专利摘要

本发明具体涉及一种龙舌兰珠芽诱导方法。该方法包括取材、培养基配制、材料消毒处理、珠芽的芽诱导培养、增殖培养、诱导生根和植株再生。本发明目的是提供一种龙舌兰珠芽诱导方法，为规模化、产业化提供技术支持。本发明选取饱满的龙舌兰珠芽作为诱导材料，在无菌条件下诱导培养20～30天可萌发出生长健壮新芽；经35～50天增殖培养可产生大量增殖芽体，扩繁系数高，增殖时间短，大大缩短了生长过程，经25-35天诱导生根后可成苗、移栽成活率高达93%以上；节约了大量成本，成苗移植后成活率高，苗健壮挺拔，长势良好，整齐一致。

权利要求

1.一种龙舌兰珠芽诱导方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1）取材方法：选取当年抽苔、饱满的龙舌兰珠芽为材料，采摘后置3-5℃冰箱冷藏保存备用；

2）培养基配制：分别配制珠芽的芽诱导培养基、芽增殖培养基、生根培养基，培养基的PH值为5.6-5.8，培养基厚度为1.4～1.6 cm；

所述珠芽的芽诱导培养基：MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1KT+0.01mg·L^-1 TDZ +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su+1.0 g·L^-1Ac，

所述芽增殖培养基：MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.02mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA+1.0g·L^-1蛋白胨 +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac，

所述生根培养基：1/2MS+0.1mg·L^-1NAA+0.5-1.0mg·L^-1IBA+ 7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac；

3）材料消毒处理：将珠芽用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，用自来水滴冲0.5-1h后去除珠芽外包皮，用双蒸水冲洗2-3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒20-40s，用质量分数为0.1%升汞消毒12-15min，无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，放在灭过菌的培养皿上；

4）珠芽的芽诱导培养：将经消毒处理后的材料接种在珠芽的芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx；

5）芽增殖培养：将经步骤4）诱导得到的丛生芽，切成长1-2cm的块状，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx；

    6）诱导生根培养：将经增殖培养出来的带有2-4片叶子、株高2-4cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx；

7）试管苗完成：当试管苗长至4-6cm高，有3-5条形态正常的根，有2-3片叶子，叶长4-6cm时，完成龙舌兰的植株再生培养。

2.根据权利要求1所述的龙舌兰珠芽诱导方法，其特征在于：将所述步骤7）完成的试管苗进行移栽：将试管苗放在自然光下炼苗3-5天，再打开瓶盖炼苗1-2天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2的混合基质中，用带气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在20-28℃，湿度应保持在65％-75％。

3.根据权利要求1所述的龙舌兰珠芽诱导方法，其特征在于：所述龙舌兰为金边龙舌兰(Agave americanaL.var. marginataalba Trel)。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种龙舌兰珠芽诱导方法。

背景技术

龙舌兰（Agave americana L.）又名龙舌掌、番麻，为龙舌兰科，龙舌兰属多年生常绿大型草本植物，植株高大。叶呈莲座式排列，通常30-40枚，有时50-60枚，大型，肉质，倒披针状线形，长1-2米，中部宽15-20厘米，基部宽10-12厘米，叶缘具有疏刺，顶端有1硬尖刺，刺暗褐色，长1.5-2.5厘米。圆锥花序大型，长达6-12米，多分枝；花黄绿色；花被管长约1.2厘米，花被裂片长2.5-3厘米；雄蕊长约为花被的2倍。蒴果长圆形，长约5厘米。因其叶片坚挺，四季常青，花黄绿色，开花后花序上生成的珠芽极少。原产地一般要几十年后才开花，巨大的花序高可达7至8米，是世界上最长的花序，白色或浅黄色的铃状花多达数百朵，极具观赏价值,是南方城市庭园及绿化带的常见花卉。大部分种类的龙舌兰类植物一生只开1 次花，花后随种子的成熟植株则逐渐枯死，龙舌兰一般会经过很多年积攒养分，然后突然发芽疯长。不过这样会耗尽它全部的能量，爆发后的龙舌兰不久便会枯死。而且一些珍贵品种很难开花，因此在生产中常用分株、扦插、播种的方法进行繁殖。

采用组织培养技术快速繁殖大量优质种苗，有助于解决资源匮乏，为规模化、产业化提供技术支持。有关龙舌兰珠芽诱导芽的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种龙舌兰珠芽诱导方法，为规模化、产业化提供技术支持。

本发明的方法是以如下方式实现的：

一种龙舌兰珠芽诱导方法，包括以下步骤：

1）取材方法：选取当年抽苔、饱满的龙舌兰珠芽为材料，采摘后置3-5℃冰箱冷藏保存备用；

2）培养基配制：分别配制珠芽的芽诱导培养基、芽增殖培养基、生根培养基，培养基的PH值为5.6-5.8，培养基厚度为1.4～1.6 cm；

所述珠芽的芽诱导培养基：MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1KT+0.01mg·L^-1 TDZ +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su+1.0 g·L^-1Ac，

