专利摘要
一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法。筛选引物组合及引物序列；致病菌DNA模板制备方法；多重PCR反应体系与PCR扩增；多重PCR产物检测和结果判读。通过两个PCR反应，可高效、特异、灵敏地检测和鉴定出样品中是否存在气单胞菌，以及1～7种不等的毒力基因的多重PCR检测方法。适于快速鉴定鱼类气单胞菌的致病菌株和普通菌株，可适用于鱼类气单胞菌病的分子辅助诊断，以及该类疾病的确诊。适用于水产动物养殖全过程监控，适用于不同样品类型，包括水体、底泥、养殖动物以及水产品等，监控其是否含有气单胞菌、以及是普通或致病性气单胞菌、并可鉴定致病性气单胞菌所含的毒力基因种类、及相对表达量。
权利要求
1.一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法，其特征在于所述方法不涉及疾病诊断与治疗，包括以下步骤：
1)筛选引物组合及引物序列；
所述筛选引物组合具体为：
通过全基因组分析，寻找靶毒力基因的特征性基因片段，选择其中不同种气单胞菌高度保守的区域，作为设计引物的靶序列，按照引物设计原则，设计并合成多对引物，再通过大量单重PCR实验，筛选出扩增效率高、特异性强的引物序列，最后，根据多重PCR原理，筛选出一种同时检测气单胞菌1个管家基因和7个毒力基因的多重PCR引物组合，所述多重PCR引物组合包括：管家基因gyrB，气溶素基因Aer，丝氨酸胞外蛋白酶基因ahp，热敏感性胞外蛋白酶基因epr，3个肠毒素基因act、ast、alt和溶血素基因hlyA；并组合成两套四重PCR引物，分别为第1套mPCR引物组合和第2套mPCR引物组合，所述第1套mPCR引物组合包括gyrB、aer、ahpA、epr；所述第2套mPCR引物组合包括act、ast、alt、hlyA；
所述引物序列，具体为：
所述管家基因gyrB引物对的核酸序列为：
gyrB-F：5’-AAGCAGATTGGCGACAGCAC-3’，或者该序列的核酸互补序列；
gyrB-R：5’-CGTTCAGGATCTTGCCCTTG-3’，或者该序列的核酸互补序列；
gyrB引物对扩增靶基因片段大小约为880bp；
所述丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahpA)引物对的核酸序列为：
ahpA-F：5’-TGCCCATCGCTTCAGTTCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ahpA-R：5’-GTGCGGCTGAACATGTAGTCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ahpA引物对扩增靶基因片段大小约为720bp；
所述热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)引物对的核酸序列为：
epr-F：5’-GATGTCGCTCTTCTGGGTGT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
epr-R：5’-CGTTAACCTGACCCTGACCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
epr引物对扩增靶基因片段大小约为460bp；
所述气溶素基因(aer)引物对的核酸序列为：
aer-F：5’-CTCCAAGATCCCGGTGAAGA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
aer-R：5’-TGTCCCACTGGTAGCGAATG-3’，或者该序列的核酸互补序列；
aer引物对扩增靶基因片段大小约为220bp；
所述肠毒素基因(act)引物对的核酸序列为：
act-F：5’-TTCCAGACGGTGACGAAGT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
act-R：5’-CAGCCTTGTAGAGCTCGATCT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
act引物对扩增靶基因片段大小约为620bp；
所述肠毒素基因(ast)引物对的核酸序列为：
ast-F：5’-GTCAGCGACAGCTTCTTCAT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ast-R：5’-CGTCGTCAAACAGAAAGCC-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ast引物对扩增靶基因片段大小为约350bp；
所述肠毒素基因(alt)引物对的核酸序列为：
alt-F：5’-CAAGCTGCCCTACTTCCTCT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
alt-R：5’-CCACCGGTATCGAACTTGA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
alt引物对扩增靶基因片段大小约为820bp；
所述溶血素基因(hlyA)引物对的核酸序列为：
hlyA-F：5’-ATCAGCGATGCCGAGTGTA-3’，或者该序列的核酸互补序列
hlyA-R：5’-TCCTCGTTGAGCTGGATACC-3’，或者该序列的核酸互补序列
hlyA引物对扩增靶基因片段大小约为220bp；
2)多重PCR反应体系与扩增条件；
所述多重PCR反应体系，具体为：
①多重PCR扩增的反应体系为：
第1套mPCR反应体系：
第2套mPCR反应体系：
10×PCR buffer mixture：150～220mM Tris-HCl，pH 8.0～8.5，150～250Mm KCl，50～150Mm(NH4)2SO4,0～20mM MgCl2；
dNTPs mixture：dATP、dGTP、dCTP各8～20mM，dTTP和dUTP各5～15mM；
②多重PCR的扩增条件如下：
