专利摘要

本发明涉及式(I)咪唑类衍生物及其在药物学上可接受的盐、异构体、前药和药物组合物，此类化合物为香草素4型瞬时受体电位通道(TRPV4)的抑制剂。本发明还公开了所述化合物的制备及其作为药物的应用，特别是作为急性肺损伤的药物的应用。

权利要求

1.式I所示的化合物及其药学可接受的盐，

其中：

环T为苯基、吡啶基或嘧啶基，

R1为氰基、卤素、AR3、AR3R4，

R2为AR3，

当R1或R2为AR3时，A为-N、-SO2、-C(＝O)N，

当R1为AR3R4时，A为-N、-C(＝O)N，

R3为H、C1～C6的直链或支链烷基，

R4为H、C1～C6的直链或支链烷基，

X为哌啶基或氮杂环丁烷基，

Y为苯基或吡啶基，

R选自下列基团：

2.如权利要求1所述的化合物及其药学可接受的盐，

其中：

环T为苯基、吡啶基或嘧啶基，

R1为氰基、-Cl、AR3、AR3R4，

R2为AR3，

当R1或R2为AR3时，A为-N、-SO2、-C(＝O)N，

当R1为AR3R4时，A为-N、-C(＝O)N，

R3为H、甲基、乙基或异丙基，

R4为H、甲基、乙基或异丙基，

X为哌啶基或氮杂环丁烷基，

Y为苯基或吡啶基。

3.如下所示结构的化合物及其药学可接受的盐：

4.制备权利要求1～3任一项所述化合物的方法，其包括：

1)苯基、吡啶基或嘧啶基并1-(1-Boc哌啶-4-基)-咪唑(II a)与4M HCl(III)反应得到中间体4-(苯基、吡啶基或嘧啶基并咪唑-1-基)哌啶盐酸盐(IV a)，

2)苯基、吡啶基或嘧啶基并1-(1-Boc氮杂环丁烷-3-基)-咪唑(II b)与4M HCl(III)反应得到中间体3-(苯基、吡啶基或嘧啶基并咪唑-1-基)氮杂环丁烷盐酸盐(IV b)，

3)4-(苯基、吡啶基或嘧啶基并咪唑-1-基)哌啶盐酸盐(IV a)与10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(V)反应得到终产物10-(4-(4-(苯基、吡啶基或嘧啶基并咪唑-1-基)-哌啶-1-基)苯-1-基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(I i)，

4)3-(苯基、吡啶基或嘧啶基并咪唑-1-基)氮杂环丁烷盐酸盐(IV b)与10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(V)反应得到终产物10-(4-(3-(苯基、吡啶基或嘧啶基并咪唑-1-基)-氮杂环丁烷-1-基)苯-1-基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(I ii)，

其中，R1、R2和环T的定义如权利要求1-3所述。

5.一种药物，其包含至少一种如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学可接受的盐和至少一种其他的赋形剂。

6.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学可接受的盐在用于制备治疗急性肺损伤的药物中的应用。

7.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学可接受的盐在用于制备治疗急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及可抑制香草素4型瞬时受体电位通道的化合物及其在药物学上可接受的盐、异构体、前药和药物组合物，还涉及其制备以及其作为药物的应用，特别是作为急性肺损伤的药物的应用。

背景技术

瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels，TRP channels)是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道。其最早发现于果蝇的视觉系统，突变体果蝇对持续的光刺激只产生瞬时而非持续的锋电位，因此命名为瞬时受体电位通道。迄今已在果蝇、蠕虫以及哺乳动物等很多生物体先后发现了多种TRP通道。在哺乳动物上，已发现 28种TRP通道亚型。依据氨基酸序列的同源性，将现已发现的28种哺乳动物TRP通道分为6个亚家族：TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML。TRP通道作为细胞重要的感受器，传递细胞内外的信息，同时也受来自细胞内外的信使分子、化合物以及温度、渗透压等变化的调节。不同的TRP通道调节机制各异，而且很多TRP通道可接受多种刺激调节。

TRP通道分布广泛，除中枢神经系统外，还分布于外周神经系统、皮肤、心血管系统、呼吸系统、胃肠道系统、泌尿生殖系统以及免疫和内分泌系统等。并且与经典的电压依赖型阳离子通道参与相对特化的功能不同，TRP通道涉及多种功能，如热感受、疼痛感觉和气道调节；介导Ca2+内流，维持细胞离子稳态，调节血管通透性与紧张度；参与细胞生长调控等。

TRP通道由6个跨膜(S1-S6)结构域，以及位于胞内的N末端和C末端组成。TRP通道的S5与S6之间片段内嵌构成离子通过孔道。而S4片段却缺乏通常电压依赖性阳离子通道S4片段所具有的正电荷氨基酸残基，因此TRP通道是非电压依赖性的。此外，在很多TRP亚型的N末端还具有数个锚蛋白样重复结构。有些TRP亚型的C末端含有高度保守的TRP结构域，由带有“EWKFAR”或“VWKYQR”TRP盒的25个氨基酸组成，有的亚型 C末端还具有激酶或磷酸化酶功能域。

