专利摘要
本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT‑2(BacillusvelezensisLT‑2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:M2019904，保藏日期为2019年11月7日。本发明还公开了贝莱斯芽孢杆菌在合成γ‑聚谷氨酸中的应用。该菌株以非粮原料甘蔗汁为碳源，花生饼粉为有机氮源，氯化铵为无机氮源发酵合成γ‑聚谷氨酸的产量可达47.61g/L，生产速率高达0.61g/L/h。本发明公开的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT‑2能够不依赖谷氨酸发酵合成γ‑聚谷氨酸，总糖转化率高达47.61％，所述操作方法简单，成本较低，极具工业化推广应用前景，同时为γ‑聚谷氨酸的生物合成提供一种新工艺。
权利要求
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LT-2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019904，保藏日期为2019年11月7日。
2.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌在制备γ-聚谷氨酸的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)LT-2接种于发酵培养基中进行好氧培养，制备γ-聚谷氨酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基包括如下组分：碳源10～120g/L，氮源2～20g/L，金属盐1.0～8.0g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为甘油、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘蔗汁中任意一种或几种的组合；
所述的氮源为牛肉膏、玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉、氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵和硝酸铵中任意一种或几种的组合；
所述的金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰和氯化钙中任意一种或几种的组合。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包含如下组分：甘蔗汁10～80g/L、花生饼粉1～8g/L、氯化铵5～25g/L，磷酸二氢钾2～8g/L，硫酸镁0.2～1.2g/L，硫酸锰0.002～0.008g/L，用氨水将发酵液初始pH调至6.0～7.5。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述碳源为甘蔗汁、蔗糖中的一种或两者的组合物。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的好氧培养条件是：初始pH为6.5～7.5，培养温度为28～32℃；
当好氧培养为摇瓶培养时，摇瓶接种量为每100mL发酵液接种1～8mL种子液，培养时间36～54h；
当好氧培养为发酵罐培养时，发酵罐接种量为每100mL发酵液接种1～15mL种子液，发酵方式为分批补料法，通气比为1.0～1.4VVM，培养时间48～96h。
说明书
技术领域
本发明具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在合成γ-聚谷氨酸中的应用，属于微生物学、生物工程技术和化工技术领域。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid,γ-PGA)是由500-5000个谷氨酸残基组成，呈直链纤维状，相对分子质量通常在100～1000kDa。由于其侧链上含有大量活性较高的游离羧基，使其具有吸水保湿、螯合元素等特点。因此，γ-聚谷氨酸在日化、食品、环保、农业和饲料工业等领域具有广泛的应用前景。目前报道的生产菌株大多数是谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸合成菌株，如B.subtilis NX-2、B.subtilis RKY3和B.subtilis ZJU-7等均需在培养基中加入谷氨酸才能合成γ-聚谷氨酸，产物浓度可达20-50g/L。但由于培养基中需加入大量谷氨酸，造成成本较高，使γ-聚谷氨酸价格高达3000元/kg，因此其用途主要局限在日化领域，限制了其在农业和饲料领域的应用。而另一类谷氨酸非依赖型γ-聚谷氨酸合成菌株由于不需要额外添加谷氨酸，大大降低了γ-聚谷氨酸发酵成本，如B.subtilis C10、B.methylotrophicus SK19.001和B.amyloliquefaciens LL3等，然而这类菌株的γ-聚谷氨酸产率极低，至今还未有用于生产的报道，是目前γ-聚谷氨酸微生物合成领域的研究热点。
经检索，目前现有报道技术只针对贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis在添加外源谷氨酸的条件下才能发酵生产γ-聚谷氨酸，且存在原料利用率低和生产成本高等问题，因此难以大规模工业化生产，从而限制了γ-聚谷氨酸的大规模开发与应用。而本发明首次报道了贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2能在不添加谷氨酸的条件下(即非谷氨酸依赖型)以甘蔗汁为原料发酵合成γ-聚谷氨酸的新方法。此外，本发明所使用的贝莱斯芽孢杆菌为食品安全性微生物，具有巨大的工业化应用价值。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的问题是提供一株非依赖谷氨酸利用甘蔗汁合成γ-聚谷氨酸的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。
