专利摘要

本发明属于烟酸提取技术领域，具体涉及一种从牛肚中提取烟酸的方法，包括微波处理、高压脉冲电场处理、超临界二氧化碳萃取，本发明方法具有提取率高、提取时间短、产品质量稳定、工艺步骤少的特点，避免了贵重设备的使用，以及纳滤、超滤膜的使用，分离要求低。

权利要求

1.一种从牛肚中提取烟酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)微波处理：将牛肚、芦苇叶发酵液置于微波条件下处理10-20s；

2)高压脉冲电场处理：将步骤1)所得物置于高压脉冲电场下处理60-90s；

3)超临界二氧化碳萃取：将步骤2)所得物置于超临界CO2萃取仪器中，萃取压力20-25MPa，温度78-85℃，分离压力5-8MPa，温度50-55℃，萃取时间10-20min，收集分离物；

所述牛肚与芦苇叶发酵液的质量比为1：(5-8)；

所述芦苇叶发酵液为芦苇叶经枯草芽孢杆菌发酵所得物；

所述芦苇叶发酵液的制备方法为：

步骤1：将芦苇叶粉碎至目数为40-50目的物料；

步骤2：将芦苇叶浸泡入草酸溶液中1-3h，捞出，沥去多余溶液，得湿料，控制湿料的湿度在50-58％；

步骤3：将用量为湿料质量1-3％的枯草芽孢杆菌与湿料混合均匀，得混合物A；取蒸馏水，按照体积比1:1与混合物A混合，置于密闭容器中静置后，加入混合物质量0.2-0.4％的高锰酸钾溶液，搅拌均匀，先在35-45kHz下超声处理5-10min，进行水解反应20-30min，再在70-80kHz下超声处理5-10min，再进行水解反应20-30min；

步骤4：水解反应结束，将水解所得物装入纱布袋中，经离心分离，获得滤液和滤渣；所述离心分离条件是：5000-8000r/min的转速下离心3-8min，取滤液加入滤液体积(3-5)被的蒸馏水混合均匀；

所述高锰酸钾溶液的浓度为0.3-0.7mol/L；

所述微波处理的工作条件：功率为400-450W，温度为55-65℃；

所述高压脉冲电场处理的工作条件：脉冲电压5-8kV，脉冲频率50-60Hz。

2.如权利要求1所述从牛肚中提取烟酸的方法，其特征在于，所述草酸溶液的浓度为2-4mol/L。

3.如权利要求1所述从牛肚中提取烟酸的方法，其特征在于，所述水解的工作条件：温度55-75℃。

说明书

技术领域

本发明属于烟酸提取技术领域，具体涉及一种从牛肚中提取烟酸的方法。

背景技术

烟酸为白色或类白色粉末，通常又称之为尼克酸、维生素PP或维生素B3，分子式为C6H5NO2，是一类具有烟酸活性的吡啶-3-羧酸衍生物，不易潮解，耐高温，能升华。因为其分子结构有维生素B族的代表性结构，理化性质也有一定的维生素B族共有的特征，例如抗“3D”症，扩张血管等医学效果。烟酸在某些医学著作中又名抗癞皮病因子。烟酸对光、热、湿度、氧化还原等均不敏感，对重金属离子轻度敏感。在碱性条件下也能保证其稳定性。但是由于结构作用，烟酸具有可逆的氧化还原反应的特性。即使在较高温度下，烟酸依旧结构稳定，不易变性。

烟酸在人体中存在形式是其衍生物烟酰胺或尼克酰胺。烟酸是人体必需的13种维生素之一，易溶于水，极性强。烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的重要组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程。烟酸还以辅酶Ⅰ的形式参与蛋白质核糖基化作用反应，葡萄糖无氧酵解，戊糖的生物合成，丙酮酸盐的代谢，以及脂肪、氨基酸、蛋白质、嘌呤的代谢等。烟酸生成的NADPH还可以维持皮肤和神经系统的健康，尤其是能够与NH4+反应，在人体氨中毒的时候注射，减少对大脑的损伤，救治患者，同时作为葡萄糖耐量因子的组分，可以在体内随时促进胰岛素的调节。在饭后血糖升高或者饭前血糖不足时可双效调节。特别的，烟酸最重要的营养学效果即抑制胆固醇的合成，降低血液胆固醇浓度以及降低血液中血脂浓度。