TRPV4是TRPV亚家族的成员之一，又称VR-OAC、OTRPC4、TRP12或VRL-2，其首次克隆和在异源系统中的表达是建立在与线虫OSM-9同源性的基础上。TRPV4通道染色体定位于12q24.1。人源TRPV4是同源四聚体，每个单体由871个氨基酸组成。TRPV4通道表达于神经、心、肝、肾、肺、脾、睾丸等多种组织。TRPV4可被低渗、切变应力、高温、花生四烯酸及其代谢产物以及人工合成的小分子如GSK1016790A激活，引起胞内 Ca2+浓度升高，进而导致各种生理和病理进程。研究表明，在急性肺损伤模型中，TRPV4 表达升高，进而引起肺内炎性反应失控。而TRPV4抑制剂有效地减轻了炎性反应。因此，研究对TRPV4具有特异性和高活性的抑制剂具有重大意义。

近年来，已经有一些文献报道了可以抑制TRPV4活性的物质，如：钌红、柠檬醛、小檗碱、以及各种选择性的小分子如RN-1734、RN-9893、HC-067047、GSK-205等。此外，WO2009111680、WO2009146177、WO2010011912、WO2011091407、WO2011119693、WO2012144661、WO2012174342、WO2013012500、WO2013152109、WO2014008477、WO2016028325、WO2017177200、US2011130400中描述了作为TRPV4抑制剂的小分子化合物。这些的化合物在抑制TRPV4方面具有很高的体外活性。

本发明根据药物特点和临床用药的需求研发了上述结构通式的TRPV4抑制剂。

发明内容

本发明所用的化合物是有效的TRPV4抑制剂，可作为治疗急性肺损伤的药物。该化合物具有如权利要求1所描述的含咪唑结构化合物，这种新类型的咪唑衍生物的特点是咪唑环1位被氮杂环丁烷或哌啶的衍生物所取代，2位被烷基或烷胺基取代；另外，咪唑环4，5位与苯环或六元芳杂环结合，形成稠环芳烃结构。

本发明提供了式I所示的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物。

其中：

环T为苯基和5-6元杂芳基，

R1为氰基、卤素、AR3、AR3R4，

R2为AR3，

A为-H、-O、-S、N、-SO2、-C(＝O)、-SO2N、-CO2、-C(＝O)N，

R3为H、C1～C6的直链或支链烷基，

R4为H、C1～C6的直链或支链烷基，

X为取代或未被取代的环烷基，

Y为

a)取代或未被取代的芳基，

b)取代或未被取代的杂环基，

R选自下列基团：

本发明式I还可以是其盐的形式，一般是与有机或无机碱或酸形成的盐。

本发明优选生理学可接受的盐。本发明化合物的生理学可接受的盐可以是本发明物质与无机酸、羧酸或磺酸的盐，特别优选的是例如与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、鞣酸形成的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其药学上可接受的盐。

本发明的化合物可以以互变异构形式存在，并且本发明同样也包含了该类形式。

本发明的化合物还可以是其可能的溶剂化物。

烷基通常是具有1至6，优选1至4个碳原子的支链，特别优选1至3个碳原子的支链或支链烷基，其优选的实例有甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正戊基和正己基。

卤素(用于本发明目的的卤素)是氟、氯、溴和碘。

本发明还涉及制备本发明式I化合物的合成方法，包括：

1)苯基或5-6元杂芳基并1-(1-Boc哌啶-4-基)-咪唑(IIa)与4M HCl(III)反应得到中间体4-(苯基或5-6元杂芳基并咪唑-1-基)哌啶盐酸盐(IVa)。

其中：R1和R2的定义如权利要求1所述。

2)苯基或5-6元杂芳基并1-(1-Boc氮杂环丁烷-3-基)-咪唑(IIb)与4M HCl (III)反应得到中间体3-(苯基或5-6元杂芳基并咪唑-1-基)氮杂环丁烷盐酸盐(IVb)。

其中：R1和R2的定义如权利要求1所述。

3)4-(苯基或5-6元杂芳基并咪唑-1-基)哌啶盐酸盐(IVa)与10-(4-溴苯基) -9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(V)反应得到终产物10-(4-(4-(苯基或5-6元杂芳基并咪唑-1-基)-哌啶-1-基)苯-1-基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(Ii)。

其中：R1和R2的定义如权利要求1所述。

4)3-(苯基或5-6元杂芳基并咪唑-1-基)氮杂环丁烷盐酸盐(IVb)与10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(V)反应得到终产物10-(4-(3-(苯基或5-6元杂芳基并咪唑-1-基)-氮杂环丁烷-1-基)苯-1-基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶(Iii)。

其中：R1和R2的定义如权利要求1所述。

式IIa化合物可以通过如下反应路线制备：

路线1

路线2

路线3

路线4

式IIb化合物可以通过如下反应路线制备：

路线1

路线2

路线3

本发明还涉及一种包含至少一种本发明化合物的药物，其优选的还一起包含一种或多种药理学可接受的赋形剂或载体，并且还涉及其用于上述目的的应用。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

该活性成分可以具有全身和/或局部作用，因此，其可以以适宜的途径进行给药，所说的适宜途径如口服、胃肠外、肺、鼻、舌下、舌、颊、直肠、经皮、结膜、局部给药或以植入物的形式给药。

