IPC分类号 : C12N15/29,C12N15/113,C12N15/84,A01H5/10,A01H6/46
专利摘要
本发明公开了OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，属于分子生物学及基因工程技术领域。本发明通过设计水稻OsFWL7基因编码区基因敲除靶标位点，利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除突变体，敲除水稻中的OsFWL7基因。通过后代分离和检测，获得了无转基因插入的纯合突变体。不同突变体单株产量与野生型相比无显著差异，但糙米中金属微量元素锰和铜的含量与对照相比显著增加，具有更好的营养品质。因此，本发明提供的敲除水稻OsFWL7基因以强化籽粒金属微量元素的方法，具有重要的应用价值，能产生良好的经济效益。
权利要求
1.OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，其特征在于：敲除水稻中OsFWL7基因以增加水稻籽粒金属微量元素含量，所述OsFWL7基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述金属微量元素为Mn和Cu。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除水稻中OsFWL7基因的具体方法为：利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻中的OsFWL7基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体步骤为：
1)在水稻OsFWL7基因的编码区选取靶标序列；
2)根据靶标序列合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL7基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；
3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规水稻品种，获得转基因水稻植株；
4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；
5)对纯合突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、籽粒Mn和Cu含量显著增加的水稻。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中，所述靶标序列有两个，其序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中，所述具有所述靶标序列的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤5)中，用于HPT、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：
HPTF：5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’，
HPTR：5’-ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’，
sgRNAF：5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’，
sgRNAR：5’-GGCCATTTGTCTGCAGAAT-3’，
Cas9F：5’-CACCATCTACCACCTGAGAA-3’，
Cas9R：5’-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3’。
OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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