专利摘要

本发明公开了一种基于偶氮苯‑量子点的荧光探针及制备方法以及其在分子开关型荧光传感器中的应用。该荧光探针的制备方法包括如下步骤：(A)将量子点溶于CHCl3溶液中，然后加入乙二胺溶液混合均匀，得到混合溶液II；(B)将偶氮苯化合物与3‑巯基丙酸加入到H2O/DMSO溶液中混合均匀，得到混合溶液III；(C)将混合溶液II和III混合后进行反应，获得所述的荧光探针。基于该荧光探针与连二亚硫酸离子引起的还原反应、与次氯酸离子引起的氧化反应以及与偶氮还原酶引起的酶促反应，开发了分子开关型荧光传感器，能够灵敏准确地检测连二亚硫酸离子、次氯酸离子和偶氮还原酶，可用于检测多种化学生物分析物。

权利要求

1.一种基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)将量子点溶于CHCl3溶液中，然后加入乙二胺溶液，搅拌混合均匀，得到混合溶液II；

(B)将偶氮苯化合物与3-巯基丙酸加入到H2O/DMSO溶液中，搅拌混合均匀，得到混合溶液III；其中，偶氮苯化合物为双[4,4'-(二硫代苯基偶氮)-1,3-苯二胺]；

(C)将混合溶液III加入到混合溶液II中，剧烈震荡反应，待反应结束后收集上层水溶液，并加入丙酮沉淀离心，得到基于偶氮苯-量子点的荧光探针；

步骤(A)中所述的量子点为CdSe/ZnS量子点。

2.根据权利要求1所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(B)中所述的双[4,4'-(二硫代苯基偶氮)-1,3-苯二胺]通过如下方法制备得到：

(1)将4,4'-二硫代二苄胺加入到盐酸溶液中，冰浴冷却后，逐滴加入亚硝酸钠水溶液，在冰浴条件下搅拌反应，得到4,4'-二硫代二苯基重氮；

(2)将间苯二胺溶解于氢氧化钠溶液中，冰水冷却，得到混合溶液I；

(3)将4,4'-二硫代二苯基重氮加入到混合溶液I中，并调节pH值至9～11，冰浴和/或常温条件下搅拌反应，收集沉淀物，水洗，干燥，得到所述的偶氮苯化合物。

3.根据权利要求2所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的4,4'-二硫代二苄胺、盐酸和亚硝酸钠的摩尔比为1～5:5～15:0.01～0.05；

步骤(1)中所述的盐酸溶液的浓度为0.1～1mol/L；

步骤(1)中所述的亚硝酸钠水溶液的浓度为1～10mol/L；

步骤(1)中所述的搅拌反应的时间为10～45分钟；

步骤(2)中所述的间苯二胺与氢氧化钠的摩尔比为2～15：2～20；

步骤(2)中所述的间苯二胺与所述4,4'-二硫代二苄胺的摩尔比为6:2.3；

步骤(2)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1mol/L；

步骤(3)中所述的调节pH值为采用NaOH溶液进行调节；

步骤(3)中所述的搅拌反应为通过如下方式实现：先在冰浴条件下搅拌10～45分钟，然后室温下搅拌5～2小时；

步骤(3)中所述的水洗为用水洗涤3次以上；

步骤(3)中所述的干燥为真空干燥。

4.根据权利要求1所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法，其特征在于：

步骤(A)中所述的量子点与乙二胺的摩尔比为1:100；

步骤(A)中所述的乙二胺溶液的浓度为0.005～0.2mol/L；

步骤(B)中所述的偶氮苯化合物与所述量子点的摩尔比为200～1000：1；

步骤(B)中所述的3-巯基丙酸与偶氮苯化合物的摩尔比为7:3～9:1；

步骤(B)中所述的H2O/DMSO溶液中H2O和DMSO的体积比为80：20；

步骤(B)中所述的3-巯基丙酸的用量为按每升H2O/DMSO溶液配比0.02～0.05mol 3-巯基丙酸计算。

5.根据权利要求1所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法，其特征在于：

步骤(A)中所述的搅拌的时间为10～45分钟；

步骤(B)中所述的搅拌的时间为10～45分钟；

步骤(C)中所述的反应的时间为0.5～2小时。

6.一种基于偶氮苯-量子点的荧光探针，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。

7.权利要求6所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针在制备开关型荧光传感器中的应用。

8.一种开关型荧光传感器，其特征在于，通过如下方法制备得到：

(a)将权利要求6所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针溶于PBS缓冲液中，得到荧光探针溶液；