该活性成分还可以以适于这些给药途径的给药形式进行给药。

适于口服给药的有可以迅速和/或以改变的方式传递活性成分的公知的给药形式，如片剂 (未包衣片或包衣片，如具有肠包衣或莫包衣的片剂)、胶囊、糖衣片、颗粒、小药丸、粉剂、乳剂、混悬液和气雾剂。

采用胃肠外给药可能可避免吸收步骤(静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰髓内给药) 或者包含吸收(肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内给药)。适于胃肠外给药的给药形式特别是用于注射和输入的溶液、混悬液、乳剂、冷冻干燥物和无菌粉末形式的制剂。

适于其他给药途径的有例如吸入(特别是粉末吸入、喷雾)的药物、鼻滴剂/溶液、喷雾剂；用于舌、舌下或颊给药的片剂或胶囊、栓剂、用于耳朵和眼睛的制剂、阴道胶囊、水性混悬液(洗剂、振摇混合物)、亲脂性混悬液、软膏、乳膏、乳液、糊剂、撒粉或植入物，如斯腾特固定模。

可以用本身已知的方法将该活性成分转化成所述的给药形式。其可以用惰性无毒的适宜药用赋形剂来实现。其特别是包括载体(例如微晶纤维素)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)、分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然生物聚合物(例如蛋白质)、稳定剂(例如抗氧剂和抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料如氧化铁)或矫味剂和/或掩味剂。在适宜的情况中，所说的活性成分可以以微囊包封的形式存在于一种或多种上述载体中。

除本发明式I的化合物外，上述药物制剂还可以包含其他药物活性成分。

附图说明

图1实施例1化合物对TRPV4的抑制活性滴定曲线。

具体实施方式

下面的实施例是本发明优选的说明性优选方案，对本发明不构成任何限制。

一、有关中间体的合成：

1、中间体1：6-氯-N4-(1-Boc-哌啶-4-基)-嘧啶-4，5-二胺(路线1的中间体)

取20g(122mmol)4，6-二氯-5-氨基嘧啶和24.4g(122mmol)1-Boc-4-氨基哌啶溶于244mL 叔丁醇中，加入42.4mL DIPEA，加热至回流，搅拌16h，减压蒸除溶剂。向残余物中加入100mL 二氯甲烷和100mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝2∶1柱层析分离，得白色固体10.0g(收率25.0％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.07(s，1H)，4.17-4.05(m，2H)，2.92(m，3H)，2.10- 2.04(m，4H)，1.46(s，9H)；ESI-MS(m/z)：328.13[M+H]+

2、关键中间体2：6-氯-8-异丙基氨基-9-(1-Boc-哌啶-4-基)-9H-嘌呤(路线1的中间体)

干燥仪器，取9.1g(27.7mmol)6-氯-N4-(1-Boc-哌啶-4-基)-嘧啶-4，5-二胺与1.1g(27.7mmol)NaH(60％)于1000mL三口瓶中，氮气保护，搅拌下加入无水吡啶181.6mL，加毕，缓慢滴加4.4mL(31.3mmol)异硫氰酸异丙酯，加热至80℃，搅拌1小时，后加入 20.7g(38.0mmol)1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，升温至90℃，搅拌2小时，停止反应，减压蒸除溶剂，向残余物中加入100mL二氯甲烷和100mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，DCM∶THF＝20∶1 柱层析分离，得白色固体5.7g(收率52.0％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.39(s， 1H)，4.54(br，1H)，4.47-4.17(m，4H)，2.94-2.77(m，2H)，2.63-2.45(m，2H)， 1.84(d，J＝11.0Hz，2H)，1.50(s，9H)，1.36(d，J＝6.4Hz，6H).；ESI-MS(m/z)：395.17 [M+H]+

3、中间体3：6-氰基-8-异丙基氨基-9-(1-Boc-哌啶-4-基)-9H-嘌呤(路线2的中间体)

干燥仪器，依次取3g(7.6mmol)6-氯-8-异丙基氨基-9-(1-Boc哌啶-4-基)-9H-嘌呤、 1.8g(15.2mmol)氰化锌、7.1g(7.6mmol)三(二亚苄基丙酮)二钯、4.4g(7.6mmol)1，1’-双(二苯基膦)二茂铁加至250mL三口瓶中，氮气保护，搅拌下加入38.2mL无水DMF，加热至100℃，搅拌12小时，停止反应，硅藻土过滤除去固体杂质，加入300mL水，乙酸乙酯(4 ×100mL)萃取，饱和食盐水50ml洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝1∶1柱层析分离，得白色固体2.2g(收率75.0％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.58(s，1H)， 4.97(br，1H)，4.50-4.18(m，4H)，2.88(t，J＝12.5Hz，2H)，2.56(dt，J＝12.5， 8.1Hz，2H)，1.89-1.80(m，2H)，1.50(s，9H)，1.38(d，J＝6.5Hz，6H)；ESI-MS(m/z)： 386.22[M+H]+

4、关键中间体4：N，N-二甲基-8-异丙基氨基-9-(1-Boc-哌啶-4-基)-9H-嘌呤-6-基-甲酰胺(路线2的中间体)