目前，烟酸多采用合成方法或从植物体中提取而成，从动物体内提取烟酸的方法暂未见报道；牛肚爽脆可口，营养丰富，牛肚中应用较多的是肚领与百叶，同时，牛肚中也含有相对较多的烟酸成分，牛肚营养素含量如表1：

表1

由于牛肚中含有蛋白质是胶原蛋白，胶原蛋白具有独特的三重螺旋结构，这种结构能够保持胶原蛋白分子结构稳定，以及含有胆固醇含量较高，使得牛肚中其他营养物质难以提取。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种从牛肚中提取烟酸的方法。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一种从牛肚中提取烟酸的方法，包括如下步骤：

1)微波处理：将牛肚、芦苇叶发酵液置于微波条件下处理10-20s；

2)高压脉冲电场处理：将步骤1)所得物置于高压脉冲电场下处理60-90s；

3)超临界二氧化碳萃取：将步骤2)所得物置于超临界CO₂萃取仪器中，萃取压力20-25MPa，温度78-85℃，分离压力5-8MPa，温度50-55℃，萃取时间10-20min，收集分离物。

所述牛肚与芦苇叶发酵液的质量比为1：(5-8)。

所述芦苇叶发酵液为芦苇叶经枯草芽孢杆菌发酵所得物。

所述芦苇叶发酵液的制备方法为：

步骤1：将芦苇叶粉碎至目数为40-50目的物料；

步骤2：将芦苇叶浸泡入草酸溶液中1-3h，捞出，沥去多余溶液，得湿料，控制湿料的湿度在50-58％；

步骤3：将用量为湿料质量1-3％的枯草芽孢杆菌与湿料混合均匀，得混合物A；取蒸馏水，按照体积比1:1与混合物A混合，置于密闭容器中静置后，加入混合物质量0.2-0.4％的高锰酸钾溶液，搅拌均匀，先在35-45kHz下超声处理5-10min，进行水解反应20-30min，再在70-80kHz下超声处理5-10min，再进行水解反应20-30min；

步骤4：水解反应结束，将水解所得物装入纱布袋中，经离心分离，获得滤液和滤渣；所述离心分离条件是：5000-8000r/min的转速下离心3-8min，取滤液加入滤液体积(3-5)被的蒸馏水混合均匀。

所述草酸溶液的浓度为2-4mol/L。

所述高锰酸钾溶液的浓度为0.3-0.7mol/L。

所述每克芦苇叶中草酸溶液添加量为1800mL-3200mL。

所述静置的工作条件：温度为20-30℃，时间为30-45min。

所述水解的工作条件：温度55-75℃。

所述微波处理的工作条件：功率为400-450W，温度为55-65℃。

所述高压脉冲电场处理的工作条件：脉冲电压5-8kV，脉冲频率50-60Hz。

本发明中枯草杆菌的芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学物、抗静水压力等。枯草杆菌可生产各种制剂，如α-淀粉酶、蛋白酶、青霉素酶等。

有益效果：

本发明方法具有提取率高、提取时间短、产品质量稳定、工艺步骤少的特点，避免了贵重设备的使用，以及纳滤、超滤膜的使用，分离要求低。

本发明利用酶解辅助微波的方法，有效破坏动物体的细胞组织从而达到快速提取的效果，缩短了酶处理时间，利用微波热效应和非热效应，使得多种酶的活力得以充分发挥，有利于芦苇叶发酵液的高效利用，同时，还使得磨细的牛肚表面形成微小空隙，便于芦苇叶发酵液与牛肚内成分接触，并且，微波形成热效应会加速某些可溶性蛋白变性，该方法具有提取时间较短、提取效率较高、溶剂用量少的优点；利用高压脉冲电场，与微波发出的电磁波形成电磁场，进而实现烟酸与蛋白质、胆固醇等其他物质的分离，同时有保证烟酸结构不受破坏，有助于缩短超临界二氧化碳萃取时间，降低其工作条件；由于烟酸耐高温，而部分可溶性蛋白不耐高温，控制萃取温度会加速某些可溶性蛋白质变性，令其沉淀下来。

