专利摘要

本发明公开了一种金属纳米粒子复合ICP材料及其在检测多巴胺含量中的应用。该金属纳米粒子复合ICP材料，为Ag纳米粒子修饰的式I所示重复结构单元构成的无限配位聚合物。本发明利用表面修饰粗糙Ag纳米粒子的无限配位聚合物ICP材料（AgZMZ）对多巴胺具有高灵敏和高选择性荧光识别的功能，可实现对大鼠脑透析液中多巴胺含量的直接荧光测定。该方法具有灵敏度高、选择性好、响应快速、成本低、样品需求量少等优点，更为重要的是，该方法操作简单、稳定性高、可适用于活体内多巴胺基础值的测定。

权利要求

1.一种金属纳米粒子复合ICP材料，为Ag纳米粒子修饰的式I所示重复结构单元构成的无限配位聚合物； 

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述Ag与无限配位聚合物的摩尔比为10mM-20mM：20mM-30mM，具体为12.9mM：24.0mM； 

所述Ag纳米粒子的粒径为10nm-25nm，具体为20nm； 

所述金属纳米粒子复合ICP材料的直径为150nm-300nm。 

3.一种制备权利要求1或2任一所述金属纳米粒子复合ICP材料的方法，包括如下步骤： 

将AgNO₃的乙醇溶液与所述无限配位聚合物的乙醇分散液混合搅拌过夜进行还原反应，反应完毕得到所述金属纳米粒子复合ICP材料； 

所述AgNO₃乙醇溶液的浓度具体为12.9mM； 

所述式I所示无限配位聚合物的乙醇分散液中，无限配位聚合物与乙醇的用量比为0.5mg-1.5mg：1mL，具体为1mg：1mL； 

所述还原反应步骤中，温度为室温。 

4.权利要求1或2任一所述金属纳米粒子复合ICP材料在检测多巴胺含量中的应用；或者， 

金属纳米粒子复合ICP材料在制备检测活体脑内的多巴胺含量的产品中的应用。 

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述活体为大鼠。 

6.一种检测多巴胺含量的方法，包括如下步骤： 

1）绘制标准曲线： 

将一系列不同摩尔浓度的多巴胺人工脑脊液标准品加入至权利要求1或2任一所述金属纳米粒子复合ICP材料的乙醇分散液中，用荧光仪进行测定，以多巴胺的摩尔浓度为横坐标，荧光响应值为纵坐标，绘制标准曲线； 

2）大鼠脑透析液中多巴胺浓度的测定 

将所述步骤1）多巴胺人工脑脊液标准品替换为所述待测样品，按照步骤1）所述方法检测待测样品的荧光响应值，将所得荧光响应值代入步骤1）所得标准曲线，得到待测样品中多巴胺的含量。 

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述多巴胺人工 脑脊液标准品由NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgCl₂、NaHCO₃、Na₂SO₄、CaCl₂和水组成，其中，NaCl的终浓度为126mM，KCl的终浓度为2.4mM，KH₂PO₄的终浓度为0.5mM，MgCl₂的终浓度为0.85mM，NaHCO₃的终浓度为27.5mM，Na₂SO₄的终浓度为0.5mM，CaCl₂的终浓度为1.1mM； 

金属纳米粒子复合ICP材料的乙醇分散液的浓度为0.01-0.02mg/mL，具体为0.02mg/mL，体积为2.0mL； 

所述多巴胺人工脑脊液标准品的体积均为10μL； 

所述标准曲线对应的一元线性方程为Y=49.6936+11.525X，其中，Y为荧光响应值，X为多巴胺浓度，单位为nM。 

8.根据权利要求1-4任一所述的应用或方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述待测样品的体积为10μL； 

所述待测样品为大鼠脑透析液。 

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定多巴胺含量的方法。 

背景技术

多巴胺是脑内一种重要的神经递质，主要负责大脑的情欲、感觉，将兴奋及开心的信息传递，爱情的感觉其实就是脑里产生大量多巴胺作用的结果。也与上瘾有关，吸烟和吸毒都可以增加多巴胺的分泌，使上瘾者感到开心及兴奋。多巴胺不足或失调则会令人注意力无法集中或失去控制肌肉的能力，严重时会导致手脚不自主地颤动、乃至罹患帕金森病。因此测定脑内多巴胺的含量具有重要的生理、病理意义。 