本发明还要解决的技术问题是提供上述贝莱斯芽孢杆菌的应用。
技术方案：为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
本发明从酒糟中筛选得到一株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT-2(Bacillus velezensis LT-2)，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：M2019904，保藏日期为2019年11月7日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。
所属菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。
表1菌落形态学特征与生理生化特性
2、16S rDNA序列分析：
测得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQIDNo.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。
上述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2利用甘蔗汁非依赖谷氨酸发酵合成γ-聚谷氨酸的应用也在本发明的保护范围之内。
具体的应用方法为：将贝莱斯芽孢杆菌LT-2接种于斜面固体培养基，然后转接到种子培养基，最后接种于不含谷氨酸的发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有γ-聚谷氨酸。
其中，所述的发酵培养基包括如下组分：碳源10～120g/L，氮源2～20g/L，金属盐1.0～8.0g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5。
其中，所述的碳源为甘油、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘蔗汁中任意一种或几种的组合；
所述的氮源为牛肉膏、玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉、氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵和硝酸铵中的任意一种或几种的组合；
所述的金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰和氯化钙中的任意一种或几种的组合。
其中，所述发酵培养基包含如下组分：甘蔗汁10～80g/L、花生饼粉1～8g/L、氯化铵5～25g/L，磷酸二氢钾2～8g/L，硫酸镁0.2～1.2g/L，硫酸锰0.002～0.008g/L，用氨水将发酵液初始pH调至6.0～7.5。
作为优选，所述碳源为甘蔗汁、蔗糖中的一种或两者的组合物。
作为优选，所述的好氧培养条件是：初始pH为6.5～7.5，培养温度为28～32℃；
当好氧培养为摇瓶培养时，摇瓶接种量为1～8％(体积分数)，培养时间36～54h；
当好氧培养为发酵罐培养时，发酵罐接种量为1～15％(体积分数)，发酵方式为分批补料法，通气比为1.0～1.4VVM，培养时间48～96h。
本发明所述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2及其所述菌在制备γ-聚谷氨酸的应用，依次包括以下步骤：
1.培养基配制：
(1)斜面培养基成分为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5，优选pH为7；
(2)液体种子培养基为：蔗糖2～10g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5，优选pH为7；
(3)固体种子培养基为：蔗糖2～10g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5，优选pH为7；
(4)发酵培养基：碳源10～120g/L，氮源2～20g/L，金属盐1.0～8.0g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5，优选pH为7；
其中，所述碳源为甘油、蔗糖、麦芽糖、甘蔗汁、葡萄糖和乳糖中任意一种或几种的组合，优选碳源为甘蔗汁，最优为选甘蔗汁添加后培养基中总糖浓度为50g/L；
所述氮源包括无机氮源和有机氮源，所述的有机氮源为牛肉膏、玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉的任意一种或几种的组合；所述的有机氮源优选为花生饼粉，所述花生饼粉的浓度为5g/L；所述的无机氮源为氯化铵、硫酸铵、尿素、磷酸氢二铵和硝酸铵中的任意一种或几种的组合，所述无机氮源优选为氯化铵，所述氯化铵的浓度优选为15g/L；
所述的金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种的组合，所述金属盐优选为磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰的组合物，其中最优选的金属盐浓度为硫酸镁0.80g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸锰0.005g/L。
最优选的发酵培养基包含如下组分：甘蔗汁10～80g/L、花生饼粉1～8g/L、氯化铵5～25g/L，磷酸二氢钾2～8g/L，硫酸镁0.2～1.2g/L，硫酸锰0.002～0.008g/L，利用氨水将发酵液初始pH调至6.0～7.5。其中所述甘蔗汁由新鲜甘蔗压榨而成，最佳培养基总糖浓度为50g/L。
2.菌种选择：
选已保藏菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。
3.菌种活化：
