25℃，160rpm，培养5天；细菌培养条件为30℃，160rpm培养1天；收集菌液后制备悬浊液。

3)配制海藻酸钠—葡萄糖—无机盐溶液，其中海藻酸钠浓度为3.0％，葡萄糖浓度为3％，KH₂PO₄浓度为0.15％，NH₄NO₃浓度为0.15％，MgSO₄浓度为0.10％。

4)在常温下，将800目碳酸钙微粒均匀分散于步骤3)所述溶液中，碳酸钙浓度为2％；在溶液中加入刺孢小克银汉菌∶黄孢原毛平革菌∶红球菌为5∶5∶1的混合液体菌液，菌液与溶液体积比为1∶1，充分搅拌制成分散均匀的悬浮液。

5)用滴管吸取悬浮液，滴加入浓度为3％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后立即形成固体球形颗粒沉淀。

6)收集球形颗粒，放入不含海藻酸钠的葡萄糖—无机盐溶液中，葡萄糖与无机盐组成与3)相同。缓慢滴加0.1M HCl溶液，待无明显的气泡生成，收集除去碳酸钙固体微粒的球形颗粒，即制备成固体复合微生物微球。得到的复合微生物微球呈蜂窝状，内部蜂窝孔孔径为50～100μm，其微球直径为1.5～3mm。

7)按照前五个步骤所述，不加入固体碳酸钙微粒，制备成无孔的固体复合微生物微球。

8)将步骤6)与步骤7)中得到的微生物微球置于28℃下培养48小时后，观察真菌生长情况。分别取6颗制剂放入试管中，加入pH为8.5的0.05M Tris-HCl缓冲溶液、0.1mol/L葡萄糖溶液、0.5％(w/w)TTC(氯化三苯基四氮唑)各2ml，置于30℃下显色12小时。每个试管加入1滴浓硫酸中止反应。弃去溶液相，分别加入5ml丙酮，充分振荡。待脱氢酶催化TTC反应生成的红色沉淀完全萃取到有机相时，测量有机相在485nm下的吸光度，吸光度越高表明微生物的脱氢酶活性越高(如图2所示)。从图4可以看出，经过致孔的超大孔固体复合微生物微球，其微生物活性高出未致孔的固体复合微生物微球近60倍。

一种土壤修复用固体复合微生物微球及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。