多巴胺在脑内的静态值含量很低（低于100nM），且干扰物质很多。现有的活体检测多巴胺的方法主要是电化学快速扫描循环伏安法，该方法用于多巴胺大量释放时的动态值检测，难以应用到静态基础值的检测。另外，虽然目前还发展了紫外-可见吸收、电致化学发光、分子荧光等方法用于检测多巴胺，但是由于灵敏度和选择性的要求，限制了这些方法在活体分析中的应用。迄今为止，具有高灵敏度、高选择性的测定多巴胺的荧光分析方法还鲜有报道。 

金属表面增强荧光是指分布于金属纳米结构表面或粒子附近的荧光分子的发射强度较之在自由空间的信号明显增强的现象。荧光分子邻近于金属纳米材料表面，将提高荧光分子的荧光强度，在不改变仪器的信噪比的条件下，使得分子荧光检测更加容易实现。用于产生金属表面增强荧光的通常有Ag、Au、Cu等金属纳米粒子。无限配位聚合物（infinite coordination polymers，ICPs）是由金属离子或金属离子簇和多齿桥联配体通过自组装而形成的具有可控的尺寸和形貌的一类有机-无机金属杂化材料，在传感、催化、光学、气体储存、离子交换和药物载体等方面均显示出巨大的应用前景。此外，某些无限配位聚合物还具有荧光性质，能够与生物活性分子产生特异性识别作用。通过合理设计，将金属纳米粒子与ICP复合形成具有金属表面增强的新型荧光探针，有望用于多巴胺的高灵敏和高选择性的活体检测分析。迄今为止，这种金属纳米粒子复合ICP材料的性能及其在活体分析化学方面的应用研究尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种金属纳米粒子复合ICP材料及其在检测多巴胺含量中的应用。 

本发明提供的金属纳米粒子复合ICP材料，为Ag纳米粒子修饰的式I所示重复结构单元构成的无限配位聚合物； 

该金属纳米粒子复合ICP材料可表示为AgZn-MSB-Zn，简写为AgZMZ； 

上述材料中，Ag与无限配位聚合物的摩尔比为10mM-20mM：20mM-30mM，具体为12.9mM：24.0mM； 

所述Ag纳米粒子的粒径为10nm-25nm，具体为20nm； 

所述金属纳米粒子复合ICP材料呈球状，直径为150nm-300nm，其上负载有粒径为10nm-25nm的金属Ag纳米粒子，从而形成粗糙表面，该金属纳米粒子复合ICP材料可在乙醇中稳定存在； 

本发明提供的制备所述金属纳米粒子复合ICP材料的方法，包括如下步骤： 

将AgNO₃的乙醇溶液与所述无限配位聚合物的乙醇分散液混合搅拌过夜进行还原反应，反应完毕得到所述金属纳米粒子复合ICP材料； 

所述AgNO₃的乙醇溶液的浓度具体为12.9mM； 

所述式I所示无限配位聚合物的乙醇分散液中，无限配位聚合物与乙醇的用量比为0.5mg-1.5mg：1mL，具体为1mg：1mL； 

所述还原反应步骤中，温度为室温。 

上述AgZMZ中，作为式I所示ICP材料的配体，简称为MSB，其结构通式如式II所示，是通过主体结构上的羧基氧原子与锌离子配位，希夫碱结构上氮原子和氧原子同时与锌离子配位而形成的式I所示无限网络结构ZMZ； 

式I所示ICP材料可按照包括如下步骤制备而得：将式II所示配体MSB的二甲基亚砜溶液和锌盐的二甲基亚砜溶液混匀后，静置，然后逐滴加入乙醚，1小时后有黄色沉淀生成，用二甲基亚砜洗涤，得到式I所示ZMZ材料； 