将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养16～24h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，24～36℃培养16～24h，得到活化菌种备用；
4.种子液制备：
取步骤(3)中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于含有种子液的摇瓶中，置于转速为180rpm的摇床上，温度为24～36℃培养16h，得到发酵种子液；
5.摇瓶发酵培养：
将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以1％～8％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵培养基中，置于转速为200rpm的摇床上，24～36℃培养36～54h；当发酵液中γ-聚谷氨酸浓度不再上升时，停止发酵；
6.发酵罐发酵培养：
将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以1％～15％(v/v)的接种量，将种子液接种于发酵罐中，装液量为3L/5L，转速为200～500rpm，通气比为1.0～1.2VVM，培养温度为24～36℃，初始pH为6.5～7.5，培养48～96h；当发酵液中γ-聚谷氨酸浓度不再上升时，停止发酵；
7.γ-聚谷氨酸含量测定：
通过凝胶渗透色谱法测定γ-聚谷氨酸的浓度：取步骤(5)或(6)中的发酵液稀释5倍，12,000rpm离心20min除去菌体，上清用0.22μm的滤膜过滤，置于进样瓶中待用。样品采用示差检测器检测，色谱柱：Superpose
8.γ-聚谷氨酸的提取：
取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵液稀释5倍后于12,000rpm条件下离心除去菌体，上清液在65℃条件下，旋转蒸发浓缩为原体积的1/5，加入3～5倍体积的无水乙醇，离心取沉淀；将沉淀用双蒸水复溶后，用0.22μm滤膜过滤去除菌体碎片等不溶物，再用双蒸水过夜透析，透析液经旋转蒸发浓缩后用HCl调pH至2.5，并快速加入8倍体积的1:1(v/v)的丙醇/乙醚溶液，得到H型γ-聚谷氨酸沉淀物，经真空干燥箱冷冻干燥得H型γ-聚谷氨酸纯品。
9.γ-聚谷氨酸的鉴定
采用高效液相色谱仪、红外光谱仪和核磁共振仪来鉴定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物。
①产物水解组分的分析
取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵提纯产物0.1g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于30℃水浴60min，取出后加入84mL双蒸水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，得到贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物水解液，将水解液进行液相色谱分析。
②分子量测定
利用凝胶渗透色谱法测定B.velezensis LT-2发酵产物的分子量，将提纯产物复溶后采用0.22μm滤膜去除不溶物，置于进样瓶中待用。色谱柱：Shodex Ohpak SB-806M HQ；色谱柱：Superpose
③红外光谱与核磁共振分析
利用红外光谱仪测定贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵提纯产物的红外光谱图：取样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm
有益效果：本发明具有如下优势：
(1)本发明首次筛选得到一株非谷氨酸依赖的γ-聚谷氨酸合成菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。
(2)该菌株能够以甘蔗汁和/或蔗糖为廉价碳源，在不添加谷氨酸的情况下发酵合成γ-聚谷氨酸，γ-聚谷氨酸的产量可达到47.61g/L，γ-聚谷氨酸的分子量为1500kDa，底物转化率最高达47.61％，生产速率为0.61g/L/h，大大降低了生产成本，而且操作简单，这对于γ-聚谷氨酸的生产和甘蔗资源的拓展应用具有十分重要的社会与经济意义。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌LT-2的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2的系统发育树(B)。
图2为谷氨酸标准品高效液相色谱图(A)；贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸水解物高效液相色谱图(B)。
图3：左图为γ-聚谷氨酸分子量测定标准曲线；右图为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的分子量分布图。
图4为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的红外光谱图。
图5为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的核磁共振图(NMR)
图6为贝莱斯芽孢杆菌LT-2产γ-聚谷氨酸的核磁共振图(NMR)
图7碳源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图8碳源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图9有机氮源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图10有机氮源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图11无机氮源种类对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图12无机氮源浓度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图13温度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图14pH对贝莱斯芽孢杆菌LT-2合成微生物多糖的影响。