所述芽增殖培养基：MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.02mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA+1.0g·L^-1蛋白胨 +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac，

所述生根培养基：1/2MS(大量元素减半)+0.1mg·L^-1NAA+0.5-1.0mg·L^-1IBA+ 7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac；

3）材料消毒处理：将珠芽用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，用自来水滴冲0.5-1h后去除珠芽外包皮，用双蒸水冲洗2-3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒20-40s，用质量分数为0.1%升汞消毒12-15min，无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，放在灭过菌的培养皿上。

4）珠芽的芽诱导培养：将经消毒处理后的材料接种在珠芽的芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx；

5）芽增殖培养：将经步骤4）诱导得到的丛生芽，切成长1-2cm的块状，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx；

    6）诱导生根培养：将经增殖培养出来的带有2-4片叶子、株高2-4cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23±2℃，光照时间11-12h/d，光照强度为1500-2000lx；

7）试管苗完成：当试管苗长至4-6cm高，有3-5条形态正常的根，有2-3片叶子，叶长4-6cm时，完成龙舌兰的植株再生培养。

将所述步骤7）完成的试管苗进行移栽：将试管苗放在自然光下炼苗3-5天，再打开瓶盖炼苗1-2天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2的混合基质中，用带气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在20-28℃，湿度应保持在65％-75％。

以上涉及：1、Ag为（Agar 培养基凝固剂和支持物琼脂粉的缩写）；

2、Su为（Sugar提供植物碳源和维持渗透压蔗糖的缩写）；

3、Ac为活性炭。

所述龙舌兰为金边龙舌兰(Agave americanaL.var. marginataalba Trel)。

本发明选取饱满的龙舌兰珠芽作为诱导材料， 在无菌条件下诱导培养20～30天可萌发出生长健壮新芽；经35～50天增殖培养可产生大量增殖芽体，扩繁系数高，增殖时间短，大大缩短了生长过程，经25-35天诱导生根后可成苗、移栽成活率高达93%以上；节约了大量成本，成苗移植后成活率高，苗健壮挺拔，长势良好，整齐一致。

本发明的显著优点：

一：通过本发明方法可以最大限度地应用现有资源，通过生物技术手段在短时间内解决稀缺资源的应用需求；

二：总结出一套可供生产单位应用的龙舌兰离体培养及植株再生技术，通过本发明的广泛应用可直接提高珍稀品种人工林地产量、质量和园林绿化水平，实现资源高效培育，具有十分广阔的产业化发展前景。本发明创新性强，技术含量高，公益性强，对于促进珍稀品种的研究、利用，有着良好前景和及其重要意义，为开发利用该种资源提供了理论依据和技术支持。

附图说明

图1为珠芽的芽诱导1。

图2为珠芽的芽诱导2。

图3为芽增殖培养。

图4为诱导生根培养。

图5为植株生长。

图6为植株移栽。

具体实施方式

实施例1

一种龙舌兰珠芽诱导芽的方法，步骤如下：

1）取材方法：选取当年抽苔、饱满的金边龙舌兰(Agave americanaL.var. marginataalba Trel)的珠芽为材料；

2）培养基配制：分别配制珠芽的芽诱导培养基、芽增殖培养基、生根培养基，培养基的PH值为5.6，培养基厚度为1.4cm；

所述珠芽的芽诱导培养基：MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1KT+0.01mg·L^-1 TDZ +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su+1.0 g·L^-1Ac，

所述芽增殖培养基：MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.02mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA+1.0g·L^-1蛋白胨 +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac，

所述生根培养基：1/2MS+0.1mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-1IBA+ 7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac；

3）材料消毒处理：将从植株上切下的珠芽用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，用自来水滴冲0.5h后去除珠芽外包皮，用双蒸水冲洗2遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒20s，用质量分数为0.1%升汞消毒12min，无菌水冲3遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，放在灭过菌的培养皿上。

4）珠芽的芽诱导培养：将经消毒处理后的材料接种在珠芽的芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为21℃，光照时间11h/d，光照强度为1500lx，诱导培养时间40天；

5）芽增殖培养：将经步骤4）诱导得到的丛生芽，切成长1-2cm的块状，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为21℃，光照时间11h/d，光照强度为1500lx，增殖培养时间50天；

    6）诱导生根培养：将经增殖培养出来的带有2片叶子、株高2cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为21℃，光照时间11h/d，光照强度为1500lx，生根培养时间35天；

7）试管苗完成：当试管苗长至4cm高，有3条形态正常的根，有2片叶子，叶长4cm时，完成龙舌兰的植株再生培养。

8）移栽：将试管苗放在自然光下炼苗3天，再打开瓶盖炼苗1天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2的混合基质中，用带气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在20℃，湿度应保持在65％，再生植株成活率在93%以上。