本发明所获得的芦苇叶发酵液除了含有抗氧化成分外，还是一种多酶体系，其中含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶，从酶催化机制来看，每一种酶分别催化各自的反应，所有反应依次连接构成一个代谢途径或代谢途径的一个部分，不仅提高了反应效率，还具有不同的催化活性，能够由于细胞组织的分解与破坏，具有活性高、效率高、效果佳的特点；同时，从抗氧化角度来看，能够防止蛋白质变性而造成酶解体系不稳定。

本发明先采用草酸浸泡芦苇叶，破坏了芦苇叶细胞组织，再利用恒温水浴，使得芦苇叶中成分得以释放，有利于枯草芽孢杆菌的培育作用，利用多频超声处理，使得磁性吸附材料能够吸收超声波释放出的电磁波进而被分解，同时利用超声波空化作用进一步破坏双层磷脂结构，同时利用高锰酸钾不仅能够促进草酸的催化作用，还能够起到消毒作用，防止有害菌滋生，同时利用二次超声处理，有助于热能消耗降低、缩短水解时间。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种从牛肚中提取烟酸的方法，包括如下步骤：

1)微波处理：将牛肚、芦苇叶发酵液置于微波条件下处理20s；

2)高压脉冲电场处理：将步骤1)所得物置于高压脉冲电场下处理90s；

3)超临界二氧化碳萃取：将步骤2)所得物置于超临界CO₂萃取仪器中，萃取压力25MPa，温度85℃，分离压力8MPa，温度50-55℃，萃取时间20min，收集分离物；

所述牛肚与芦苇叶发酵液的质量比为1：8；

所述芦苇叶发酵液为芦苇叶经枯草芽孢杆菌发酵所得物；

所述芦苇叶发酵液的制备方法为：

步骤1：将芦苇叶粉碎至目数为50目的物料；

步骤2：将芦苇叶浸泡入草酸溶液中3h，捞出，沥去多余溶液，得湿料，控制湿料的湿度在58％；

步骤3：将用量为湿料质量3％的枯草芽孢杆菌与湿料混合均匀，得混合物A；取蒸馏水，按照体积比1:1与混合物A混合，置于密闭容器中静置后，加入混合物质量0.4％的高锰酸钾溶液，搅拌均匀，先在45kHz下超声处理10min，进行水解反应30min，再在80kHz下超声处理10min，再进行水解反应30min；

步骤4：水解反应结束，将水解所得物装入纱布袋中，经离心分离，获得滤液和滤渣；所述离心分离条件是：8000r/min的转速下离心8min，取滤液加入滤液体积5倍的蒸馏水混合均匀；

所述草酸溶液的浓度为4mol/L；

所述高锰酸钾溶液的浓度为0.7mol/L；

所述每克芦苇叶中草酸溶液添加量为3200mL；

所述静置的工作条件：温度为30℃，时间为45min；

所述水解的工作条件：温度75℃；

所述微波处理的工作条件：功率为450W，温度为65℃；

所述高压脉冲电场处理的工作条件：脉冲电压8kV，脉冲频率60Hz。

实施例2

一种从牛肚中提取烟酸的方法，包括如下步骤：

1)微波处理：将牛肚、芦苇叶发酵液置于微波条件下处理10s；

2)高压脉冲电场处理：将步骤1)所得物置于高压脉冲电场下处理60s；

3)超临界二氧化碳萃取：将步骤2)所得物置于超临界CO₂萃取仪器中，萃取压力20MPa，温度78℃，分离压力5MPa，温度50℃，萃取时间10min，收集分离物；