取2.1g(5.4mmol)6-氰基-8-异丙基氨基-9-(1-Boc-哌啶-4-基)-9H-嘌呤溶于62.0mL 乙醇与15.4mL去离子水中，加入2.6g(46.4mmol)氢氧化钾，加热至80℃，反应过夜，减压蒸除溶剂，向残余物中加入50mL甲醇，滤去不溶物，用甲醇(4×20mL)洗不溶物，减压蒸除甲醇，干燥后，直接加入250mL三口瓶中，与41.8mL二氯甲烷形成悬浊液，在0℃下加入0.46mL DIPEA，再缓慢滴加10.4mL T3P，控制反应体系温度在1℃以下，加毕，在0℃搅拌1小时，缓慢滴加13.1mL(26.2mmol)二甲胺，控制反应体系温度在1℃以下，加毕，缓慢升至室温，反应3天，用50mL饱和碳酸氢钠溶液淬灭，分层，水层用二氯甲烷(2×50mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂。DCM∶甲醇＝20∶1柱层析分离，得浅黄色固体0.75g(收率32％)。ESI-MS(m/z)：432.28[M+H]+

5、中间体5：1-Boc-4-(2-氨基-4-甲磺酰苯胺基)-哌啶(路线3的中间体)

在250mL圆底烧瓶中加入2g(9.1mmol)4-氟-3-硝基苯基甲砜和1.5g(14.1mmol)碳酸钠，溶于30.4mL乙腈中，取1.8g(9.1mmol)1-Boc-4-氨基哌啶搅拌下加入反应瓶，室温下反应2 天，减压蒸除溶剂。向残余物中加入100mL乙酸乙酯和100mL饱和食盐水，分层，水层用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝5∶1柱层析分离，得黄色固体3.2g(收率87.8％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.77(d，J＝2.2Hz，1H)，8.46(d，J＝7.0Hz，1H)，7.88(dd，J＝9.1，2.2Hz，1H)，7.00(d，J＝9.2 Hz，1H)，4.05(br，2H)，3.82-3.69(m，1H)，3.04(d，J＝10.8Hz，5H)，2.07(d， J＝10.7Hz，2H)，1.77-1.50(m，2H)，1.47(s，9H)；ESI-MS(m/z)：344.10[M-tBu+H]+

在100mL圆底烧瓶中加入3.2g(8.0mmol)1-Boc-4-(2-硝基-4-甲磺酰苯胺基)哌啶、 2.1g(37.9mmol)铁粉、0.21g(4.0mmol)氯化铵，溶于15.0mL乙醇与5.0mL去离子水中，加热至70℃，反应6小时，硅藻土过滤，减压蒸除滤液。干燥后，得到粗产物2.4g(收率82％)，无需进一步纯化，直接作为下一步反应原料。

6、关键中间体6：1-(1-Boc哌啶-4-基)-2-异丙基氨基-5-甲磺酰基-1H-苯并咪唑(路线3的中间体)

干燥仪器，在100mL三口瓶中取2g(5.4mmol)1-Boc-4-(2-氨基-4-甲磺酰苯胺基)-哌啶溶于10.8mL无水吡啶，氮气保护，缓慢滴加0.62mL(5.4mmol)异硫氰酸异丙酯，加热至80℃，搅拌2小时，降至室温，加入1.3g(6.5mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌18小时，停止反应，减压蒸除溶剂，向残余物中加入50mL二氯甲烷和50mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×40mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，DCM∶THF＝20∶1柱层析分离，得白色固体1.1g(收率47.3％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.01(d，J＝1.7Hz，1H)，7.59(dd，J＝8.4，1.3Hz，1H)，7.30(d，J＝8.4Hz， 1H)，4.44-4.22(m，4H)，4.11-4.03(m，1H)，3.03(s，3H)，2.96-2.81(m，2H)， 2.36-2.21(m，2H)，1.89(d，J＝11.2Hz，2H)，1.52(s，9H)，1.36(d，J＝6.3Hz， 6H)；ESI-MS(m/z)：427.18[M+H]+

7、中间体7：1-Boc-4-(2-氨基-5-氰基苯胺基)-哌啶(路线3的中间体)

在250mL圆底烧瓶中加入2g(12.0mmol)3-氟-4-硝基苯腈和2g(18.6mmol)碳酸钠，溶于40.1mL乙腈中，取2.4g(12.0mmol)1-Boc-4-氨基哌啶搅拌下加入反应瓶，室温下反应2天，减压蒸除溶剂。向残余物中加入100mL乙酸乙酯和100mL饱和食盐水，分层，水层用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝10∶1柱层析分离，得黄色固体4.0g(收率95.9％)。ESI-MS(m/z)：291.11[M-tBu+H]+

在100mL圆底烧瓶中加入4g(11.5mmol)1-Boc-4-(2-硝基-5-氰基苯胺基)哌啶、3.1g(54.5mmol)铁粉、0.31g(5.8mmol)氯化铵，溶于21.7mL乙醇与7.2mL去离子水中，加热至70℃，反应6小时，硅藻土过滤，减压蒸除滤液。干燥后，得到粗产物3.5g(收率96.3％)，无需进一步纯化，直接作为下一步反应原料。

8、关键中间体8：1-(1-Boc哌啶-4-基)-2-异丙基氨基-6-氰基-1H-苯并咪唑(路线3的中间体)

