专利摘要

本发明公开了一株白色杆菌Albibactersp.zjut528及其在拆分甲霜灵中的应用；本发明菌株催化外消旋甲霜灵的不对称水解，反应18h，底物转化率达到47.5％，eep达到99.9％，主要产物为(R)‑甲霜灵酸，然后用(R)‑甲霜灵酸和甲醇反应合成(R)‑甲霜灵。该工艺与用商品酶LipasePS拆分(生产外消旋甲霜灵的)中间体生产(R)‑甲霜灵(Oh‑JinPark,2006)的工艺相比，催化剂成本低得多(催化剂是菌体细胞)、产品的ee值更高(产品的ee值达到99.3％)。

权利要求

1.白色杆菌(Albibacter sp.)zjut528，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年10月29日，保藏编号CCTCC NO：M2015650，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

2.一种权利要求1所述白色杆菌zjut528在拆分甲霜灵中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用以白色杆菌zjut528经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋甲霜灵为底物，以异丙醇为助溶剂，以pH7.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～35℃、150～200r/min条件下进行催化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-甲霜灵酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计为25～40g/L反应体系，所述底物甲霜灵加入量为30～50mmol/L反应体系，所述助溶剂加入终浓度为10～20ml/L反应体系。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：

(1)将白色杆菌zjut528接种至斜面培养基，在30℃培养2～3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值自然；

(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然；

(3)将种子液以体积浓度1％～10％接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min的条件下培养48h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1.0g/L，甲醇5.0g/L，甲醇在培养基灭菌后，接种前加入，溶剂为水，pH值自然。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，用氨水调节反应液的pH值至8-9，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除有机相a得到水相a，将水相a用盐酸调节pH值为3～5，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除水相b得到有机相b，再将有机相b在35℃～60℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得R-甲霜灵酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述R-甲霜灵酸制备R-甲霜灵的方法为：取R-甲霜灵酸溶于无水甲醇中，冰浴滴加二氯亚砜，滴加完毕后冰浴反应10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至无液体流出，获得浓缩液；将浓缩液溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na₂CO₃水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次，去除洗涤液后加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸至干，得到R-甲霜灵；所述二氯亚砜与R-甲霜灵酸物质的量之比为1.1:1。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株白色杆菌Albibacter sp.zjut528及在生物催化领域的应用，该菌株具有很好的、手性选择性拆分甲霜灵的能力。利用该拆分能力，建立了一条生物法生产R-甲霜灵的新工艺。

(二)背景技术

随着环保观念的加强和可持续发展战略的实施，高效、低毒、高活性、低残留已成为农药发展的必然趋势。在一些手性化合物相互作用时，不同对映体往往表现出不同活性。有些化合物一种对映体活性是高效，另一种对映体却是低效甚至起相反的作用。甲霜灵是一种具有保护、治疗作用的白色粉末状内吸性酰胺类杀菌剂，也是一种手性农药。研究表明，甲霜灵的R-异构体的活性比S-异构体高20～30倍，而且药效持续时间更长，因此大大减少了施药次数，延长了施药周期。单一甲霜灵R-异构体较消旋体在环境中降解速度更快，减少了对环境影响。目前市售的典型精甲霜灵是由97.5％的R-体以及2.5％的S-体构成。

单一对映异构体可以由化学、酶法或者化学-酶法等合成。目前，大量的手性化合物的制备是通过化学拆分法完成的。生物催化优于化学合成的优点是：酶催化反应通常表现有高的立体选择性和区域选择性，而且它们能够在温和的条件下进行，因此可以避免使用较严酷的条件，从而避免引起异构化、外消旋化、差向异构化和重排问题的发生。此外，生物催化法可以减少对环境污染，节省成本，符合当今绿色化学发展趋势。

(三)目前的R-甲霜灵(产品精甲霜灵)主要采用化学法合成。有文献报道用生物催化剂合成R-甲霜灵(Oh-Jin Park,2005,2006)，方法是用生物法拆分生产普通甲霜灵(外消旋)的中间体2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，然后利用所得R-中间体进一步合成R-甲霜灵。未见直接通过拆分外消旋甲霜灵生产R-甲霜灵的报道。本发明菌株细胞可以直接水解拆分外消旋甲霜灵，有很高的立体选择性和较高的催化速率。水解获得的R-甲霜灵酸可用于生产R-甲霜灵，生产工艺见图7所示。