98℃预变性4min，98℃变性30s，58～60℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～35个循环后，然后再72℃温度延伸7min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存；
3)多重PCR产物检测和结果判读，具体方法为：
①电泳：对步骤2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳检测，1.2％的琼脂糖凝胶，电压为100～140V，电泳30～45min；
②结果判读：
第1套mPCR扩增结果，所述第1套mPCR为检测靶基因为gyrB\ahpA\epr\aer：
若约880bp处出现条带，表明样品中含gyrB基因，属于气单胞菌；
若约720bp处出现条带，表明样品中含有ahpA毒力基因；
若约460bp处出现条带，表明样品中含有epr毒力基因；
若约220bp处出现条带，表明样品中aer含有毒力基因；
若同时在上述不同相应位置出现条带，则表明该样品中含有多个相应的毒力基因；
第2套mPCR扩增结果，所述第2套mPCR为检测靶基因为alt\act\ast\hlyA：
若约820bp处出现条带，表明样品中含有alt毒力基因；
若约620bp处出现条带，表明样品中含有act毒力基因；
若约350bp处出现条带，表明样品中含有ast毒力基因；
若约220bp处出现条带，表明样品中含有hlyA毒力基因；
若同时在上述不同相应位置出现条带，则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。
说明书
技术领域
本发明涉及水生动物病原微生物检测，尤其是涉及鱼类(特别是鳗鲡)致病性气单胞菌的一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法。
背景技术
鳗鲡(Angulla spp.)，俗称鳗鱼，肉质鲜美，营养价值高，是世界重要的经济鱼类。中国鳗鲡养殖产量约占全球70％，年产值愈百亿元。在目前鳗鲡高密度集约化的养殖过程中，气单胞菌病时有发生，危害严重，经济损失巨大。研究发现，同一种气单胞菌的不同菌株感染后，鳗鲡所表现的症状千差万别，可引起包括烂鳃、赤皮、穿孔、出血性败血症、肠炎和流行性溃疡等；相反，不同种气单胞菌感染后，鳗鲡往往却表现出相同症状。因此，养殖鳗鲡的气单胞菌病正确诊断和科学防控难度大。
气单胞菌属(Aeromonas)普遍存在于水生态系统中，可分离自淡水和河口水、地表水、污水、健康或患病的鱼、食品、动物和人类粪便，可引起人类和鱼类的疾病。目前，已知气单胞菌属有效种25种，其中可引起动物疾病的常见种有：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(A.veronii)、温和气单胞菌(A.sobria)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、简达气单胞菌(A.jandaei)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)等。研究发现，气单胞菌致病性强弱，与其所携带毒力基因的种类和数量密切相关(Janda JM andAbbott SL.The genus Aeromonas:taxonomy,pathogenicity,and infection.Clin Microbiol Rev.2010；23:35-73.)。目前，研究较深入的毒力基因包括，气溶素(编码基因是Aer，下同)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)、热敏感性胞外蛋白酶(epr)、细胞毒性肠毒素(act)、热稳定细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)等。气溶素是一种细胞通道型毒素，具有溶血性、细胞毒性、肠毒性(Li J,Ni XD,Liu YJ,et al.Detection of three virulence genes alt,ahp and aerA inAeromonas hydrophila and their relationship with actualvirulence to zebrafish.J Appl Microbiol.2011；110:823-830)；丝氨酸胞外蛋白酶能够破坏宿主的免疫防御系统，有助于细菌吸附、扩散、繁殖，进而引起感染和组织损伤(Yu HB,Zhang YL,Lau YL,et al.Identification and characterization of putative virulence genes and gene clusters in Aeromonas hydrophila PPD134/91.Appl Environ Microbiol.2005；71(8):4469-4477)；热敏感性胞外蛋白酶可协同其他毒力因子共同作用于宿主(Hu M,Wang N,Pan ZH,et al.Identity and virulence properties of Aeromonas isolates from diseased fish,healthy controls and water environment in China.Lett Appl Microbiol.2012；55:224-233.)；肠毒素包括细胞毒性肠毒素、热稳定细胞兴奋性肠毒素以及热不稳定细胞兴奋性肠毒素，它们可通过与宿主细胞发生不可逆结合，引起水样腹泻、肠胃炎，严重时导致宿主死亡(Kingombe CI,D'Aoust JY,Huys G,et al.Multiplex PCR method for detection of three Aeromonas enterotoxin genes.Appl Environ Microbiol.2010；76:425-433.)；也有认为肠毒素具有溶血性、细胞毒性和肠毒性(Wang G,Clark CG,Liu C,et al.Detection and characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria by multiplex PCR.J Clin Microbiol.2003；41:1048-1054.)