干燥仪器，在100mL三口瓶中取3.5g(10.9mmol)1-Boc-4-(2-氨基-5-氰基苯胺基)哌啶溶于21.9mL无水吡啶，氮气保护，缓慢滴加1.2mL(10.9mmol)异硫氰酸异丙酯，加热至80℃，搅拌2小时，降至室温，加入2.5g(13.1mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌18小时，停止反应，减压蒸除溶剂，向残余物中加入100mL二氯甲烷和100mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂， DCM∶THF＝50∶1柱层析分离，得浅褐色固体2.4g(收率57.0％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ7.45(m，2H)，7.37(dd，J＝8.2，1.1Hz，1H)，4.50-4.18(m，4H)，3.99(t，J ＝12.0Hz，1H)，2.87(t，J＝11.8Hz，2H)，2.24(qd，J＝12.7，4.7Hz，2H)，1.87(d， J＝11.4Hz，2H)，1.52(s，9H)，1.35(d，J＝6.3Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：384.24[M-H]+

9、中间体9：6-氯-N4-(1-Boc-氮杂环丁烷-3-基)-嘧啶-4，5-二胺(路线4的中间体)

取10g(61mmol)4，6-二氯-5-氨基嘧啶和10.5g(61mmol)1-Boc-3-氨基氮杂环丁烷溶于 122mL叔丁醇中，加入21.2mL DIPEA，加热至回流，搅拌16h，减压蒸除溶剂。向残余物中加入100mL二氯甲烷和100mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝2∶1柱层析分离，得白色固体5.6g(收率30.6％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.01(s，1H)，5.85(d，J＝5.7Hz，1H)，4.75-4.66(m，1H)，4.35(dd，J＝9.2，7.5Hz，2H)，3.82(dd，J＝9.0，4.5Hz，2H)，1.44(s， 9H)；ESI-MS(m/z)：300.12[M+H]+

10、关键中间体10：6-氯-8-异丙基氨基-9-(1-Boc氮杂环丁烷-3-基)-9H-嘌呤(路线4的中间体)

干燥仪器，取1.2g(4.1mmol)6-氯-N4-(1-Boc-氮杂环丁烷-3-基)-嘧啶-4，5-二胺与 0.16g(4.1mmol)NaH(60％)于100mL三口瓶中，氮气保护，搅拌下加入无水吡啶27.0mL，加毕，缓慢滴加0.7mL(4.7mmol)异硫氰酸异丙酯，加热至80℃，搅拌1小时，后加入 2.4g(5.7mmol)1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，升温至90℃，搅拌2小时，停止反应，减压蒸除溶剂，向残余物中加入50mL二氯甲烷和50mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×40mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，DCM∶THF＝20∶1 柱层析分离，得白色固体0.5g(收率33.0％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.40(s， 1H)，5.36(m，1H)，4.55-4.40(m，3H)，4.31(dd，J＝10.3，4.0Hz，2H)，1.50(s， 9H)，1.37(d，J＝6.5Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：367.16[M+H]+

11、中间体11：1-Boc-3-(2-氨基-4-甲磺酰苯胺基)-氮杂环丁烷(路线5的中间体)

在250mL圆底烧瓶中加入2g(9.1mmol)4-氟-3-硝基苯基甲砜和1.5g(14.1mmol)碳酸钠，溶于30.4mL乙腈中，取1.6g(9.1mmol)1-Boc-3-氨基氮杂环丁烷搅拌下加入反应瓶，室温下反应2天，减压蒸除溶剂。向残余物中加入100mL乙酸乙酯和100mL饱和食盐水，分层，水层用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝5∶1柱层析分离，得黄色固体3.1g(收率91.5％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.80(d，J＝2.2Hz，1H)，8.62(s，1H)，7.94(dd，J＝9.0，2.1Hz，1H)，6.67(d，J＝9.0Hz，1H)，4.47-4.37(m，3H)，3.96-3.87(m，2H)，3.06(s，3H)，1.45(s，9H)；ESI-MS(m/z)： 316.07[M-tBu+H]+，272.08[M-Boc+H]+

在100mL圆底烧瓶中加入3g(8.1mmol)1-Boc-3-(2-硝基-4-甲磺酰苯胺基)氮杂环丁烷、2.1g(37.9mmol)铁粉、0.21g(4.0mmol)氯化铵，溶于15.0mL乙醇与5.0mL去离子水中，加热至70℃，反应6小时，硅藻土过滤，减压蒸除滤液。干燥后，得到粗产物2.4g(收率87.0％)，无需进一步纯化，直接作为下一步反应原料。

12、关键中间体12：1-(1-Boc氮杂环丁烷-3-基)-2-异丙基氨基-5-甲磺酰基-1H-苯并咪唑(路线5的中间体)

干燥仪器，在100mL三口瓶中取1.5g(4.4mmol)1-Boc-3-(2-氨基-4-甲磺酰苯胺基) 氮杂环丁烷溶于8.8mL无水吡啶，氮气保护，缓慢滴加0.47mL(4.4mmol)异硫氰酸异丙酯，加热至80℃，搅拌2小时，降至室温，加入1.0g(5.3mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌18小时，停止反应，减压蒸除溶剂，向残余物中加入50mL二氯甲烷和50mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×40mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，DCM∶THF＝20∶1柱层析分离，得白色固体1.0g(收率55.4％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.00(s，1H)，7.64(d，J＝8.4Hz，1H)，7.35(d，J ＝6.6Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.03(m，1H)，4.52(t，J＝9.1Hz，2H)，4.37(dd，J＝ 10.0，3.8Hz，2H)，4.25(m，1H)，3.04(s，3H)，1.50(s，9H)，1.35(d，J＝5.6Hz， 6H)；ESI-MS(m/z)：409.90[M+H]+