图15为贝莱斯芽孢杆菌LT-2摇瓶水平合成γ-聚谷氨酸进程曲线。
图16为50L发酵罐分批补料合成γ-聚谷氨酸进程曲线。
图17为1t发酵罐分批补料合成γ-聚谷氨酸进程曲线。
图18为1t发酵罐中外源添加谷氨酸钠合成γ-聚谷氨酸进程曲线。
具体实施方式
根据下列实施例可以更好的理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的分离筛选。
该实施例所用培养基的组成如下：
(1)富集液体培养基：蔗糖20g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.005g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5；
(2)固体筛选培养基：蔗糖20g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵3g/L，磷酸氢二钾5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH值调至6.5～7.5；
(3)发酵培养基：蔗糖50g/L，花生饼粉5g/L、氯化铵15g/L、磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁0.8g/L，硫酸锰0.005g/L，溶剂为水，pH值6.5～7.5；
该实施例的具体操作过程如下：
筛选γ-聚谷氨酸产生菌步骤如下：从50份酒糟中各取2g分别接入装有富集培养基的三角摇瓶中，装液量为80mL/500mL，在32℃、180rpm条件下富集培养24h。取3.2mL培养液转接到相同的液体富集培养基中在相同条件下进行第二次富集培养，培养24h，再反复1次，即富集3次。在无菌条件下，将第三次富集的培养液稀释至10
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的鉴定。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的基因组DNA，以上游引物27F和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测序结果与GeneBank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程序进行同源性比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体命名为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物的鉴定
①水解产物分析
取B.velezensis LT-2发酵提纯产物0.1g于水解瓶中，加3mL的72％的硫酸，混合，于30℃水浴60min，取出后加入双蒸水稀释到5％，混匀。经过121℃，1h处理后，取出冷却，调节pH至6.5，得到发酵提纯产物水解液，发酵提纯产物水解液液相色谱结果如图2所示。从氨基酸高效液相色谱图中可以看出，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2发酵产物共有1种氨基酸组分，且与谷氨酸标准品出峰时间一致，因此可以初步确定发酵产物为γ-聚谷氨酸。
②分子量测定
利用凝胶渗透色谱法测定B.velezensis LT-2发酵产物的分子量，将提纯产物复溶后采用0.22μm滤膜去除不溶物，置于进样瓶中待用。色谱柱：Shodex Ohpak SB-806M HQ；色谱柱：Superpose
③红外光谱与核磁共振分析
利用红外光谱仪测定B.velezensis LT-2发酵提纯产物的红外图谱，取样品0.2mg与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸碳源种类的优化
本实施例说明不同种类的碳源对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于含40g/L(发酵液中总糖浓度)甘油(Gly)、葡萄糖(Glc)、乳糖(Lac)、麦芽糖(Mal)、蔗糖(Suc)和甘蔗汁(SJ)的发酵培养基中，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取不同碳源发酵液进行步骤7的操作，计算γ-聚谷氨酸的含量。以蔗糖和甘蔗汁为碳源所得γ-聚谷氨酸产量最高，考虑到甘蔗汁成本较低，因此选用甘蔗汁为最佳碳源。γ-聚谷氨酸产量达到12.68g/L，总糖转化率为31.70％，生产速率为0.26g/L/h(图7)。
实施例5：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸碳源浓度的优化
本实施例说明不同总糖(甘蔗汁)浓度对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于总糖浓度为20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L的发酵培养基中，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取不同糖浓度的发酵液，进行步骤7操作，计算γ-聚谷氨酸的含量，测得当总糖浓度为50g/L时，总糖转化率最高为32.64％，γ-聚谷氨酸产量达到16.32g/L，生产速率为0.34g/L/h。因此，选用50g/L的糖浓度为进行后续发酵(图8)。
实施例6：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸有机氮源种类的优化