所述牛肚与芦苇叶发酵液的质量比为1：5；

所述芦苇叶发酵液为芦苇叶经枯草芽孢杆菌发酵所得物；

所述芦苇叶发酵液的制备方法为：

步骤1：将芦苇叶粉碎至目数为40目的物料；

步骤2：将芦苇叶浸泡入草酸溶液中1h，捞出，沥去多余溶液，得湿料，控制湿料的湿度在50％；

步骤3：将用量为湿料质量1％的枯草芽孢杆菌与湿料混合均匀，得混合物A；取蒸馏水，按照体积比1:1与混合物A混合，置于密闭容器中静置后，加入混合物质量0.2％的高锰酸钾溶液，搅拌均匀，先在35kHz下超声处理5min，进行水解反应20min，再在70kHz下超声处理5min，再进行水解反应20min；

步骤4：水解反应结束，将水解所得物装入纱布袋中，经离心分离，获得滤液和滤渣；所述离心分离条件是：5000-8000r/min的转速下离心3min，取滤液加入滤液体积3倍的蒸馏水混合均匀；

所述草酸溶液的浓度为2mol/L；

所述高锰酸钾溶液的浓度为0.3mol/L；

所述每克芦苇叶中草酸溶液添加量为1800mL；

所述静置的工作条件：温度为20℃，时间为30min；

所述水解的工作条件：温度55℃；

所述微波处理的工作条件：功率为400W，温度为55℃；

所述高压脉冲电场处理的工作条件：脉冲电压5kV，脉冲频率50Hz。

实施例3

一种从牛肚中提取烟酸的方法，包括如下步骤：

1)微波处理：将牛肚、芦苇叶发酵液置于微波条件下处理15s；

2)高压脉冲电场处理：将步骤1)所得物置于高压脉冲电场下处理75s；

3)超临界二氧化碳萃取：将步骤2)所得物置于超临界CO₂萃取仪器中，萃取压力25MPa，温度80℃，分离压力6MPa，温度53℃，萃取时间15min，收集分离物；

所述牛肚与芦苇叶发酵液的质量比为1：7；

所述芦苇叶发酵液为芦苇叶经枯草芽孢杆菌发酵所得物；

所述芦苇叶发酵液的制备方法为：

步骤1：将芦苇叶粉碎至目数为45目的物料；

步骤2：将芦苇叶浸泡入草酸溶液中2h，捞出，沥去多余溶液，得湿料，控制湿料的湿度在55％；

步骤3：将用量为湿料质量2％的枯草芽孢杆菌与湿料混合均匀，得混合物A；取蒸馏水，按照体积比1:1与混合物A混合，置于密闭容器中静置后，加入混合物质量0.3％的高锰酸钾溶液，搅拌均匀，先在40kHz下超声处理8min，进行水解反应25min，再在75kHz下超声处理7min，再进行水解反应25min；

步骤4：水解反应结束，将水解所得物装入纱布袋中，经离心分离，获得滤液和滤渣；所述离心分离条件是：6000r/min的转速下离心5min，取滤液加入滤液体积4倍的蒸馏水混合均匀；

所述草酸溶液的浓度为3mol/L；

所述高锰酸钾溶液的浓度为0.5mol/L；

所述每克芦苇叶中草酸溶液添加量为2000mL；

所述静置的工作条件：温度为25℃，时间40min；

所述水解的工作条件：温度65℃；

所述微波处理的工作条件：功率为425W，温度为60℃；

所述高压脉冲电场处理的工作条件：脉冲电压7kV，脉冲频率55Hz。

实施例4

一种从牛肚中提取烟酸的方法，包括如下步骤：

1)微波处理：将牛肚、芦苇叶发酵液置于微波条件下处理10s；

2)高压脉冲电场处理：将步骤1)所得物置于高压脉冲电场下处理90s；

3)超临界二氧化碳萃取：将步骤2)所得物置于超临界CO₂萃取仪器中，萃取压力20MPa，温度85℃，分离压力6MPa，温度50-55℃，萃取时间15min，收集分离物；