13、中间体13：1-Boc-3-(2-氨基-5-氰基苯胺基)-氮杂环丁烷(路线6的中间体)

在250mL圆底烧瓶中加入2g(12.0mmol)3-氟-4-硝基苯腈和2g(18.6mmol)碳酸钠，溶于40.1mL乙腈中，取2.1g(12.0mmol)1-Boc-3-氨基氮杂环丁烷搅拌下加入反应瓶，室温下反应2天，减压蒸除溶剂。向残余物中加入100mL乙酸乙酯和100mL饱和食盐水，分层，水层用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，PE∶EA＝10∶1 柱层析分离，得黄色固体3.7g(收率96.5％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.30(d， J＝8.7Hz，1H)，8.22(d，J＝4.3Hz，1H)，7.00(dd，J＝8.7，1.5Hz，1H)，6.82(d，J＝1.1Hz，1H)，4.50-4.39(m，2H)，4.33(m，1H)，3.88(dd，J＝9.3，4.5Hz，2H)， 1.46(s，9H)；ESI-MS(m/z)：263.08[M-tBu+H]+，219.09[M-Boc+H]+

在100mL圆底烧瓶中加入3.7g(11.6mmol)1-Boc-3-(2-硝基-5-氰基苯胺基)氮杂环丁烷、3.1g(54.5mmol)铁粉、0.31g(5.8mmol)氯化铵，溶于21.8mL乙醇与7.3mL去离子水中，加热至70℃，反应6小时，硅藻土过滤，减压蒸除滤液。干燥后，得到粗产物3.0g(收率89.5％)，无需进一步纯化，直接作为下一步反应原料。

14、关键中间体14：1-(1-Boc氮杂环丁烷-3-基)-2-异丙基氨基-6-氰基-1H-苯并咪唑(路线6 的中间体)

干燥仪器，在100mL三口瓶中取2.5g(8.7mmol)1-Boc-3-(2-氨基-5-氰基苯胺基)氮杂环丁烷溶于17.6mL无水吡啶，氮气保护，缓慢滴加0.94mL(8.7mmol)异硫氰酸异丙酯，加热至80℃，搅拌2小时，降至室温，加入2.0g(10.4mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌18小时，停止反应，减压蒸除溶剂，向残余物中加入50mL二氯甲烷和50mL饱和食盐水，分层，水层用二氯甲烷(2×40mL)萃取，合并有机层，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，DCM∶THF＝20∶1柱层析分离，得白色固体1.9g(收率61.7％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ7.45(m，3H)，4.98-4.87(m，1H)，4.57-4.48(m， 2H)，4.39-4.22(m，3H)，1.51(s，9H)，1.35(d，J＝6.5Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：356.21 [M+H]+

二、目标化合物合成实施例：

实施例1：10-(4-(4-(6-N，N-二甲基甲酰胺基-8-异丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)-哌啶-1-基)- 苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶

取51mg(0.14mmol)4-(6-N，N-二甲基甲酰胺基-8-异丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)哌啶盐酸盐、51mg(0.14mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶、3.1mg(0.01mmol)醋酸钯、8.2mg(0.03mmol)2-(二叔丁基膦)联苯、135mg(0.42mmol)碳酸铯溶于1ml 1，4- 二氧六环中，氮气保护，加热至100℃，搅拌18小时，停止反应，硅藻土过滤，收集滤液，减压蒸除溶剂，柱层析分离得产物60mg(收率70.4％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.62 (s，1H)，7.44(dd，J＝7.6，1.6Hz，2H)，7.20(q，J＝8.9Hz，4H)，6.94(dtd，J＝ 25.4，7.3，1.5Hz，4H)，6.33(dd，J＝8.1，1.1Hz，2H)，4.58(br，1H)，4.39(m，2H)， 3.99(d，J＝12.1Hz，2H)，3.20(s，3H)，3.11-2.97(m，5H)，2.80(dd，J＝22.5， 11.5Hz，2H)，2.01(d，J＝10.6Hz，2H)，1.68(s，6H)，1.32(d，J＝6.5Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：615.39[M-H]+

实施例2：10-(4-(4-(6-氯-8-异丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)-哌啶-1-基)-苯基)-9，9-二甲基-9，10- 二氢吖啶

方法同实施例1，45mg(0.14mmol)4-(6-氯-8-异丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)哌啶盐酸盐与51mg(0.14mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体42mg(收率53.7％)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：δ8.27(s，1H)，7.44(dd，J＝7.8，1.5Hz，2H)， 7.36(d，J＝7.5Hz，1H)，7.25(d，J＝9.0Hz，2H)，7.15(d，J＝9.0Hz，2H)，6.99 -6.93(m，2H)，6.89-6.83(m，2H)，6.22(dd，J＝8.2，1.2Hz，2H)，4.54(m，1H)， 4.23-4.14(m，1H)，4.00(d，J＝12.4Hz，2H)，2.96-2.73(m，4H)，1.87(d，J ＝13.3Hz，2H)，1.58(s，6H)，1.27(d，J＝6.6Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：578.28[M+H]+