该方法中，式II所示配体MSB的二甲基亚砜溶液的浓度为0.011mM； 

锌盐具体可为二水合醋酸锌； 

金属锌离子的二甲基亚砜溶液浓度具体为0.023mM。 

式II所示配体MSB与锌盐的摩尔比为0.02mM-0.03mM：0.02mM-0.03mM，具体为1：1。 

其中，式II所示配体MSB可按照（Adv.Mater.2011,23,1720-1723）文献报道的方法制备而得，具体步骤包括：将4-醛基苯甲酸（1.0g,6.7mmol）和4-氨基-3-羟基苯甲酸（1.1g,7.3mmol）溶于20mL乙醇中，在80℃下回流30分钟，收集沉淀用乙醇清洗而得。 

上述本发明提供的金属纳米粒子复合ICP材料在检测多巴胺含量中的应用及其在制备检测活体脑内的多巴胺含量的产品中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述活体为大鼠。 

本发明提供的检测多巴胺含量的方法，包括如下步骤： 

1）绘制标准曲线： 

将一系列不同摩尔浓度的多巴胺人工脑脊液标准品加入至金属纳米粒子复合ICP材料的乙醇分散液中，用荧光仪进行测定，以多巴胺的摩尔浓度为横坐标，荧光响应值为纵坐标，绘制标准曲线； 

2）大鼠脑透析液中多巴胺浓度的测定： 

将所述步骤1）将多巴胺人工脑脊液标准品替换为所述待测样品，按照所述步骤1）所述方法检测所述待测样品的荧光响应值，将所得荧光响应值代入所述步骤1）所得的标准曲线，得到所述待测样品中多巴胺的含量。 

上述方法的步骤1）中，所述多巴胺人工脑脊液标准品由NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgCl₂、NaHCO₃、Na₂SO₄、CaCl₂和水组成，其中，NaCl的终浓度为126mM，KCl的终浓度为2.4mM，KH₂PO₄的终浓度为0.5mM，MgCl₂的终浓度为0.85mM，NaHCO₃的终浓度为27.5mM，Na₂SO₄的终浓度为0.5mM，CaCl₂的终浓度为1.1mM； 

金属纳米复合ICP材料的乙醇分散液的浓度为0.01-0.02mg/mL，具体为0.02mg/mL； 

所述金属纳米复合ICP材料的乙醇分散液的体积为2.0mL； 

所述多巴胺人工脑脊液标准品的体积均为10μL； 

所述标准曲线对应的一元线性方程为Y=49.6936+11.525X，其中，Y为荧光响应值，X为多巴胺浓度，单位为nM； 

所述步骤2）中，所述待测样品的体积为10μL； 

所述待测样品为大鼠脑透析液。 

本发明的原理是基于Ag纳米粒子对ZMZ材料的荧光产生增强作用使其对荧光检测多巴胺的灵敏度大幅度提高。当入射光照射到金属纳米粒子复合ZMZ材料时，金属纳米粒子附近产生强烈的电磁场，而当加入多巴胺时，能够激发金属表面电磁场对无限配位聚合物ZMZ材料的荧光增强，荧光增强的强度与多巴胺的浓度呈正比。根据金属纳米粒子复合ZMZ材料的乙醇分散液加入多巴胺之后的荧光响应值变化，从 而能准确测定多巴胺的浓度，能够检测多巴胺水溶液最低浓度至0.03nM。 

本发明相对于现有技术具有如下优点： 

（1）本发明充分利用了ICP材料的荧光性质以及Ag纳米粒子的荧光增强作用。 

（2）本发明灵敏度高，选择性好，该方法测出的大鼠脑透析液中多巴胺的浓度与文献报道的静态值（0.1～100.0nM）比较无显著差异，但省去了许多繁琐的程序。 

（3）本发明操作简单，稳定性高，对操作人员无特殊技术要求。另外，其样品需求量小，成本低，响应时间快，易于实现现场测定。 

附图说明

图1、ZMZ和AgZMZ的扫描电子显微镜图像，以及AgZMZ的能量色散X-射线光谱。 

图2、AgZMZ检测多巴胺前后对比的红外光谱图（FTIR）。 

图3、AgZMZ检测多巴胺前后的扫描电子显微镜图像。 

图4、未复合Ag纳米粒子的ICP材料（ZMZ）对多巴胺水溶液的荧光响应。 

图5、AgZMZ对多巴胺人工脑脊液样品的荧光响应和标准曲线。 

图6、AgZMZ对大鼠脑内可能存在的多种干扰物质的荧光响应。 

图7、AgZMZ对大鼠脑透析液多巴胺浓度的测定。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。 

实施例1、制备AgZMZ 

将浓度为12.9mM的AgNO₃的乙醇溶液与无限配位聚合物ZMZ的乙醇分散液（ZMZ与乙醇的用量比为1mg：1mL）于室温混合搅拌过夜进行还原反应，反应完毕得到所述金属纳米粒子复合AgZMZ材料； 

