专利摘要

本发明涉及一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其包括下述过程：微波灭酶处理、不同浓度乙醇溶液梯度浸提且以液氮降温并排除氧气、多酚由大孔树脂吸附并由乙醇溶液洗脱、多酚析出液真空浓缩后冷冻干燥，得莲藕多酚；浸提后的滤渣经热水浸提、快冷析出淀粉后过滤，滤液与多酚提取中产生的滤液合并并超滤得非淀粉多糖溶液，真空浓缩、冷冻干燥得莲藕多糖。本发明提供的方法实现了莲藕多酚和多糖的联合提取，首先在低温低氧环境下分离莲藕中多酚，再对残渣以热水法提取多糖。多酚提取中采用不同浓度乙醇梯度浸提，可提高多酚提取率；多糖提取中采用冷却法除去可溶性淀，可提高下阶段超滤纯化的效率并提升莲藕多糖的品质。

权利要求

1.一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)新鲜莲藕经洗净后，连同皮和节粉碎得莲藕碎渣，对莲藕碎渣进行微波灭酶处理；

2)将步骤1)中灭酶后的莲藕碎渣加入无水乙醇得待提液，经6000～10000r/min高速匀浆后加入少许液氮，密封搅拌浸提20～40min，此后每间隔10～15min加入1/2无水乙醇体积的蒸馏水和少许液氮，每次加入液氮后均使待提液温度降至5～20℃，延续搅拌浸提30～45min，浸提结束后过滤分离得到多酚粗提液及滤渣；

3)将步骤2)中的多酚粗提液在55℃下真空浓缩至原体积的1/4得提取浓缩液，加入大孔树脂，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤得到充分吸附的大孔树脂和滤液；

4)将步骤3)中充分吸附的大孔树脂用蒸馏水浸洗1～3次后，加入与步骤3)中提取浓缩液等体积的乙醇洗脱液，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离得到多酚析出液，在55℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷冻干燥，得到莲藕多酚；

5)将步骤2)中得到的滤渣用蒸馏水分散，在75～95℃下搅拌提取3～5h，快速冷却至4℃后维持3～5h，过滤，将滤液并与步骤3)中滤液合并，得到非淀粉多糖粗提液；

6)对步骤5)中的非淀粉多糖粗提液在40～50℃下进行超滤，将截留多糖浓缩液在55～75℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷冻干燥，得到莲藕多糖。

2.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤1)中微波灭酶处理的微波功率为600～800W，灭酶处理的时间为2～3min。

3.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤2)中的无水乙醇按1:6～10g/mL的料液比添加。

4.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤2)中的每次液氮添加量为所述待提液质量的1～3％。

5.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤3)中的大孔树脂按1:8～16g/mL的料液比添加。

6.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤3)中的大孔树脂为AB-8、HPD-600或H-103。

7.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤4)中的乙醇洗脱液为体积分数为70～100％乙醇水溶液。

8.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤5)中的滤渣与蒸馏水的质量比为1：15～25。

9.根据权利要求1所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤5)中的快速冷却至4℃所用的时间为5-10min。

10.根据权利要求1至9任一项所述的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其特征在于，步骤6)中超滤的截留分子量为5000～8000Da。

说明书

技术领域

本发明属于功能食品加工技术领域，具体涉及一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法。

背景技术

莲藕是我国栽培最广、销售量和销售范围最大的水生蔬菜。因季节性强，上市时间相对集中，莲藕大部分以初级农产品的形式鲜销转化，受市场供需波动影响较大，极易产生“菜贱伤农”现象，影响产业发展的根本。此外，莲藕在贮、运、销等过程中极易褐变和腐败，现有的品质保持技术尚难满足低成本、高安全和长效性等多方面要求，导致采后损失严重，大力发展加工业是莲藕产业稳定发展的重要保障。当前，莲藕的加工主要分为两类方式：其一是分切加工制品，如生鲜类、腌制类、脱水类、速冻类、煮制类等；其二是内容物加工制品，如藕汁饮料、速溶藕粉、藕酒等。整体而言，莲藕加工科技水平薄弱，产品“同质化”现象严重。此外，加工过程中产生大量的藕皮、藕节和藕渣等副产物，均未得到有效开发利用，造成资源的浪费和环境的污染。莲藕资源的创新利用可能是产业可持续发展的关键，而发挥资源的特色和优势则是重要的切入点。