实施例3：10-(4-(4-(2-异丙基氨基-5-甲磺酰基-1H-苯并咪唑-1-基)-哌啶-1-基)-苯基)-9，9- 二甲基-9，10-二氢吖啶

方法同实施例1，80mg(0.21mmol)4-(2-异丙基氨基-5-甲磺酰基-1H-苯并咪唑-1-基) 哌啶盐酸盐与78mg(0.21mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体76mg(收率57.4％)。1H-NMR(d-DMSO，400MHz)：δ8.01(d，J＝1.7Hz，1H)，7.57(dd， J＝8.4，1.7Hz，1H)，7.38(d，J＝8.7Hz，2H)，7.34(d，J＝8.4Hz，1H)，6.97(d， J＝8.8Hz，2H)，4.41(br，1H)，4.28(dq，J＝13.2，6.5Hz，1H)，4.11(t，J＝12.2 Hz，1H)，3.87(d，J＝12.7Hz，2H)，3.04(s，3H)，2.92(t，J＝11.7Hz，2H)，2.54 (qd，J＝12.4，3.8Hz，2H)，1.98(d，J＝10.3Hz，2H)，1.71(s，6H)，1.35(d，J＝ 6.4Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：620.31[M+H]+

实施例4：10-(4-(4-(2-异丙基氨基-6-氰基-1H-苯并咪唑-1-基)-哌啶-1-基)-苯基)-9，9- 二甲基-9，10-二氢吖啶

方法同实施例1，65mg(0.20mmol)4-(2-异丙基氨基-5-氰基-1H-苯并咪唑-1-基)哌啶盐酸盐与74mg(0.20mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体 50mg(收率43.6％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ7.58(s，1H)，7.44(ddd，J＝15.7，9.6，4.8Hz，4H)，7.23(q，J＝8.7Hz，4H)，6.94(dt，J＝26.9，7.0Hz，4H)，6.33 (d，J＝7.9Hz，2H)，4.38-4.27(m，1H)，4.18-3.94(m，3H)，3.04(t，J＝12.0 Hz，2H)，2.59(dd，J＝21.1，12.1Hz，2H)，2.08(d，J＝11.7Hz，2H)，1.68(s，6H)，1.38(d，J＝6.3Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：567.33[M+H]+

实施例5：10-(4-(4-(2-甲基-1H-咪唑并[4，5-b]-吡啶-1-基)-哌啶-1-基)-苯基)-9，9-二甲基 -9，10-二氢吖啶

方法同实施例1，64mg(0.25mmol)4-(2-甲基-1H-咪唑并[4，5-b]-吡啶-1-基)哌啶盐酸盐与93mg(0.25mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体70mg (收率55.6％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.50(dd，J＝4.8，1.3Hz，1H)，7.84(d，J＝7.7Hz，1H)，7.46(dd，J＝7.6，1.6Hz，2H)，7.24(q，J＝9.0Hz，4H)，7.14 (dd，J＝8.1，4.8Hz，1H)，6.96(dtd，J＝25.5，7.3，1.4Hz，4H)，6.35(dd，J＝8.1， 1.2Hz，2H)，4.45(t，J＝12.2Hz，1H)，4.03(d，J＝12.7Hz，2H)，3.08(t，J＝12.0 Hz，2H)，2.77(s，3H)，2.74-2.61(m，2H)，2.10(dd，J＝12.4，2.4Hz，2H)，1.69 (s，6H)；ESI-MS(m/z)：500.28[M+H]+

实施例6：10-(4-(3-(6-氯-8-异丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)-氮杂环丁烷-1-基)-苯基)-9，9- 二甲基-9，10-二氢吖啶

方法同实施例1，50mg(0.16mmol)3-(6-氯-8-异丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)氮杂环丁烷盐酸盐与60mg(0.16mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体35mg(收率38.6％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.40(s，1H)，7.70(d，J＝7.6Hz，1H)，7.46(dd，J＝7.6，1.5Hz，2H)，7.28(d，J＝8.6Hz，2H)，7.03-6.84(m，6H)， 6.30(dd，J＝8.1，1.2Hz，2H)，5.63(m，1H)，4.49(m，3H)，4.32(dd，J＝9.8，2.4 Hz，2H)，1.69(s，6H)，1.37(d，J＝6.5Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：550.25[M+H]+

实施例7：10-(4-(3-(2-异丙基氨基-5-甲磺酰基-1H-苯并咪唑-1-基)-氮杂环丁烷-1-基)- 苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶

方法同实施例1，70mg(0.20mmol)3-(2-异丙基氨基-5-甲磺酰基-1H-苯并咪唑-1-基) 氮杂环丁烷盐酸盐与74mg(0.20mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体45mg(收率37.6％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ8.00(d，J＝1.8Hz，1H)， 7.59(dd，J＝8.3，1.8Hz，1H)，7.45(dd，J＝7.6，1.6Hz，2H)，7.28-7.22(m，3H)， 6.96(dtd，J＝26.7，7.3，1.4Hz，4H)，6.87-6.73(m，3H)，6.3l(dd，J＝8.1，1.3 Hz，2H)，5.21-5.12(m，1H)，4.49(t，J＝8.7Hz，2H)，4.40(dd，J＝9.4，2.9Hz， 2H)，4.33(dq，J＝13.2，6.6Hz，1H)，3.05(s，3H)，1.69(s，6H)，1.36(d，J＝6.5 Hz，6H)；ESI-MS(m/z)：592.27[M+H]+