(b)将生化分析物水溶液与荧光探针溶液混合后进行孵育，得到开关型荧光传感器；其中，生化分析物为连二亚硫酸离子、次氯酸离子或偶氮还原酶；

步骤(a)中所述的PBS缓冲液的浓度为10～100mmol/L；

步骤(b)中所述的连二亚硫酸离子的浓度为0.01～1μmol/L；

步骤(b)中所述的次氯酸离子的浓度为0.05～0.5μmol/L；

步骤(b)中所述的偶氮还原酶的浓度为0.02～2μg/mL；

步骤(b)中所述的连二亚硫酸离子与所述荧光探针的摩尔比为10～1000：1；

步骤(b)中所述的次氯酸离子与所述荧光探针的摩尔比为50～500：1；

步骤(b)中所述的偶氮还原酶与所述荧光探针的摩尔比为10～200：1。

9.权利要求6所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针和/或权利要求8所述的开关型荧光传感器在化学化工，食品安全，环境检测以及非疾病诊断目的的生物医学领域中的应用。

10.一种利用权利要求8所述的开关型荧光传感器检测生化分析物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(i)将至少3个浓度的生化分析物水溶液分别与权利要求6所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针溶液混合后孵育，然后测量FL光谱，得到荧光光谱强度；其中，生化分析物为连二亚硫酸离子、次氯酸离子或偶氮还原酶；

(ii)根据步骤(i)得到的荧光光谱强度与生化分析物的浓度，制作工作曲线，得到线性方程；

(iii)将待测样品与偶氮苯-量子点的荧光探针混合后孵育，然后测量FL光谱，获得荧光光谱强度，再根据步骤(ii)得到的线性方程，获得待测样品的含量；

其中，步骤(i)和(iii)中所述的偶氮苯-量子点的荧光探针溶液与连二亚硫酸离子孵育的时间为5分钟以上；偶氮苯-量子点的荧光探针溶液与次氯酸离子孵育的时间为8分钟以上；偶氮苯-量子点的荧光探针溶液与偶氮还原酶孵育的时间为15分钟以上；

步骤(i)中所述的连二亚硫酸离子的浓度为1～80nmol/L；

步骤(i)中所述的次氯酸离子的浓度为4～150nmol/L；

步骤(i)中所述的偶氮还原酶的浓度为0.02～1.2μg/mL。

说明书

技术领域

本发明属于化学分子合成、荧光探针设计和生物化学检测领域，特别涉及一种基于偶氮苯-量子点的荧光探针及制备方法以及其在分子开关型荧光传感器中的应用。

背景技术

荧光传感是一种灵敏、快速且可靠的分析手段，根据分子间相互作用的化学信息转变为对荧光信号的影响(如荧光增强或者猝灭、荧光特征峰位置的移动、荧光寿命的变更和荧光偏振的改变等)，对物质进行定性或定量分析。因其具有灵敏度高、检测限低、操作简便、设备低廉等特点而成为近期化学和生物分析领域的研究热点。

荧光传感中执行这种转变过程的物质被称为荧光传感探针，其可以是分子，也可以是聚集体、配位聚合物、纳米粒子等。半导体量子点(semiconductor quantum dots，QDs)由于具有发光波长可调，荧光量子产率高，不易光漂白和化学稳定性好等优点，是新兴的一类优良荧光传感探针，在纳米电子学、光学，和生命科学等方面有着重要的应用前景，其制备和应用受到人们广泛重视。QDs作为荧光探针，其荧光量子产率(荧光强度)受缺电子性或富电子性较强化合物作用时产生光致电子转移(photo-induced electron transfer，PET)的影响。光诱导电子转移(PET)是一种重要的光物理过程，基于荧光发射强度对PET过程的依赖性以及对PET过程的调控，可以设计制备一系列对分析物具有不同响应行为的开关型荧光传感器。例如，在设计时根据荧光基团的电性，选择与之电性相反的化合物作用以促进PET发生。在QDs表面上修饰上缺电子性基团，发生PET从而引起荧光强度的淬灭，利用分析物作用去除QDs表面上的荧光淬灭基团，切断PET发生途径能够使得QDs的荧光恢复，通过荧光“关-开”(off-on)的变化反应分析物。依据以有荧光(开)还是以无荧光(关)方式显示被检测物质的存在,可将开关型荧光传感器分为“关-开”(off-on)型和“开-关”(on-off)型两大类。相比于一般的荧光传感器，开关型荧光传感器具有响应快速、使用方便等特点，近年来其已经成为光学传感器研究的一个热门领域。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的基于偶氮苯-量子点的荧光探针。

本发明的又一目的在于提供所述基于偶氮苯-量子点的荧光探针在分子开关型荧光传感器中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用所述的开关型荧光传感器检测生化分析物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于偶氮苯-量子点的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(A)将量子点溶于CHCl₃溶液中，然后加入乙二胺(EDA)溶液，搅拌混合均匀，得到混合溶液II；