其中，无限配位聚合物ZMZ可按照（Adv.Mater.2011,23,1720-1723）文献报道的步骤制备而得：将浓度为0.011mM的配体MSB（式II）的二甲基亚砜溶液和浓度为0.023mM的锌盐二水合醋酸锌的二甲基亚砜溶液以等摩尔比（也即式II所示配体MSB与锌盐的摩尔比）超振荡混匀后，静置，然后逐滴加入乙醚。1小时后有黄色沉淀生成，用二甲基亚砜洗涤，得到式I所示ZMZ材料； 

其中，式II所示配体MSB可按照（Adv.Mater.2011,23,1720-1723）文献报道的方法制备而得，具体步骤包括：将4-醛基苯甲酸（1.0g,6.7mmol）和4-氨基-3-羟基苯甲酸（1.1g,7.3mmol）溶于20mL乙醇中，在80℃下回流30分钟，收集沉淀用乙 醇清洗而得。4-醛基苯甲酸，4-氨基-3-羟基苯甲酸，锌盐以及所用溶剂均可由试剂公司购得，不需要进一步处理直接使用。 

图1为所合成的ZMZ与AgZMZ的扫描电子显微镜照片，如图中1-A所示，所述无限配位聚合物ZMZ为尺寸均匀，直径在150nm-300nm之间的纳米球，表面较为光滑。与金属Ag纳米粒子结合之后的形貌如图1-B所示，可以看到ZMZ纳米球的表面上均匀附着了10nm-25nm的纳米Ag粒子，图1-C是AgZMZ的能量色散X-射线荧光光谱，从能谱上能看到Zn和Ag的特征峰，表明有这两种元素的存在。其中Zn元素来自无限配位聚合物ZMZ，Ag元素来自复合后的Ag纳米粒子。 

图2为多巴胺和Ag复合ZMZ材料（AgZMZ）测定多巴胺之后的FT-IR图。AgZMZ测定多巴胺之后在1616cm^-1和1501cm^-1两处出现强吸收峰，分别对应于苯环的振动和多巴胺上两个羟基的伸缩振动，另外在3224cm^-1和3346cm^-1两处出现的分别是多巴胺上氨基的对称和反对称伸缩振动。这些强吸收峰都说明了AgZMZ材料和多巴胺具有很强的相互作用。 

图3是AgZMZ测定多巴胺前后的扫描电子显微镜图像，可以看到，当测定多巴胺前后，金属纳米粒子复合ICP材料的形貌和结构基本没有发生变化，说明该材料具有很好的稳定性。 

图4是未复合金属Ag纳米粒子的ICP材料（ZMZ）对多巴胺水溶液的荧光响应。向ZMZ的乙醇悬浊液中滴加入不同浓度的多巴胺水溶液（多巴胺最终浓度依次为0μM,10μM,50μM,100μM,1mM,10mM）后，365nm处的荧光响应有较小的变化（激发波长287nm），且荧光响应与多巴胺浓度不具有一定的线性关系。当加入多巴胺浓度为10mM时，365nm的荧光发射峰消失，在较短波长328nm处出现一个新的发射峰。从光谱图可以看出，ICP材料本身对多巴胺的荧光响应灵敏度不高，不具有良好的分析性能。 

实施例2、AgZMZ对不同浓度的多巴胺人工脑脊液样品荧光响应分析性能 

将一系列不同摩尔浓度的多巴胺人工脑脊液标准品加入至实施例1所得金属纳米粒子复合ICP材料也即AgZMZ的乙醇分散液中，加入多巴胺的最终浓度依次为0nM,10nM,20nM,40nM,80nM,100nM，用荧光仪进行测定，以多巴胺人工脑脊液标准品中多巴胺的摩尔浓度为横坐标，365nm处的荧光响应值为纵坐标（激发波长：287nm），绘制标准曲线，如图5所示，所对应的一元线性方程为Y=49.6936+11.525X，其中，Y为荧光响应值，无单位，X为多巴胺的摩尔浓度，单位为nM；标准曲线的线性范围是10nM-100nM,检测限为0.03nM； 