实施例8：10-(4-(3-(2-异丙基氨基-6-氰基-1H-苯并咪唑-1-基)-氮杂环丁烷-1-基)-苯基) -9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶

方法同实施例1，60mg(0.20mmol)3-(2-异丙基氨基-5-氰基-1H-苯并咪唑-1-基)氮杂环丁烷盐酸盐与74mg(0.20mmol)10-(4-溴苯基)-9，9-二甲基-9，10-二氢吖啶反应得白色固体60mg(收率67.6％)。1H-NMR(CHLOROFORM-D，400MHz)：δ7.58-7.40(m，5H)，7.28(d，J＝8.6Hz，2H)，6.97(dddd，J＝14.8，8.7，7.3，1.4Hz，4H)，6.88-6.82(m， 2H)，6.32(dd，J＝8.1，1.3Hz，2H)，5.12(br，1H)，4.52(t，J＝8.6Hz，2H)，4.47 -4.33(m，3H)，1.69(s，6H)，1.38(d，J＝6.5Hz，6H).；ESI-MS(m/z)：539.29[M+H]+

三、生物活性测试实施例

一)测定方法

1、基因合成

由GENEWIZ合成含有Kozak序列、Afl II和Xho I限制性酶切位点的人源TRPV4基因，然后将其插入pcDNA5/FRT/TO载体。

2、CHO-TRPV4稳定细胞系的形成

将1x106个Flp-In-CHO细胞置于无任何抗生素的5ml完全培养基中，在T-25培养瓶中， 37℃、5％CO2下培养过夜

完全培养基：Ham’s F12K+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin+100μg/mLZeocin

转染当天，在实验前将培养基和转染试剂预热至RT

将24μl Lipofectamine 3000稀释于250μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium中

将8μg DNA(pOG44：pcDNA5/FRT-TO-TRPV4＝9∶1)稀释于250μL Opti-MEM IReduced Serum Medium中，轻轻混合，然后加入16μL P3000到稀释后的DNA，轻轻混合

将稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 3000轻轻混合，室温孵育5-10分钟

将复合物加入含细胞和5mL不含任何抗生素的新鲜完整培养基的T-25培养瓶，轻轻混合，在37℃，5％CO2下孵育24小时

转染24h后，用胰酶消化细胞，在不含zeocin的完全培养基中重新悬浮细胞，然后将所有细胞转移入T-225培养瓶中。在37℃、5％CO2下培养过夜后细胞融合约为30％

将培养基换为选择性培养基，37℃，5％CO2孵育

选择性培养基：Ham’s F-12K+10％FBS+1x Penicillin-Streptomycin+800μg/mLHygromycin B.

培养转染的CHO-TRPV4细胞，每3-4天更换一次选择培养基，直到集落形成(约10-14 天)

CHO-TRPV4阳性的克隆将被胰酶消化，并在选择性培养基中培养，进一步扩增和冷冻保存

3、抑制剂IC50滴定功能实验

用选择性培养基培养Flp-In-CHO TRPV4稳定细胞。保持细胞密度在近汇合

在384孔细胞培养板(Corning，3712)中每孔加入25μL细胞接种培养基(Ham’s F-12K +10％FBS)，装入6.5K细胞/孔，在37℃，5％CO2下孵育过夜

将20X组分A在室温下解冻，用含5mM probenecid的缓冲液(1X HBSS+20mM HEPES)稀释至2X，置于室温下。

将384孔板从培养箱中取出，室温平衡10min。通过Apricot移液装置将培养基换为缓冲液，最后一个洗涤步骤后在每个孔中保留20μL缓冲液，然后每个孔添加包含5mM丙磺舒的20μl 2X Component A，在200g下离心3-5s，室温下孵育2h

从10mM开始进行3倍的连续稀释，作为参考或测试化合物，用Echo移液系统将240nL 稀释后的化合物转移至384孔板(Corning，3657)，在200g下离心1min，然后添加40μL缓冲溶液至#3657板形成一个6X的化合物板。在室温下摇晃混合20min

准备6X GSK1016790A(180nM、120nM、60nM和30nM)

加入第5步中准备好的10μL 6X化合物至384孔细胞培养板，然后在200g下离心3-5s， RT孵育15-30min

通过FLIPR Tetra加入第6步中准备好的10μL GSK1016790A至384孔细胞培养板，通过FLIPR Tetra采集数据。

二)测定结果

按照上述方法，对目标化合物合成实施例中的实施例1化合物进行了体外抑制TRVP4活性测定试验，其抑制IC50值为205.9nM，与阳性对照药HC067047的活性相当。

活性测定滴定曲线见附图1.实施例1化合物对TRPV4的抑制活性滴定曲线。

咪唑类衍生物及其作为TRPV4抑制剂的用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。