(B)将偶氮苯化合物与3-巯基丙酸(MPA)加入到H₂O/DMSO溶液中，搅拌混合均匀，得到混合溶液III；其中，偶氮苯化合物为双[4,4'-(二硫代苯基偶氮)-1,3-苯二胺](Bis[4,4’-(dithiophenyl azo)-1,3-benzenediamine，DTPABDA]；

(C)将混合溶液III加入到混合溶液II中，剧烈震荡反应，待反应结束后收集上层水溶液，并加入丙酮沉淀离心，得到DTPABDA修饰的量子点，即所述基于偶氮苯-量子点的荧光探针。

步骤(A)中所述的量子点为CdSe/ZnS量子点(CdSe/ZnS分别为核/壳)；优选为纯化后的CdSe/ZnS量子点；更优选为采用丙酮(量子点水溶液中加入大量丙酮)纯化后的CdSe/ZnS量子点。

步骤(A)中所述的量子点与乙二胺的摩尔比优选为1:100。

步骤(A)中所述的乙二胺溶液的浓度为0.005～0.2mol/L；优选为0.01mol/L。

步骤(A)中所述的搅拌的时间为10～45分钟；优选为30分钟。

步骤(B)中所述的偶氮苯化合物的结构式如式I所示：

步骤(B)中所述的双[4,4'-(二硫代苯基偶氮)-1,3-苯二胺](Bis[4,4’-(dithiophenyl azo)-1,3-benzenediamine，DTPABDA]优选为通过如下方法制备得到：

(1)将4,4'-二硫代二苄胺(4,4’-dithiodibenzylamine，DTDBA)加入到盐酸溶液中，冰浴冷却后，逐滴加入亚硝酸钠水溶液，在冰浴条件下搅拌反应，得到4,4'-二硫代二苯基重氮；

(2)将间苯二胺溶解于氢氧化钠溶液中，冰水冷却，得到混合溶液I；

(3)将4,4'-二硫代二苯基重氮加入到混合溶液I中，并调节pH值至9～11，冰浴和/或常温条件下搅拌反应，收集沉淀物，水洗，干燥，得到所述的偶氮苯化合物(DTPABDA)。

步骤(1)中所述的4,4'-二硫代二苄胺、盐酸(盐酸溶液中盐酸)和亚硝酸钠(亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠)的摩尔比为1～5:5～15:0.01～0.05；优选为2.3:10:0.01。

步骤(1)中所述的盐酸溶液的浓度为0.1～1mol/L；优选为0.5mol/L。

步骤(1)中所述的亚硝酸钠水溶液的浓度为1～10mol/L；优选为5mol/L。

步骤(1)中所述的搅拌反应的时间为10～45分钟；优选为30分钟。

步骤(2)中所述的间苯二胺与氢氧化钠的摩尔比为2～15：2～20；优选为3:5。

步骤(2)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1mol/L；优选为1mol/L。

步骤(2)中所述的间苯二胺与所述4,4'-二硫代二苄胺的摩尔比为6:2.3。

步骤(3)中所述的pH值优选为10。

步骤(3)中所述的调节pH值为采用NaOH溶液进行调节；优选为采用1mol/L NaOH溶液进行调节。

步骤(3)中所述的搅拌反应为通过如下方式实现：先在冰浴条件下搅拌10～45分钟(优选为30分钟)，然后室温下搅拌5～2小时(优选为1小时)。

步骤(3)中所述的水洗为用水洗涤3次以上。

步骤(3)中所述的干燥优选为真空干燥。

步骤(B)中所述的偶氮苯化合物与所述量子点的摩尔比为200～1000：1。

步骤(B)中所述的H₂O/DMSO溶液中H₂O和DMSO的体积比为80：20。

步骤(B)中所述的3-巯基丙酸的用量为按每升H₂O/DMSO溶液配比0.02～0.05mol 3-巯基丙酸计算。

步骤(B)中所述的搅拌的时间为10～45分钟；优选为30分钟。

步骤(B)中所述的3-巯基丙酸与偶氮苯化合物的摩尔比为7:3～9:1。

步骤(C)中所述的反应的时间为0.5～2小时；优选为1小时。

一种基于偶氮苯-量子点的荧光探针，通过上述任一项所述的方法制备得到。

所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针在制备开关型荧光传感器中的应用。

一种开关型荧光传感器，通过如下方法制备得到：

(a)将上述基于偶氮苯-量子点的荧光探针溶于PBS缓冲液中，得到荧光探针溶液；

(b)将生化分析物水溶液与荧光探针溶液混合后进行孵育，得到开关型荧光传感器；其中，生化分析物为连二亚硫酸离子(S₂O₄^2-)、次氯酸离子(ClO^-)或偶氮还原酶。