莲藕作为一种极为常见的蔬菜，其清热、止血、调节内分泌、滋补安神等功效早已为人们所熟知，且在古籍《本草经疏》和药典中有明确记载。现代药理学研究发现，莲藕中的主要活性成分为多酚和非淀粉多糖，表现出抗氧化、降血糖、免疫调节、改善睡眠和记忆等多种生物功效。莲藕中活性成分含量丰富，多酚和非淀粉多糖约占其鲜重的0.13％和2.5％。天然活性多酚和多糖在食品、医药和化妆品等领域的市场前景良好。故，活性多酚和多糖的提取开发可能是莲藕资源创新利用的重要切入点。莲藕多酚和多糖的相关研究现状归纳如下：

(1)莲藕多酚研究现状。Kaur等(2002)采用β-胡萝卜素/亚油酸乳化液法研究发现，36种亚洲蔬菜中莲藕具有较强的抗氧化能力。郭长江等(2003)采用FRAP法对36种常见蔬菜进行抗氧化分析，发现藕的抗氧化能力最强，显著优于姜、油菜、豇豆、芋头等。此后，杨冬梅(2007)综合FRAP法、DPPH法、β-胡萝卜素/亚油酸乳化液法比较了包括莲藕在内的12种常见蔬菜的抗氧化活性，并得到相似的结论。而莲藕的抗氧化能力与其酚类化合物含量成正比(Hu,et al,2002)。大量文献研究报道证实，莲藕多酚具有良好的自由基清除活性、总抗氧化能力和油脂抗氧化能力(Yi,2016；Maisuthisakul,2007；徐艳艳,2015；覃海明,2015；刘焕云,2011；严守雷,2005)。除抗氧化外，莲藕多酚还表现出金黄色葡萄球菌抑制(严守雷,2006)、降血糖(Mukherjee,1997)、增强记忆力及神经发育(Yang,2008；Mukherjee,1996)等功效。

(2)莲藕非淀粉多糖研究现状。莲藕中非淀粉多糖约占其干重的2.5％，其中分子量大于2000kDa的酸性组分主要由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、岩藻糖和木糖组成(严浪,2007)；分子量为18.8kDa的组分主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成(江筠,2010)。体外抗氧化评价发现，莲藕非淀粉多糖能有效清除羟自由基，并抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血(王瑜,2007；严浪,2008)。莲藕水提物还能显著增强实验动物的体液和细胞免疫功能(Mukherjee,2010)，而这些功效可能与非淀粉多糖密切相关。莲藕多糖LB2可上调Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞IL-2、IL-4和IL-10的表达，激活机体免疫系统，有利于改善HIV-1感染后细胞因子普遍降低的状态，维持机体免疫平衡，且LB2对TNF-α表达的下调作用使其具有直接抑制HIV-1复制的能力(江筠,2010)。此外，莲藕多糖能有效降低糖尿病小鼠血糖，提高葡萄糖耐受能力，并不同程度地提高肝、肾和胰腺中SOD活性，降低MDA含量；表现出显著的抗疲劳活性，能延长小鼠负重游泳时间，降低血乳酸、血清尿素氮的含量，提高肝糖原含量(罗登宏,2011；周桃英,2011)。

现有技术中已有对莲藕中多酚和多糖的提取方法均未体现联合提取的特点，公开的内容多为单独针对多酚的提取或专门针对多糖的提取。现有的针对莲藕多酚的提取方法通常直接以单一浓度的乙醇溶液直接萃取且提取的温度相对较高(发明专利：CN03128215；硕士论文：莲藕多酚提取分离鉴定及生物活性研究华中农业大学)，在提取之前均未作酶失活处理，提取过程也未要求在无氧或少氧环境中进行，因此现有技术对莲藕多酚进行提取时多酚损失率较高，造成提取率及纯度均较低。现有技术中对莲藕多糖的提取通常以莲藕渣为原料，使用水提醇沉法，制备水溶性多糖，其不足之处在于，提取过程中引入了乙醇，浓缩环节负荷加大，提取的多糖中包括水溶性淀粉，降低了提取的莲藕多糖的品质。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其以新鲜莲藕为原料，同时获取莲藕多酚和多糖，旨在提供一套具有良好前景的莲藕功能产品开发应用技术。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其包括如下步骤：