本实施例说明不同有机氮源对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于5g/L牛肉膏(BE)、玉米浆(CSL)、黄豆饼粉(SC)、花生饼粉(PM)、蛋白胨(PT)和酵母粉(YEP)的发酵培养基中，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取不同有机氮源发酵液进行步骤7的操作，计算γ-聚谷氨酸的含量，以牛肉膏和花生饼粉为有机氮源时γ-聚谷氨酸产量达到最高，且产量相当，约为16.89g/L，总糖转化率最高为33.78％，生产速率为0.35g/L/h。考虑到花生饼粉是花生油生产的下脚料，价格较低有利于降低生产成本。因此，选用花生饼粉作为最佳有机氮源(图9)。
实施例7：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸花生饼粉浓度的优化
本实施例说明不同花生饼粉浓度对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于含1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L和8g/L花生饼粉的发酵培养基中，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取各个浓度花生饼粉发酵液进行步骤7的操作，计算γ-聚谷氨酸的含量。当花生饼粉浓度为5g/L时γ-聚谷氨酸产量达到最高为17.31g/L，总糖转化率为34.62％，生产速率为0.36g/L/h。因此，选用5g/L的花生饼粉进行后续发酵(图10)。
实施例8：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸无机氮源种类的优化
本实施例说明不同无机氮源对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于5g/L氯化铵(A)、硫酸铵(B)、尿素(C)、磷酸氢二铵(D)和硝酸铵(E)的发酵培养基中，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取不同无机氮源发酵液进行步骤7的操作，计算γ-聚谷氨酸的含量，以氯化铵为无机氮源时γ-聚谷氨酸产量达到17.88g/L，总糖转化率为35.76％，生产速率为0.37g/L/h。因此，选用氯化铵为最佳无机氮源(图11)。
实施例9：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸氯化铵浓度的优化
本实施例说明不同氯化铵浓度对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于含3g/L、6g/L、9g/L、12g/L和15g/L氯化铵的发酵培养基中，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取各个浓度氯化铵发酵液进行步骤7的操作，计算γ-聚谷氨酸的含量。当氯化铵浓度为15g/L时γ-聚谷氨酸产量最高为18.91g/L，总糖转化率为37.82％，生产速率为0.39g/L/h。因此，选用15g/L的氯化铵进行后续发酵(图12)。
实施例10：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸温度的优化
本实施例说明不同温度对贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵制备γ-聚谷氨酸产量的影响，将发酵好的种子液5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为6.8，于30℃，200rpm振荡培养，培养温度分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，发酵培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，分别取各个温度的发酵液进行步骤7的操作，计算γ-聚谷氨酸的含量，得出当温度为30℃时γ-聚谷氨酸含量最高位19.20g/L，总糖转化率为38.40％，生产速率为0.40g/L/h。因此，选用30℃为最佳发酵温度(图13)。
实施例11：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸pH的优化
本实施例说明不同pH值对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，于30℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，培养pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的发酵培养基中，取各pH值下的发酵液进行步骤7的操作，通过标准曲线来计算γ-聚谷氨酸的含量，得出当pH值为7.0时γ-聚谷氨酸含量最高为19.52g/L，总糖转化率为39.04％，生产速率为0.41g/L/h。因此，选用pH值7.0为最佳发酵pH值(图14)。
实施例12：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵合成γ-聚谷氨酸的所需金属盐种类及其浓度的优化
本实施例说明不同金属盐及其浓度对菌株发酵制备γ-聚谷氨酸的影响，将发酵好的种子液以5％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各金属盐浓度中，经过单因素变量实验如下：
硫酸镁：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2g/L以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.80g/L；
磷酸二氢钾：1、2、3、4、5、6、7、和8g/L以及对照组，磷酸二氢钾最佳浓度为5g/L；
磷酸氢二钾：1、2、3、4、5、6、7、和8g/L以及对照组，磷酸氢二钾最佳浓度为0g/L(不添加)；