(四)发明内容

本发明目的是提供一种具有很好立体选择性的菌株——白色杆菌Albibacter sp.zjut528及其在拆分农药甲霜灵的应用。用该菌水解外消旋甲霜灵得到R-甲霜灵酸，用R-甲霜灵酸和甲醇反应合成R-甲霜灵。这是一条生物法生产R-甲霜灵的新工艺，国内外尚无报道。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株——白色杆菌(Albibacter sp.)zjut528，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年10月29日，保藏编号CCTCC NO：M2015650，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明还提供一种所述白色杆菌zjut528在拆分甲霜灵中的应用，具体所述的应用以白色杆菌zjut528经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋体甲霜灵为底物，以异丙醇为助溶剂，以pH7.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～35℃、150～200r/min(优选30℃、180rpm)条件下进行甲霜灵的拆分反应，反应完全后，获得含(S)-甲霜灵和(R)-甲霜灵酸的反应液，将反应液分离纯化，获得(R)-甲霜灵酸。

进一步，所述催化剂用量以湿菌体重量计为25～40g/L反应体系，优选40g/L反应体系，所述底物甲霜灵加入量为30～50mmol/L反应体系，优选36mmol/L反应体系，所述助溶剂的加入终浓度为10～20mL/L反应体系，优选20mL/L反应体系。

进一步，本发明所述湿菌体的制备方法为：

(1)将白色杆菌zjut528接种至斜面培养基，在30℃培养2～3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；

(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在30℃培养48h，获得种子液；所述种子培养基浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；

(3)将种子液以体积浓度1％～10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min的条件下培养48h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1g/L，甲醇5g/L(甲醇在培养基灭菌后，接种前加入)，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min。

进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，用氨水调节反应液的pH值至8-9，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除有机相a得到水相a，将水相a用盐酸调节pH值为3～5，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除水相b得到有机相b，再将有机相b在35℃～60℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得R-甲霜灵酸；取R-甲霜灵酸溶于无水甲醇中(优选无水甲醇体积用量以R-甲霜灵酸质量计为8ml/g)，冰浴中滴加二氯亚砜，滴加完毕后冰浴反应10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至无液体流出，获得浓缩液；将浓缩液溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na₂CO₃水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次，去除洗涤液后加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸至干，得到R-甲霜灵；所述二氯亚砜与R-甲霜灵酸物质的量之比为1.1:1。所得(R)-甲霜灵产品的ee值达到99.3％。

本发明所述有机相a、有机相b、水相a、水相b是指不同步骤分离得到的有机相和水相，字母本身没有含义。

与现有技术相比，本发明的优势主要体现在：

本发明首次报道了一株新菌株--白色杆菌Albibacter sp.zjut528，它能选择性拆分消旋甲霜灵，有很高的选择性和较高的拆分速率。该菌株催化36mmol/L外消旋甲霜灵的水解，30℃反应18h，底物转化率达到47.5％，ee_p达到99.9％，主要产物为(R)-甲霜灵酸。国内外尚无用生物催化剂不对称水解甲霜灵的报道。

此外，本发明建立了一条用白色杆菌Albibacter sp.zjut528细胞作催化剂拆分外消旋甲霜灵生产(R)-甲霜灵的新工艺，与用商品酶Lipase PS拆分(生产外消旋甲霜灵的)中间体生产(R)-甲霜灵(Oh-JinPark,2006)的工艺相比，催化剂成本低得多(催化剂是菌体细胞)、产品的ee值更高(产品的ee值达到99.3％)。

(五)附图说明

图1为白色杆菌zjut528在固体培养基上培养3d的菌落形态；

图2为显微镜下，白色杆菌zjut528经革兰氏染色后的菌株形态；

图3为白色杆菌zjut528的16S rDNA系统发育分析树；

图4为未加菌体催化拆分外消旋体甲霜灵的正相HPLC图；

图5为加入菌体催化拆分外消旋体甲霜灵9h正相HPLC图；

图6为加入菌体催化拆分外消旋体甲霜灵18h正相HPLC图。

图7为用菌体细胞作催化剂，拆分外消旋甲霜灵生产R-甲霜灵的生产工艺图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1白色杆菌Albibacter sp.zjut528菌株筛选