1)新鲜莲藕经洗净后，连同皮和节粉碎得莲藕碎渣，对莲藕碎渣进行微波灭酶处理；

2)将步骤1)中灭酶后的莲藕碎渣加入无水乙醇得待提液，经6000～10000r/min高速匀浆后加入少许液氮，密封搅拌浸提20～40min，此后每间隔10～15min加入1/2无水乙醇体积的蒸馏水和少许液氮，每次加入液氮后均使待提液温度降至5～20℃，延续搅拌浸提30～45min，浸提结束后过滤分离得到多酚粗提液及滤渣；

3)将步骤2)中的多酚粗提液在55℃下真空浓缩至原体积的1/4得提取浓缩液，按料液比1:8～16g/mL的料液比加入大孔树脂，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤得到充分吸附的大孔树脂和滤液；

4)将步骤3)中充分吸附的大孔树脂用蒸馏水浸洗1～3次后，加入与步骤3)中提取浓缩液等体积的乙醇洗脱液，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离得到多酚析出液，在55℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷冻干燥，得到莲藕多酚；

5)将步骤2)中得到的滤渣用蒸馏水分散，在75～95℃下搅拌提取3～5h，快速冷却至4℃后维持3～5h，过滤，将滤液并与步骤3)中滤液合并，得到非淀粉多糖粗提液；

6)对步骤5)中的非淀粉多糖粗提液在40～50℃下进行超滤，将截留多糖浓缩液在55～75℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷冻干燥，得到莲藕多糖。

具体的，步骤1)中微波灭酶处理的微波功率为600～800W，灭酶处理的时间为2～3min。

具体的，步骤2)中的无水乙醇按1:6～10g/mL的料液比添加。

具体的，步骤2)中的每次液氮添加量为所述待提液质量的1～3％。

具体的，步骤3)中的大孔树脂按1:8～16g/mL的料液比添加。

具体的，步骤3)中的大孔树脂为AB-8、HPD-600或H-103。

具体的，步骤4)中的乙醇洗脱液为体积分数为70～100％乙醇水溶液。

具体的，步骤5)中的滤渣与蒸馏水的质量比为1：15～25。

具体的，步骤5)中的快速冷却至4℃所用的时间为5-10min。

具体的，步骤6)中超滤的截留分子量为5000～8000Da。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)采用微波法对莲藕原料进行灭酶处理，在原料浸提初期采用高浓度乙醇抑制/钝化酶活，同时在浸提过程中通过液氮降温和排除氧气。相比同类方法，本方法针对工艺过程的集成控制能更有效地减弱莲藕多酚提取过程中的氧化反应，最大程度地保留了提取物的生物活性。

2)采用不同浓度乙醇梯度浸提，不仅有利于控制多酚氧化，而且提高了多酚的溶出率。现有的莲藕多酚纯化工艺以非食用性的有机溶剂萃取为主，存在环境及残留安全影响，多酚损失率较高，且产品纯度较低。本方法采用大孔树脂纯化工艺，不仅环境友好、安全，而且产品多酚回收率和纯度均显著提升。

3)莲藕非淀粉多糖提取过程中，采用冷却法除去可溶性淀粉，以提高下阶段超滤纯化的效率并提升莲藕非淀粉多糖的品质，相比传统的酶解法不仅简便工艺、降低成本，而且消除了外源性蛋白杂质的加入。

4)莲藕非淀粉多糖纯化过程中，采用超滤法脱除小分子杂质并加以浓缩，相比传统的乙醇沉淀法不仅可以减少有机试剂的使用、降低浓缩环节的负荷，而且避免了大分子缠结导致的溶解度降低。