硫酸锰0.001、0.002、0.003、0.004、0.005和0.006g/L以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.005g/L；
氯化钙：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，氯化钙最佳浓度为0g/L(不添加)。
对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属盐设置3组平行对照，初始pH值为7.0，于30℃，200rpm振荡培养，培养基装液量为80mL/500mL三角摇瓶，发酵培养48h，取各金属盐浓度下的发酵液进行步骤7的操作计算γ-聚谷氨酸的含量。当在上述最优金属盐条件下，菌株产γ-聚谷氨酸产量为20.61g/L，总糖转化率为41.22％，生产速率为0.43g/L/h(图15)。
实例13：50L发酵罐分批补料合成γ-聚谷氨酸
将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，32℃静置培养16h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，32℃培养16h，得到活化菌种备用；取活化好的菌种，无菌条件下接种2环于含有种子培养基的摇瓶中，置于转速为180rpm的摇床上，温度为32℃培养16h，得到发酵种子液；将种子液按体积比为5％的接种量接入无菌发酵培养基中甘蔗汁50g/L(指甘蔗汁加入发酵液中后的总糖浓度，当发酵液中总糖浓度低于5g/L时补加甘蔗汁)、花生饼粉5g/L、氯化铵15g/L、硫酸镁0.80g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸锰0.005g/L。发酵罐总装液量为30L，发酵温度为30℃，搅拌转速200rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.0，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.0左右；发酵时间为96小时。每隔6小时取样测定发酵液中的γ-聚谷氨酸浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中γ-聚谷氨酸含量，发现经过一次补料γ-聚谷氨酸产量达到43.87g/L，总糖转化率为43.87％，生产速率为0.46g/L/h(图16)。
实例14：1t发酵罐分批补料合成γ-聚谷氨酸
将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2种子液按体积比为8％的接种量接入无菌发酵培养基中：甘蔗汁50g/L(指甘蔗汁加入发酵液中后的总糖浓度，当发酵液中总糖浓度低于5g/L时补加甘蔗汁)、花生饼粉5g/L、氯化铵15g/L、硫酸镁0.80g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸锰0.005g/L。，发酵罐总装液量700L，发酵温度为30℃，搅拌转速260rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.0，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.0左右；发酵时间96小时。每隔6小时取样测定发酵液中的γ-聚谷氨酸浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量达到47.61g/L，总糖转化率为47.61％，生产速率为0.61g/L/h(图17)。
实例14：外源添加谷氨酸钠合成γ-聚谷氨酸
将发酵好的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2种子液按体积比为8％的接种量接入无菌发酵培养基中：甘蔗汁50g/L(指甘蔗汁加入发酵液中后的总糖浓度)、谷氨酸钠40g/L、花生饼粉5g/L、氯化铵15g/L、硫酸镁0.80g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸锰0.005g/L。中，发酵罐总装液量700L，发酵温度为30℃，搅拌转速260rpm，通气量为1.2VVM进行发酵；发酵初始pH值为7.0，发酵过程中开启pH自动控制装置，利用氨水或盐酸控制发酵液pH值在7.0左右；发酵时间80小时。每隔6小时取样测定发酵液中的γ-聚谷氨酸浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量达到54.11g/L，生产速率为0.68g/L/h(图18)。
最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110>常熟理工学院
<120>一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成γ-聚谷氨酸中的应用
<160>1
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>1396
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg60
gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatgcttgt 120
ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 180
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cggtgaggta accttt1396
一株贝莱斯芽孢杆菌株及其在合成γ-聚谷氨酸中的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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