所述牛肚与芦苇叶发酵液的质量比为1：6；

所述芦苇叶发酵液为芦苇叶经枯草芽孢杆菌发酵所得物；

所述芦苇叶发酵液的制备方法为：

步骤1：将芦苇叶粉碎至目数为40目的物料；

步骤2：将芦苇叶浸泡入草酸溶液中1h，捞出，沥去多余溶液，得湿料，控制湿料的湿度在50％；

步骤3：将用量为湿料质量3％的枯草芽孢杆菌与湿料混合均匀，得混合物A；取蒸馏水，按照体积比1:1与混合物A混合，置于密闭容器中静置后，加入混合物质量0.4％的高锰酸钾溶液，搅拌均匀，先在35kHz下超声处理5min，进行水解反应20min，再在76kHz下超声处理7min，再进行水解反应30min；

步骤4：水解反应结束，将水解所得物装入纱布袋中，经离心分离，获得滤液和滤渣；所述离心分离条件是：7000r/min的转速下离心5min，取滤液加入滤液体积5倍的蒸馏水混合均匀；

所述草酸溶液的浓度为3mol/L；

所述高锰酸钾溶液的浓度为0.6mol/L；

所述每克芦苇叶中草酸溶液添加量为3000mL；

所述静置的工作条件：温度为30℃，时间为45min；

所述水解的工作条件：温度55℃；

所述微波处理的工作条件：功率为450W，温度为55℃；

所述高压脉冲电场处理的工作条件：脉冲电压5kV，脉冲频率57Hz。

对比例1

与实施例3的区别在于：不加入高锰酸钾溶液。

对比例2

与实施例3的区别在于：不经过高压脉冲电场处理。

对比例3

与实施例3的区别在于：微波处理替换为超声波处理。

对比例4

与实施例3的区别在于：芦苇叶发酵液替换为复合液；所述复合酶液包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶；其中，所述复合酶液中蛋白酶2000u/ml，淀粉酶800u/ml，脂肪酶3000u/ml。

试验例1

对实施例以及对比例的烟酸含量进行测定，利用反相高效液相色谱法测定提取物成分，将实施例以及对比例所得物取溶于100mL乙醇溶液中，在波长262nm下测其吸光度；具体如下：所用试剂为烟酸标准对照品、甲醇(色谱纯)、己烷磺酸钠(sigma)、盐酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)，选取色谱柱为Supelco C18(2.5mm×250mm，4μm)，流动相选择甲醇-50nM乙烷磺酸钠(体积比为10：90)，流速为0.3mL/min，检测波长为262nm，运用既定条件分别对烟酸标准品和提取物进行试验，做出高效液相色谱。并通过梯度烟酸标准品浓度峰面积绘制的标准曲线，测定提取物中烟酸含量；

烟酸得率η(μg/100g)＝C×A×100/(m×2.5×10^-5)；式中：C为标准曲线烟酸质量浓度；A为稀释倍数；2.5为牛肚含量系数；m为样品的质量，g。

表1：各组所得物中烟酸含量

试验例2

降血脂和降低胆固醇效果研究分析

小鼠32只随机分为正常对照组和高脂组，分别饲予基础饲料和高脂饲料。其中基础饲料即用平时的饲料喂养不变，高脂饲料指每100g小鼠饲料中，再添加全脂乳粉15g，全脂奶油6g，蛋黄5g，炼乳10g，猪油5g。6周后发现高脂组肥胖小鼠平均体重比普通组小鼠重20％以上，说明此时造模成功。肥胖组小鼠再随机分为3组:食谱控制组(单纯控制食谱)、实施例3干预组(控制食谱+烟酸)、高脂对照组(继续高脂饮食)。正常对照组继续饲予基础饲料。干预8周后，处死全部小鼠，测定血脂指标，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)；同时以对比例进行相同实验；结果如下：

动脉粥样硬化指数(AI)＝(TC-HDL)/HDL，当AI≥4时，说明该实验组小鼠动脉硬化的指数大，极高几率患病或已经患病，当AI＜4时，说明该实验组小鼠患病几率很小。

一种从牛肚中提取烟酸的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。