步骤(a)中所述的PBS缓冲液的浓度为10～100mmol/L；优选为50mmol/L。

步骤(b)中所述的生化分析物水溶液为含有连二亚硫酸离子(S₂O₄^2-)、次氯酸离子(ClO^-)或偶氮还原酶的水溶液，如连二亚硫酸钠水溶液，连二亚硫酸钾水溶液，连二亚硫酸锌水溶液，连二亚硫酸锰水溶液，连二亚硫酸钙水溶液，次氯酸钠水溶液、氯酸钾水溶液，次氯酸钙水溶液，次氯酸锂水溶液，次氯酸锌水溶液，偶氮还原酶水溶液等。

所述的偶氮还原酶水溶液优选为含有NADH的偶氮还原酶水溶液；所述的含有NADH的偶氮还原酶水溶液中NADH的浓度为0.01～1μmol/L(优选为0.1μmol/L)；偶氮还原酶的浓度为0.02～2μg/mL(优选为0.02～1.2μg/mL)。

所述的NADH与所述荧光探针的摩尔比为1：100。

步骤(b)中所述的连二亚硫酸离子的浓度为0.01～1μmol/L；优选为0.1μmol/L。

步骤(b)中所述的次氯酸离子的浓度为0.05～0.5μmol/L；优选为0.15μmol/L。

步骤(b)中所述的偶氮还原酶的浓度为0.02～2μg/mL；优选为0.02～1.2μg/mL。

步骤(b)中所述的连二亚硫酸离子与所述荧光探针的摩尔比为10～1000：1；优选为100:1。

步骤(b)中所述的次氯酸离子与所述荧光探针的摩尔比为50～500：1；优选为150:1。

步骤(b)中所述的偶氮还原酶与所述荧光探针的摩尔比为10～200：1；优选为50:1。

所述的基于偶氮苯-量子点的荧光探针，和/或所述的开关型荧光传感器在化学化工，食品安全，环境检测以及生物医学(非疾病诊断领域)领域中的应用。

一种利用所述的开关型荧光传感器检测生化分析物的方法，包括如下步骤：

(i)将至少3个浓度的生化分析物水溶液分别与基于偶氮苯-量子点的荧光探针溶液混合后孵育，然后测量FL光谱，得到荧光光谱强度；其中，生化分析物为连二亚硫酸离子、次氯酸离子或偶氮还原酶；

(ii)根据步骤(i)得到的荧光光谱强度与生化分析物的浓度，制作工作曲线，得到线性方程；

(iii)将待测样品与偶氮苯-量子点的荧光探针混合后孵育，然后测量FL光谱，获得荧光光谱强度，再根据步骤(ii)得到的线性方程，获得待测样品的含量；

其中，步骤(i)和(iii)中所述的偶氮苯-量子点的荧光探针溶液与连二亚硫酸离子孵育的时间为5分钟以上；偶氮苯-量子点的荧光探针溶液与次氯酸离子孵育的时间为8分钟以上；偶氮苯-量子点的荧光探针溶液与偶氮还原酶孵育的时间为15分钟以上。

步骤(i)中所述的生化分析物水溶液为含有连二亚硫酸离子(S₂O₄^2-)、次氯酸离子(ClO^-)或偶氮还原酶的水溶液，如连二亚硫酸钠水溶液，连二亚硫酸钾水溶液，连二亚硫酸锌水溶液，连二亚硫酸锰水溶液，连二亚硫酸钙水溶液，次氯酸钠水溶液、氯酸钾水溶液，次氯酸钙水溶液，次氯酸锂水溶液，次氯酸锌水溶液，偶氮还原酶水溶液等。

所述的偶氮还原酶水溶液优选为含有NADH的偶氮还原酶的水溶液；所述的含有NADH的偶氮还原酶的水溶液中NADH的浓度为0.01～1μmol/L；偶氮还原酶的浓度为0.0.2～1.2μg/mL。