5)对莲藕中多酚和多糖进行联合提取制备。首先在低温低氧环境下分离莲藕中多酚，再对残渣以热水法提取多糖；对多酚浸提中一并溶出的多糖在多酚纯化工艺中加以分离，并合并到下阶段的多糖粗提液中。本发明提供的方法实现了同时保留产品活性和提升产品得率的目的。

附图说明

图1为本发明提供的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法的工艺路线；

图2为本发明实施例1与对比例1至5的多酚提取率及提取出的多酚对DPPH自由基清除率的对比情况(从左至右20％、40％、60％、80％、100％、梯度分别依次表示对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5和实施例1)。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

图1所示为发明提供的一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，以下为本发明给出的具体实施例和对比例。

实施例1

一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其包括如下步骤：

1)新鲜莲藕经洗净后，连同皮和节粉碎，并采用600W功率的微波灭酶处理3min；

2)将步骤1)中灭酶后的莲藕碎渣按料液比(g/mL)1:6加入无水乙醇得待提液，经6000～10000r/min高速匀浆后滴加所述待提液质量2％的液氮，密封搅拌浸提40min，此后，每间隔15min加入1/2乙醇体积的蒸馏水和所述待提液质量2％的液氮，每次加入液氮后均使待提液的温度降至约12℃，延续搅拌浸提30min，浸提结束后过滤分离得到多酚粗提液及滤渣；

3)将步骤2)中的多酚粗提液在55℃下真空浓缩至原体积的1/4得提取浓缩液，按料液比(g/mL)1:8加入大孔树脂AB-8，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离充分吸附的大孔树脂和滤液；

4)将步骤3)中充分吸附的大孔树脂用蒸馏水浸洗1～3次后，加入与步骤3)中提取浓缩液等体积的体积分数为70％的乙醇溶液，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离得到多酚析出液，在55℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多酚；

5)将步骤2)中分离的滤渣用15倍质量的蒸馏水分散，在75℃下搅拌提取3h，5min内快速冷却至4℃后维持3h，过滤分离滤液并与步骤3)中滤液合并，得到非淀粉多糖粗提液；

6)对步骤5)中的非淀粉多糖粗提液在40℃下进行超滤，截留分子量为5000～8000Da，将截留多糖浓缩液在55℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多糖。

实施例2

一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其包括如下步骤：

1)新鲜莲藕经洗净后，连同皮和节粉碎，并采用700W功率的微波灭酶处理2min；

2)将步骤1)中灭酶后的莲藕碎渣按料液比(g/mL)1:8加入无水乙醇得待提液，经6000～10000r/min高速匀浆后滴加所述待提液质量1％的液氮，密封搅拌浸提30min，此后，每间隔12min加入1/2乙醇体积的蒸馏水和所述待提液质量1％的液氮，每次加入液氮后均使待提液的温度降至约20℃，延续搅拌浸提36min，浸提结束后过滤分离得到多酚粗提液及滤渣；

3)将步骤2)中的多酚粗提液在55℃下真空浓缩至原体积的1/4得提取浓缩液，按料液比(g/mL)1:12加入大孔树脂HPD-600，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离充分吸附的大孔树脂和滤液；

4)将步骤3)中充分吸附的大孔树脂用蒸馏水浸洗1～3次后，加入与步骤3)中提取浓缩液等体积的体积分数为85％的乙醇溶液，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离得到多酚析出液，在55℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多酚；

5)将步骤2)中分离的滤渣用20倍质量的蒸馏水分散，在85℃下搅拌提取4h，10min内快速冷却至4℃后维持3～5h，过滤分离滤液并与步骤3)中滤液合并，得到非淀粉多糖粗提液；

6)对步骤5)中的非淀粉多糖粗提液在45℃下进行超滤，截留分子量为5000～8000Da，将截留多糖浓缩液在65℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多糖。

实施例3

一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其包括如下步骤：

1)新鲜莲藕经洗净后，连同皮和节粉碎，并采用800W功率的微波灭酶处理2min；

2)将步骤1)中灭酶后的莲藕碎渣按料液比(g/mL)1:10加入无水乙醇得待提液，经6000～10000r/min高速匀浆后滴加所述待提液质量3％的液氮，密封搅拌浸提20min，此后，每间隔10min加入1/2乙醇体积的蒸馏水和所述待提液质量3％的液氮，每次加入液氮后均使待提液的温度降至约5℃，延续搅拌浸提45min，浸提结束后过滤分离得到多酚粗提液及滤渣；