实施例2

一种龙舌兰珠芽诱导芽的方法，步骤如下：

1）取材方法：选取当年抽苔、饱满的金边龙舌兰(Agave americanaL.var. marginataalba Trel)的珠芽为材料；

2）培养基配制：分别配制珠芽的芽诱导培养基、芽增殖培养基、生根培养基，培养基的PH值为5.7，培养基厚度为1.5 cm；

所述珠芽的芽诱导培养基：MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1KT+0.01mg·L^-1 TDZ +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su+1.0 g·L^-1Ac，

所述芽增殖培养基：MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.02mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA+1.0g·L^-1蛋白胨 +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac，

所述生根培养基：1/2MS+0.1mg·L^-1NAA+0.8mg·L^-1IBA+ 7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac；

3）材料消毒处理：将从植株上切下的珠芽用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，用自来水滴冲1h后去除珠芽外包皮，用双蒸水冲洗3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒30s，用质量分数为0.1%升汞消毒13min，无菌水冲4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，放在灭过菌的培养皿上。

4）珠芽的芽诱导培养：将经消毒处理后的材料接种在珠芽的芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为23℃，光照时间12h/d，光照强度为1800lx，诱导培养时间30天；

5）芽增殖培养：将经步骤4）诱导得到的丛生芽，切成长1-2cm的块状，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为23℃，光照时间12h/d，光照强度为1800lx，增殖培养时间35天；

    6）诱导生根培养：将经增殖培养出来的带有4片叶子、株高4cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为23℃，光照时间12h/d，光照强度为1800lx，生根培养时间25天；

7）试管苗完成：当试管苗长至5cm高，有4条形态正常的根，有2片叶子，叶长5cm时，完成龙舌兰的植株再生培养。

将所述步骤7）完成的试管苗进行移栽：将试管苗放在自然光下炼苗4天，再打开瓶盖炼苗2天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2的混合基质中，用带气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在25℃，湿度应保持在70％，再生植株成活率在93%以上。

实施例3

一种龙舌兰珠芽诱导芽的方法，步骤如下：

1）取材方法：选取当年抽苔、饱满的金边龙舌兰(Agave americanaL.var. marginataalba Trel)的珠芽为材料；

2）培养基配制：分别配制珠芽的芽诱导培养基、芽增殖培养基、生根培养基，培养基的PH值为5.8，培养基厚度为1.6 cm；

所述珠芽的芽诱导培养基：MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1KT+0.01mg·L^-1 TDZ +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su+1.0 g·L^-1Ac，

所述芽增殖培养基：MS+1.0mg·L^-1 6-BA+0.02mg·L^-1TDZ+0.3mg·L^-1NAA+1.0g·L^-1蛋白胨 +7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac，

所述生根培养基：1/2MS+0.1mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1IBA+ 7.0g·L^-1Ag+20g·L^-1Su +1.5 g·L^-1Ac；

3）材料消毒处理：将从植株上切下的珠芽用自来水进行表面冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15min，用自来水滴冲40分钟后去除珠芽外包皮，用双蒸水冲洗3遍，在超净工作台上用质量分数为75%酒精消毒40s，用质量分数为0.1%升汞消毒15min，无菌水冲4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，放在灭过菌的培养皿上。

4）珠芽的芽诱导培养：将经消毒处理后的材料接种在珠芽的芽诱导培养基中进行诱导培养；培养条件：培养室温度为25℃，光照时间11h/d，光照强度为2000lx，诱导培养时间35天；

5）芽增殖培养：将经步骤4）诱导得到的丛生芽，切成长1-2cm的块状，接种在芽增殖培养基中进行增殖培养；培养条件：培养室温度为25℃，光照时间11h/d，光照强度为2000lx，增殖培养时间45天；

    6）诱导生根培养：将经增殖培养出来的带有3片叶子、株高3cm的幼苗单株转移到生根培养基中；所述生根培养的培养条件：培养室温度为25℃，光照时间11h/d，光照强度为2000lx，生根培养时间30天；

7）试管苗完成：当试管苗长至6cm高，有5条形态正常的根，有3片叶子，叶长6cm时，完成龙舌兰的植株再生培养。

将所述步骤7）完成的试管苗进行移栽：将试管苗放在自然光下炼苗5天，再打开瓶盖炼苗1天，用枪状镊把试管苗从培养瓶中逐渐取出并洗去附着在根部上的培养基，移入蛭石和腐殖土的质量比=1:2的混合基质中，用带气孔的玻璃罩罩住移栽试管苗，温度控制在28℃，湿度应保持在75％，再生植株成活率在93%以上。

一种龙舌兰珠芽诱导方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。