步骤(i)中所述的连二亚硫酸离子水溶液的浓度为1～80nmol/L。

步骤(i)中所述的次氯酸离子水溶液的浓度为4～150nmol/L。

步骤(i)中所述的偶氮还原酶的浓度为0.02～1.2μg/mL。

偶氮苯是由两个通过N＝N键连接的苯环组成的化学分子，被广泛用于染料和颜料、食品添加剂、比色指示剂和治疗剂。特别是由于其偶氮部分在紫外光照下发生可逆的顺式反式异构化，已被用于荧光传感探针中的有效荧光淬灭剂。本发明中制备了一种新型结构的偶氮苯化合物，基于此开发了一种偶氮苯-QDs复合荧光探针，可用于设计制备“关-开”(off-on)型荧光传感器。我们首先通过偶氮偶合反应合成了该偶氮苯化合物DTPABDA，其通过配体交换反应修饰于QDs表面；DTPABDA携带吸电子的偶氮苯基团，通过光诱导电子转移(PET)效应可淬灭QDs的荧光，使得QDs荧光“关”；当通过化学反应特异性移除修饰于量子点表面的吸电子偶氮苯基团，QDs的荧光强度能够有效恢复，实现QDs荧光“开”。为了验证该偶氮苯-QDs荧光探针的应用效果，我们通过一系列不同反应去除偶氮苯基团，包括1)连二亚硫酸离子的还原反应；2)次氯酸离子氧化反应；3)偶氮还原酶的酶促反应。通过监测上述反应中量子点荧光受偶氮苯淬灭荧光信号的恢复变化，证明偶氮苯-QDs荧光探针可用于开发检测连二亚硫酸离子，次氯酸离子和偶氮还原酶的开关型荧光传感器。与报道的使用有机染料作为探针的荧光传感器相比，该传感器表现出响应时间短、灵敏度高及检测限低的特点，可广泛应用于监测工业中的连二亚硫酸、生物医学诊断中活细胞内源性次氯酸及肿瘤内的低氧度。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明中，首先合成了含有偶氮苯的化合物—双[4,4'-(二硫代苯基偶氮-1,3-苯二胺](Bis[4,4’-(dithiophenyl azo)-1,3-benzenediamine]，DTPABDA)，通过配体交换反应可将其修饰于QDs表面。DTPABDA分子上的吸电子官能团即偶氮苯基团可通过光致电子转移效应(photo-induced electron transfer,PET)，使得QDs的荧光猝灭。我们发现并提出，通过三种不同类型反应，包括连二亚硫酸离子引起的还原反应、次氯酸离子引起的氧化反应和偶氮还原酶引起的酶促反应，可有效去除QDs表面的偶氮苯基团，从而恢复QDs的荧光。基于不同反应促使的QDs荧光强度恢复，我们开发新型分子开关型荧光传感器，能够灵敏准确地分别检测连二亚硫酸离子、次氯酸离子和偶氮还原酶，可用于检测多种化学生物分析物。

2、与现有的方法相比，本发明提出的分析传感方法展现出高灵敏度、宽线性范围和良好的选择性等优点，检出限分别达到连二亚硫酸离子0.5mmol/L，次氯酸离子0.2nmol/L，偶氮还原酶2ng/mL。这一传感新方法可广泛应用于监测工业中的连二亚硫酸、生物医学诊断中活细胞中的内源性次氯酸及肿瘤内的低氧度，在生物、化学化工、食品安全、环境检测及生物医学诊断等领域具有重要的潜在应用价值。

附图说明

图1是DTPABDA的合成途径、以及DTPABDA与S₂O₄^2-,ClO^-和偶氮还原酶的反应途径；其中，a为DTPABDA的合成途径，b、c和d分别为DTPABDA与S₂O₄^2-,ClO^-和偶氮还原酶的反应途径。

图2是DTPABDA与1mM Na₂S₂O₄孵育后的溶液以及对应的紫外吸收光谱图；其中，a为DTPABDA溶液、以及DTPABDA与1mM Na₂S₂O₄孵育后的溶液(图中I为DTPABDA溶液；II为DTPABDA与1mM Na₂S₂O₄孵育后的溶液)；b为紫外吸收光谱。

图3是DTPABDA与1mM NaClO孵育后的溶液以及对应的紫外吸收光谱图；其中，a为DTPABDA溶液、以及DTPABDA与1mM NaClO孵育后的溶液(图中：I为DTPABDA溶液；II为DTPABDA与1mM NaClO孵育后的溶液)；b为紫外吸收光谱。

图4是DTPABDA与5μg/mL偶氮还原酶孵育后的溶液以及对应的紫外吸收光谱图；其中，a为DTPABDA溶液、以及DTPABDA与5μg/mL偶氮还原酶孵育后的溶液(图中：I为DTPABDA溶液；II为DTPABDA与5μg/mL偶氮还原酶孵育后的溶液)；b为紫外吸收光谱。

图5是1mM Na₂S₂O₄存在时DTPABDA的时间相关紫外吸收光谱，以及样品在波长458nm时，时间相关的吸光度变化图；其中，a为1mM Na₂S₂O₄存在时DTPABDA的时间相关紫外吸收光谱；b为样品在波长458nm时，时间相关的吸光度变化。

图6是1mM NaClO存在时DTPABDA的时间相关紫外吸收光谱，以及样品在波长458nm时，时间相关的吸光度变化图；其中，a为1mM NaClO存在时DTPABDA的时间相关紫外吸收光谱；b为样品在波长458nm时，时间相关的吸光度变化。

图7是5μg/mL偶氮还原酶存在时DTPABDA的时间相关紫外吸收光谱，以及样品在波长458nm时，时间相关的吸光度变化；其中，a为5μg/mL偶氮还原酶存在时DTPABDA的时间相关紫外吸收光谱；b为样品在波长458nm时，时间相关的吸光度变化。