其中，AgZMZ的乙醇分散液的用量为2.0mL，浓度为1mg/mL； 

多巴胺人工脑脊液标准品的用量均为10μL； 

所用多巴胺人工脑脊液标准品由NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgCl₂、NaHCO₃、Na₂SO₄、CaCl₂和水组成，其中，NaCl的终浓度为126mM，KCl的终浓度为2.4mM，KH₂PO₄的终浓度为0.5mM，MgCl₂的终浓度为0.85mM，NaHCO₃的终浓度为27.5mM，Na₂SO₄的终浓度为0.5mM，CaCl₂的终浓度为1.1mM； 

从荧光响应曲线可以看出，AgZMZ对多巴胺具有很好的荧光响应，其响应值随着多巴胺浓度的增加而增加。 

实施例3、AgZMZ对大鼠脑内可能存在的多种干扰物质的荧光分析性能。 

按照如下方法分析AgZMZ对大鼠脑内可能存在的多种干扰物质（谷胱甘肽、乳酸、葡萄糖、尿酸、谷氨酸、甘氨酸、5-羟色胺和二羟基苯乙酸）的荧光分析性能： 

向2.0mL浓度为1mg/mL的AgZMZ的乙醇悬浊液中分别加入10μL配制好的多巴胺、谷胱甘肽、乳酸、葡萄糖、尿酸、谷氨酸、甘氨酸、5-羟色胺和二羟基苯乙酸的人工脑脊液溶液，加入的干扰物质的最终浓度均为10μM，直接用荧光仪进行测定。 

图6是AgZMZ对大鼠脑内可能存在的多种干扰物质的荧光响应，以荧光发射波长为横坐标，荧光响应值为纵坐标（激发波长：287nm），得到AgZMZ对大鼠脑内可能存在的多种干扰物质的荧光响应曲线。 

和多巴胺的荧光响应对比可以发现，这些干扰物质的响应很低，基本无干扰，体现了很高的选择性。 

实施例4、检测大鼠脑透析液中多巴胺含量 

1）绘制标准曲线： 

由实施例2所得结果可知，图5所示标准曲线对应的一元线性方程为Y=49.6936+11.525X，其中，Y为荧光响应值，无单位，X为多巴胺浓度，单位为nM； 

标准曲线的线性范围是10nM-100nM，检测限为0.03nM； 

2）检测大鼠脑透析液中多巴胺的含量： 

向2.0mL浓度为1mg/mL的AgZMZ的乙醇分散液中加入大鼠脑透析液10μL。直接测定荧光响应，代入步骤1）所得标准曲线，得到待测大鼠脑透析液的多巴胺浓度，如图7和表1所示。 

表1、利用AgZMZ测出的大鼠脑透析液中多巴胺的静态基础值 

[0078] 

由图可知，AgZMZ材料对大鼠脑透析液中的多巴胺浓度具有荧光响应，并且荧光响应在此方法的线性范围之内，根据所得到的标准曲线可以得到所对应的大鼠脑透析液中多巴胺的浓度分别为42.3±0.4nM，29.4±0.6nM，33.1±0.5nM，16.7±1.1nM。 

用此方法测出的大鼠脑透析液中多巴胺基础值与文献报道的数值范围（0.1-100nM）相符，该结果有效验证了本发明方法的可靠性与准确性。 

综上，本发明利用表面修饰粗糙Ag纳米粒子的无限配位聚合物ICP材料AgZMZ对多巴胺具有高灵敏和高选择性荧光识别的功能，实现了对大鼠脑透析液中多巴胺含量的直接荧光测定。该方法具有灵敏度高、选择性好、响应快速、成本低、样品需求量少等优点，更为重要的是，该方法操作简单、稳定性高、可适用于活体内多巴胺基础值的测定。因此，采用该方法对活体内多巴胺含量进行分析，对了解某些生理病理过程中的分子机制具有重要的意义。 

一种测定多巴胺含量的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。