3)将步骤2)中的多酚粗提液在55℃下真空浓缩至原体积的1/4得提取浓缩液，按料液比(g/mL)1:16加入大孔树脂H-103，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离充分吸附的大孔树脂和滤液；

4)将步骤3)中充分吸附的大孔树脂用蒸馏水浸洗1～3次后，加入与步骤3)中提取浓缩液等体积的无水乙醇，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离得到多酚析出液，在55℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多酚；

5)将步骤2)中分离的滤渣用25倍质量的蒸馏水分散，在95℃下搅拌提取5h，7.5min内快速冷却至4℃后维持5h，过滤分离滤液并与步骤3)中滤液合并，得到非淀粉多糖粗提液；

6)对步骤5)中的非淀粉多糖粗提液在50℃下进行超滤，截留分子量为5000～8000Da，将截留多糖浓缩液在75℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多糖。

对比例1

一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法，其包括如下步骤：

1)新鲜莲藕经洗净后，连同皮和节粉碎，并采用600W功率的微波灭酶处理3min；

2)将步骤1)中灭酶后的莲藕碎渣按料液比(g/mL)1:12加入体积分数为20％的乙醇溶液得待提液，料液比选用1：12是为了便于与实施例1对比，即将实施例1加入的无水乙醇和多次加入蒸馏水的体积进行累加，经6000～10000r/min高速匀浆后滴加所述待提液质量2％的液氮，密封搅拌浸提40min，此后，每间隔15min加入所述待提液质量2％的液氮，每次加入液氮后均使待提液的温度降至约12℃，延续搅拌浸提30min，浸提结束后过滤分离得到多酚粗提液及滤渣；

3)将步骤2)中的多酚粗提液在55℃下真空浓缩至原体积的1/4得提取浓缩液，按料液比(g/mL)1:8加入大孔树脂AB-8，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离充分吸附的大孔树脂和滤液；

4)将步骤3)中充分吸附的大孔树脂用蒸馏水浸洗1～3次后，加入与步骤3)中提取浓缩液等体积的体积分数为70％的乙醇溶液，在30～40℃下低速搅拌6～12h，过滤分离得到多酚析出液，在55℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多酚；

5)将步骤2)中分离的滤渣用15倍质量的蒸馏水分散，在75℃下搅拌提取3h，5min内快速冷却至4℃后维持3h，过滤分离滤液并与步骤3)中滤液合并，得到非淀粉多糖粗提液；

6)对步骤5)中的非淀粉多糖粗提液在40℃下进行超滤，截留分子量为5000～8000Da，将截留多糖浓缩液在55℃下真空浓缩至1/4体积后冷冻干燥，得到莲藕多糖。

对比例2

与对比例1的提取方法的步骤基本完全一致，仅有的区别在于对比例2的步骤2)中使用的乙醇溶液的体积分数为40％。

对比例3

与对比例1的提取方法的步骤基本完全一致，仅有的区别在于对比例3的步骤2)中使用的乙醇溶液的体积分数为60％。

对比例4

与对比例1的提取方法的步骤基本完全一致，仅有的区别在于对比例4的步骤2)中使用的乙醇溶液的体积分数为80％。

对比例5

与对比例1的提取方法的步骤基本完全一致，仅有的区别在于对比例5的步骤2)中使用的乙醇溶液的体积分数为100％，即使用的为无水乙醇。

图2为本发明实施例1与对比例1至5的多酚提取率及提取出的多酚对DPPH自由基清除率的对比情况，图中从左至右20％、40％、60％、80％、100％、梯度分别依次表示对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5和实施例1。从图2中可见，本发明使用乙醇浓度逐渐减小的梯度浸提法，可使莲藕多酚的提取率得到有效提高，且最终得到的多酚对DPPH自由基清除率也相对较高，即其生物活性也得到较好的保持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种莲藕多酚和多糖的联合提取方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。