图8是MPA和DTPABDA的硫醇－二硫化物交换反应示意图，以及使用MPA和MPABDA作为配体，在QD表面上EDA介导的配体交换示意图；其中，a为MPA和DTPABDA的硫醇－二硫化物交换反应示意图；b为使用MPA和MPABDA作为配体，在QD表面上EDA介导的配体交换示意图。

图9是通过EDA介导的配体交换方法在UV照射下使用不同比例的MPA/DTPABDA制备的QDs的照片图(摩尔比分别为100/0(I)、90/10(II)、80/20(III)、70/30(IV))。

图10是图9中的QDs样品在560nm处的FL光谱图。

图11是图9中的QDs样品在560nm处的FL强度图。

图12是用比例为70/30的MPA/DTPABDA制备QDs作为配体的XPS测量光谱图。

图13是QDs N 1s的核能级谱图(实线为数据拟合)。

图14是移除淬灭剂的示意图以及荧光恢复的示意图；其中，a为移除淬灭剂的示意图；b为通过移除淬灭剂，荧光恢复的示意图。

图15是100nM Na₂S₂O₄存在下，QDs的时间相关FL变化图。

图16是100nM Na₂S₂O₄存在下，FL强度随反应时间的变化图。

图17是与不同浓度的Na₂S₂O₄孵育后的QDs的荧光光谱图。

图18是不同浓度的Na₂S₂O₄在560nm处荧光强度对比图。

图19是0.1μM Na₂S₂O₄和2μM其他含硫化合物的荧光响应图。

图20是150nM NaClO存在下，QDs的时间相关FL变化图。

图21是150nM NaClO存在下，FL强度随反应时间的变化图。

图22是与不同浓度的NaClO孵育后QDs的FL光谱图。

图23是不同浓度的NaClO在560nm处的FL强度对比图。

图24是0.15μM NaClO和2μM其他ROS/RNS的FL反应结果图。

图25是1.2μg/mL偶氮还原酶和0.1μM NADH存在下，QDs时间相关的FL变化图。

图26是1.2μg/mL偶氮还原酶和0.1μM NADH存在下，FL强度随反应时间的变化图。

图27是与不同浓度的偶氮还原酶孵育后QDs的FL光谱图。

图28是不同浓度的偶氮还原酶在560nm处的FL强度对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可可从商业渠道获得。

实施例1

本实施例提供一种DTPABDA的合成方法。

2.3mmol 4,4'-二硫代二苄胺(4,4’-dithiodibenzylamine，DTDBA)(阿拉丁试剂公司)加入到一个含有20mL 0.5mol/L盐酸(HCl)水溶液的烧瓶，冰浴冷却后，逐滴加入2mL溶于冰水中的5.0mmol亚硝酸钠(NaNO₂)水溶液，混合物冰浴搅拌30分钟后得到4,4'-二硫代二苯基重氮(4,4’-dithiodiphenyldiazonium，DTDPDA)(溶液1)。在另一个烧瓶中，6.0mmol间苯二胺溶解于10mL 1mol/L氢氧化钠(NaOH)水溶液中，冰水冷却(溶液2)。在剧烈搅拌下，将溶液1滴加到溶液2中，用1mol/L NaOH水溶液将所得混合溶液pH值调至10。混合物在冰浴条件下搅拌30分钟，随后室温下搅拌1小时后，收集沉淀物并用水洗涤3次。真空干燥后，红色沉淀即为DTPABDA(双[4,4'-(二硫代苯基偶氮)-1,3-苯二胺](Bis[4,4’-(dithiophenyl azo)-1,3-benzenediamine])。¹H核磁共振氢谱(600MHz,DMSO-d6，室温):σ7.56(d,2H),7.30(d,1H),6.74(d,2H),6.60(s,2H)。DTPABDA通过偶氮偶合反应合成，图1a为DTPABDA的合成示意图。DTPABDA的结构式如下所示：

实施例2

本实施例提供一种DTPABDA响应多种物质的方法。

(1)DTPABDA与S₂O₄^2-，ClO^-的反应

DTPABDA与S₂O₄^2-和ClO^-的反应如下：将DTPABDA溶于二甲基亚砜(DMSO)/磷酸盐缓冲溶液(50mmol/L,pH＝7.4，体积比为20/80)，制备1mL 0.1mmol/L的溶液，随后加入100μL 1mmol/L S₂O₄^2-或ClO^-水溶液，拍摄照片并测量相应的紫外吸收光谱(Varian Cary60分光光度计)。

(2)DTPABDA与偶氮还原酶的反应

DTPABDA与偶氮还原酶的反应如下：将100μL 0.1mmol/L DTPABDA水溶液与100μL5mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)水溶液在1mL DMSO/PBS缓冲液(体积比为20/80)混合液中混合，随后加入10μL 500μg/mL偶氮还原酶(购买自西格玛奥里奇(中国)公司)水溶液，混合均匀后测量相应的紫外吸收光谱。