1.富集培养：

取5g土样置于250mL三角瓶中，加入100mL甲霜灵富集培养基(甲霜灵初始浓度为20mg/L)振荡培养(30℃，150rpm)1周，取5mL上层浊液于100mL新鲜的富集培养基中继续培养1周，重复上述操作过程2次，每次接种的培养物均取自于上次培养所得的培养基。取第三周所得的培养液5mL于新的甲霜灵富集培养基中，此时甲霜灵浓度提高到50mg/L，仍按上述操作连续培养2周，再按上述操作将甲霜灵浓度提高到100mg/L连续培养2周，将发酵液进行高压液相色谱(HPLC)分析，研究甲霜灵的降解情况。取最后一次所得的培养液5mL于新的甲霜灵富集培养基中，此时甲霜灵浓度提高到1g/L，连续培养2周，HPLC分析培养液中甲霜灵的降解情况。

甲霜灵富集培养基：K₂HPO₄·3H₂O 2.1g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，NaCl0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂ 0.025g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，微量元素液10mL/L，甲霜灵(如上述不同富集阶段加入20mg/L、50mg/L、100mg/L或1g/L甲霜灵)，溶剂为水，调节pH值为7.0，121℃灭菌20min。

微量元素液终浓度组成：CoCl₂ 0.1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CuSO₄0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，H₃BO₃ 0.01g/L，Al(SO₄)₂·12H₂O 0.01g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01g/L，EDTA·2Na：1g/L，配制方法：取1gEDTA·2Na溶于800mL去离子水中，再将其他组分依次加入，最后加水至1L。

2.初筛：

从富集培养基中取1mL甲霜灵降解效果较好的培养液加入到9ml无菌水中进行倍比稀释，梯度分别为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7涂布到甲霜灵初筛固体培养基，30℃培养3～5天后，挑取单菌落进行复筛。

甲霜灵初筛固体培养基：K₂HPO₄·3H₂O 2.1g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，NaCl 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂ 0.025g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L、甲霜灵1g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，调节pH＝7.0，121℃灭菌20min。

3.复筛：

选取初筛固体平板上的单菌株，接种到复筛液体培养基，30℃，转速180r/min培养，定期取样进行HPLC分析，得到了一株转化率49.2％和ee_p达到了98.8％的菌株，初步记为菌株zjut528。

复筛液体培养基：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min。

实施例2菌株zjut528形态学与生理生化鉴定

取以实施例1获得的菌株zjut528在甲霜灵初筛固体培养基平板上30℃恒温培养箱培养3天，观察菌落形态特征，并对其进行革兰氏染色，显微镜下观察形态特征。

固体培养基平板上的菌落形态特征：菌株zjut528在甲霜灵初筛固体培养基平板上菌落均呈圆形，表面隆起，边缘整齐，湿润，光滑，白色，不透明，随着时间的推移，菌落未见有明显颜色变化，如图1所示。

革兰氏染色后的菌株形态特征：对菌株zjut528进行革兰氏染色，显微镜下观察，为革兰氏阴性菌，呈球杆状。如图2所示。

菌株的生理生化鉴定如表1所示，该鉴定实验在本实验室完成。曾外送用VITEK2全自动细菌鉴定仪鉴定该菌株，但无法得出鉴定结果，主要原因是它只能在极为有限的几个培养基中生长。

表1菌株zjut528生理生化特征

注：+表示阳性或利用，-表示阴性或不利用

实施例3菌株zjut528的16S rDNA分子生物学鉴定

以实施例1获得菌株zjut528送到上海某生物技术公司鉴定，16SrDNA的序列长度为1236bp(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)，将测序所得序列在NCBI网站上用BLAST检索Genbank中相关菌株的16SrDNA序列，并进行核苷酸同源性比对和系统发育分析，发现一株Albibacter methylovorans strain DSM22840T相似性达到了99％，菌株zjut528的系统发育树见图4所示。结合16S rDNA分子鉴定及菌株zjut528的生理生化特征，将该菌株zjut528命名为白色杆菌(Albibacter sp.)zjut528。

实施例4、白色杆菌zjut528湿菌体的制备

斜面培养：将白色杆菌zjut528接种至斜面培养基，在30℃培养2-3天，获得斜面菌体。所述斜面培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；