DTPABDA可与三类物质反应包括：1)具有还原性的S₂O₄^2-；2)具有氧化性的ClO-，；3)偶氮还原酶。图1b～1d为DTPABDA与以上三类物质的反应路径图。这些物质能够通过化学或酶反应，特异性使得DTPABDA分子中偶氮键断裂。

(3)DTPABDA的反应活性测试

为了测试DTPABDA的反应活性，将0.1mmol/L DTPABDA溶液与1mmol/L Na₂S₂O₄，1mmol/L NaClO或含有1mmol/L NADH的5μg/mL偶氮还原酶按体积比1:1混合后一起温育。DTPABDA溶液呈黄色，与Na₂S₂O₄混合后该溶液变为无色(图2a)。由于偶氮苯的特征吸收，DTPABDA溶液的紫外吸收光谱在458nm处显示出强烈的峰(图2b)。当S₂O₄^2-存在下，该吸收峰的消失表示偶氮部分的已移除。用NaClO孵育DTPABDA溶液后，溶液变为淡黄色(图3a)，并且其相应的偶氮苯部分的UV吸收峰显着降低(图3b)。向DTPABDA溶液中加入偶氮还原酶和NADH诱导其缓慢的颜色变为浅黄色(图4a)，并且在458nm处的UV吸收峰也显示出显着的降低(图4b)。300至400nm之间的强吸收是NADH的紫外吸收。

接下来测量了DTPABDA溶液在这些化合物存在下的时间依赖性紫外吸收光谱。加入连二亚硫酸盐后，DTPABDA的UV吸收峰立即降低，并且1分钟内反应几乎完成，1分钟后没有可见的UV吸光度变化(图5a和5b)。次氯酸盐具有与DTPABDA相似的反应性，并且反应在1分钟内几乎达到平衡(图6a和6b)。然而偶氮还原酶的反应相对较慢，并且随着反应的进行UV吸收峰缓慢下降(图7a)，8分钟后458nm处的吸光度达到平台(图7b)。

实施例3

本实施例提供一种DTPABDA修饰的CdSe/ZnS QDs的合成方法。

通过配体交换法合成DTPABDA修饰的QDs(半导体量子点)，过程如下：0.5mL0.1mmol/L QDs(CdSe/ZnS分别为核/壳；购自南京牧科纳米科技有限公司)水溶液中加入大量丙酮，通过丙酮诱导的聚集和离心，将离心后的沉淀溶于1mL CHCl₃溶液中。在搅拌的条件下，将0.5mL 0.01mol/L乙二胺(ethylenediamine，EDA)溶液加入到QDs(量子点与乙二胺的摩尔比为1:100)，混合溶液搅拌30分钟后得到溶液3。在另一个小瓶中，将3-巯基丙酸(3-mercaptopropionic acid，MPA)和DTPABDA以不同摩尔比混合(分别为100/0,90/10,80/20,70/30)于1mL H₂O/DMSO(体积比为80/20)溶液中，搅拌30分钟后得到溶液4；其中，3-巯基丙酸的终浓度为0.01mol/L。将溶液4快速加入溶液3中，剧烈震荡1小时，收集上层水溶液并利用丙酮沉淀离心所得QDs，随后溶于50mmol/L PBS缓冲液中，得到QDs溶液，备用。

利用EDA介导的配体交换方法，以DTPABDA和MPA为配体制备DTPABDA修饰的CdSe/ZnS QDs。MPA有两个重要作用：1)MPA的硫醇基团可以将DTPABDA的二硫键裂解成具有硫醇基团的4-巯基苯偶氮-1,3-苯二胺(MPABDA)(图8a)，其对QD表面的结合能力高于二硫键；2)未反应的MPA和MPABDA作为稳定剂共同吸附在QDs表面，在生理pH下负电荷MPA的静电排斥可以显着提高所得QDs的稳定性(图8b)。

图9为在UV照射下用不同比例的MPA/DTPABDA制备的QDs水溶液图片，比例分别为100/0(I)、90/10(II)、80/20(III)、70/30(IV)。QDs覆盖100％MPA时呈现绿色；当DTPABDA/MPA混合配体覆盖在QDs表面时，亮度减弱。图10为对应QDs的荧光光谱。MPA覆盖的QDs在560nm处显示出强烈的FL发射峰。当DTPABDA/MPA混合配体覆盖在QDs表面时，峰值没有显示任何偏移，但是强度有所降低。当DTPABDA/MPA比率高达30/70时，与MPA修饰的QDs相比，QDs的FL强度降低至18.7％(图11)。图12中的XPS数据表示元素Cd、Se、Zn和S，表明有QDs存在。XPS数据N1s精细谱(图13)中N1s峰可以被拆分为N＝N(399.3eV)和N＝C(402.1eV)，表明偶氮苯分子被成功修饰于QDs表面。