种子培养：将斜面长好的菌体接种至种子培养基，在30℃培养48h，获得种子液。所述种子培养基浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min；

液体发酵培养：将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180r/min的条件下培养48h，将发酵液离心，弃上清液，获得湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，甲霜灵1g/L，甲醇5g/L(甲醇在培养基灭菌后，接种前加入)，溶剂为水，pH值自然，115℃灭菌20min。

实施例5、利用Albibacter sp.zjut528湿菌体催化外消旋体甲霜灵的拆分

催化反应体系总体积4mL，外消旋甲霜灵终浓度100g/L，异丙醇终浓度20mL/L，以磷酸缓冲液(pH＝8.0)为反应介质，加入实施例4制备的湿菌体0.16g。

催化反应条件：180rpm，30℃的条件下于摇床中反应，用HPLC进行底物和产物分析，分别反应9h、18h，反应结果见表2以及图5和图6所示。

表2 zjut528催化外消旋甲霜灵不对称水解结果

产物对映体过量值(ee)和底物转化率C按以下公式计算：

公式1：

公式2：

式中，[P]_S和[P]_R分别为HPLC测得样品中S和R型产物的含量，ee_p为产物的对映体过量值，C_P为产物的摩尔浓度，C_S为底物摩尔浓度，C为转化率。

正相HPLC分析条件：流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80：20：0.1，流速：0.8mL/min，检测紫外波长：230nm，柱温：30℃，进样量：10μl，色谱柱：250mm×4mm，大赛璐手性OD柱。用于分析底物和产物的不同对映体。

实施例6、从实施例5反应结束后的反应液中分离(R)-甲霜灵酸

实施例5反应18h后，用氨水调节反应液的pH值至8-9，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除有机相a得到水相a，将水相a用盐酸调节pH值为3～5，加入等体积的乙酸乙酯萃取分层，去除水相b得到有机相b，再将有机相b在35℃～60℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，获得R-甲霜灵酸0.176g。

实施例7、用实施例6中分离所得(R)-甲霜灵酸和甲醇反应合成(R)-甲霜灵

取5g实施例6方法分离所得R-甲霜灵酸溶于40ml无水甲醇中，冰浴滴加1.5ml二氯亚砜(1.1倍于(R)-甲霜灵酸摩尔量)，滴加完毕后冰浴反应10min，然后回流反应4h，旋蒸浓缩至无液体流出，获得浓缩液。将浓缩液溶于乙酸乙酯，用质量浓度5％Na₂CO₃水溶液洗涤2次，去离子水洗涤1次。去除洗涤液后加入无水硫酸镁除水，过滤后旋蒸至干，得到R-甲霜灵4.24g，总产率为84.6％，ee值为99.3％。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1236

<212>DNA

<213>Albibacter sp.

<400>1

gcctggtggt acggaacaac tcagggaaac ttgagctaat accgtataag cccttttggg60

gaaagattta tcgccaccag atcaacccgc gttggattag ctagttggtg aggtaacggc 120

tcaccaaggc gacgatccat agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 180

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct 240

gatccagcca tgccgcgtga gtgatgaagg ccttagggtt gtaaagctct ttcactgggg 300

aagataatga cggtacccag agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta 360

atacgaaggg ggctagcgtt gttcggaatc actgggcgta aagcgcacgt aggcggactt 420

ttaagtcagg ggtgaaatcc caaggctcaa ccttggaact gcccttgata ctggaagtct 480

tgagttcggg agaggtgagt ggaactgcga gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgca 540

agaacaccag tggcgaaggc ggctcactgg cccgatactg acgctgaggt gcgaaagcgt 600

ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgg acgctagccg 660

ttggccagca tgctggtcag tggcgcagct aacgctttaa gcgtcccgcc tggggagtac 720

ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 780

gtttaattcg aagcaacgcg cagaacctta ccagcctttg acatcctgtg acatccagag 840

agatttgggg ttcccttcgg ggacacagag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 900

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccccta gttgccagca 960

tttggttggg cactctaggg ggactgccgg tgataagccg cgaggaaggt ggggatgacg1020

tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg ctacaatggc ggtgacagtg1080

ggcagcgaag gggtgacccg gagctaatct ccaaaagccg tctcagttcg gattgcactc1140

tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga1200

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaca1236

白色杆菌zjut528及在拆分甲霜灵中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。