实施例4

本实施例提供一种S₂O₄^2-“开启”传感器、ClO^-“开启”传感器和偶氮还原酶“开启”传感器的检测方式。

将10uL 10μmol/L QDs溶液(即实施例3制备的DTPABDA修饰的CdSe/ZnS QDs)分别与100μL 0.1μmol/L Na₂S₂O₄水溶液、100μL 0.15μmol/LNaClO水溶液或含有0.1μmol/L NaDH水溶液的100μL 1.2μg/mL偶氮还原酶水溶液(0.05μmol/L)混合，每隔一段时间测量它们的与时间相关的FL光谱(Na₂S₂O₄和NaClO间隔半分钟，偶氮还原酶间隔1分钟)。为了定量测定S₂O₄^2-、ClO^-和偶氮还原酶这三种物质，分用将不同浓度的Na₂S₂O₄、NaClO或含有NADH的偶氮还原酶与QDs溶液孵育，随后检测对应的FL光谱，根据荧光光谱强度和浓度的关系制作工作曲线，计算线性范围和检出限。基于FL淬灭机理，去除偶氮苯部分即可恢复其FL。因此，具有裂解偶氮苯部分能力的分析物可以通过恢复的FL来分析。其传感机制如图14所示。图15和16为时间相关的FL光谱。

(1)S₂O₄^2-“开启”传感器

对S₂O₄^2-的FL传感：FL强度逐渐增加并在5分钟后达到平衡，表明响应时间为5分钟。用不同浓度的Na₂S₂O₄孵育5分钟后(浓度分别为0、2、4、8、10、20、40、60、80、100、150nmol/L)，560nm处的QDs FL强度随着S₂O₄^2-浓度的增加而增加(图17)。1和80nmol/L之间有良好线性关系，计算所得检测限(LOD)为0.05nmol/L(图18)。

为了验证该传感器对S₂O₄^2-的选择性，用2uL 1mmol/L Na₂SO₄,Na₂SO₃,Na₂S或NaHS溶液与10uL 10μmol/L的QDs溶液在1mL缓冲液(二甲基亚砜(DMSO)/磷酸盐缓冲溶液(50mmol/L,pH＝7.4，体积比为20/80))中孵育5分钟，结果如图19所示，在用2μmol/L Na₂SO₄,Na₂SO₃,Na₂S和NaHS溶液孵育QDs后，FL强度没有显着变化，表明该传感器对S₂O₄^2-具有良好的选择性。

(2)ClO^-“开启”传感器

对ClO^-的FL传感：与检测S₂O₄^2-的FL反应类似，在1mL缓冲液(二甲基亚砜(DMSO)/磷酸盐缓冲溶液(50mmol/L,pH＝7.4，体积比为20/80))中加入10uL 10μmol/L DTPABDA修饰的QDs溶液，再加入NaClO(浓度为0、4、8、10、20、40、60、80、100、150、200、250nmol/L)逐渐诱导其FL恢复(图20和21)。FL强度在8分钟后达到其最大水平，即响应时间为8分钟。图22为用不同浓度(0、4、8、10、20、40、60、80、100、150、200、250nmol/L)的ClO^-孵育8分钟后QDs的FL光谱。浓度相关的FL强度增强，并且当ClO^-浓度为4到150nmol/L时，560nm处的FL强度显示线性增加(图23)。计算LOD为0.2nmol/L。

图24为2uL 1mmol ROS/RNS(OH·,O₂^-,1O₂,H₂O₂,NO,ONOO^-1)和10uL 10μmol/L QDs溶液在1mL缓冲液中孵育的FL响应，它们是ClO^-传感中的主要干扰物。与这些物质一起孵育后没有明显的FL强度变化，表明该传感器对ClO^-的优异选择性。

(3)偶氮还原酶“开启”传感器

对偶氮还原酶的FL传感：缺氧是各种疾病的特征，包括癌症、心脏病、缺血和血管疾病。偶氮还原酶是生理缺氧标记物，可用于检测肿瘤的缺氧程度。基于“开启”FL传感机制，偶氮还原酶能够通过酶催化反应使得偶氮基团从NADH接受氢还原生成胺，从而去除偶氮基团，从而开启DTPABDA修饰的QDs的FL。图25和26为1.2μg/mL偶氮还原酶和0.1μmol/L NADH存在下，QDs的FL强度逐渐增加，在15分钟内达到平台，即响应时间为15分钟。将不同浓度(0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.5、2μg/mL)的偶氮还原酶与DTPABDA修饰的QDs孵育15分钟后，随着偶氮还原酶浓度的增加，其FL强度逐渐增加(图27和28)，在0.02和1.2μg/mL之间有良好的线性关系。计算得LOD为2ng/mL。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

基于偶氮苯-量子点的荧光探针及制备方法以及其在分子开关型荧光传感器中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

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Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。