；溶血素可导致机体组织溃疡、败血和坏死等病理变化，临床主要表现为败血症(Beaz-Hidalgo R and Figueras MJ.Aeromonas spp.whole genomes and virulence factors implicated in fish disease.J Fish Dis.2013；36(4):371-388.)。同种气单胞菌的不同菌株，因其所携带的毒素基因数量和种类不同，其致病力、临床症状以及其所造成的经济损失等明显不同。尽管常规的细菌生化鉴定方法，可以鉴定细菌到种，然而，却无法确定该种细菌是否具有致病性，结果导致往往是正常菌株，却也采用药物进行防控，这样不仅造成不必要的经济损失，而且增强鱼类应激作用，破坏鱼类正常菌群，降低免疫力，导致药残超标等问题，进一步加重经济损失。此外，研究显示，某些气单胞菌毒力因子可通过水产动物和/或水产品等媒介，引起人畜腹泻和食物中毒。因此，建立快速、便捷、高灵敏度的气单胞菌毒力因子检测和鉴定方法十分重要和必要，它不仅有利于正确诊断鱼类(尤其是鳗鲡)气单胞菌病，以及制定科学防控方案，同时，有利于保障水生动物和水产品安全。
多重PCR技术是基于普通PCR技术而发展起来的一种核酸扩增技术，可同时检测和分析多个靶基因，大幅度提高检测效率，降低检测成本。已报道水生动物气单胞菌的多重PCR检测技术，如方兵等建立了同时检测水生动物源气单胞菌粘附素(aha1)、aerA和alt三个主要毒力基因的多重PCR方法(方兵,李槿年,祖国掌,等.应用多重PCR检测水生动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因型分布.水产学报,2005；29(4):473-477)；饶静静等建立了以嗜水气单胞菌白16S rRNA、hlyA、aerA为靶基因的三重PCR技术(饶静静,李寿崧,黄克和,等.致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立.中国水产科学,2007；14(5):749-755)；符贵红等建立了以嗜水气单胞菌aer、hly、alt、ahp、act为靶基因的五重PCR检测技术(符贵红,肖丹,胡鲲,等.鲫源嗜水气单胞菌毒力基因多重PCR检测及ERIC-PCR分子分型.海洋渔业,2014；36(6):549-556)。然而，上述技术和方法有的仅针对单一菌种如嗜水气单胞菌设计，或仅涉及少数毒力基因，导致其应用范围受限，无法满足生产实际需求。
本申请人长期从事鳗鲡病害研究，分离、鉴定了数百株鳗鲡源气单胞菌，系统研究分析了其毒力基因。前期研究发现，气溶素(Aer)、溶血素(hlyA)、肠毒素(act、ast、alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)、热敏感性胞外蛋白酶(epr)(熊静,余钦,郭松林,等.7株鳗鲡致病性气单胞菌毒力基因胞外产物及其活性比较.华中农业大学学报,2017；36(1):76-85)等胞外毒素是鳗源气单胞菌最常见的主要毒力因子，对鳗鲡毒性强，造成重大的经济损失，然而，迄今，在养殖生产过程尚未对相关毒力基因进行检测和监控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法。
本发明包括以下步骤：
1)筛选引物组合及引物序列
在步骤1)中，所述筛选引物组合及引物序列的具体方法可为：
通过全基因组分析，寻找靶毒力基因的特征性基因片段，选择其中不同种气单胞菌高度保守的区域，作为设计引物的靶序列，按照引物设计原则，设计并合成多对引物，再通过大量单重PCR实验，筛选出PCR扩增效率高、特异性强的引物序列，最后，根据多重PCR检测原理，筛选出可同时检测气单胞菌1个管家基因和7个毒力基因的多重PCR引物组合。所述多重PCR引物组合，包括管家基因(gyrB)、气溶素基因(Aer)、丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahp)、热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)、3个肠毒素基因(act、ast、alt)和溶血素基因(hlyA)，分别为第1套mPCR引物组合(gyrB,aer,ahpA,epr)和第2套mPCR引物组合(act,ast,alt,hlyA)。
所述管家基因gyrB引物对的核酸序列为：
gyrB-F：5’-AAGCAGATTGGCGACAGCAC-3’，或者该序列的核酸互补序列；
gyrB-R：5’-CGTTCAGGATCTTGCCCTTG-3’，或者该序列的核酸互补序列；
gyrB引物对扩增靶基因片段大小约为880bp。
所述丝氨酸胞外蛋白酶基因(ahpA)引物对的核酸序列为：
ahpA-F：5’-TGCCCATCGCTTCAGTTCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ahpA-R：5’-GTGCGGCTGAACATGTAGTCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ahpA引物对扩增靶基因片段大小约为720bp。
所述热敏感性胞外蛋白酶基因(epr)引物对的核酸序列为：
epr-F：5’-GATGTCGCTCTTCTGGGTGT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
epr-R：5’-CGTTAACCTGACCCTGACCA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
epr引物对扩增靶基因片段大小约为460bp。
所述气溶素基因(aer)引物对的核酸序列为：
aer-F：5’-CTCCAAGATCCCGGTGAAGA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
aer-R：5’-TGTCCCACTGGTAGCGAATG-3’，或者该序列的核酸互补序列；
aer引物对扩增靶基因片段大小约为220bp。
所述肠毒素基因(act)引物对的核酸序列为：
act-F：5’-TTCCAGACGGTGACGAAGT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
act-R：5’-CAGCCTTGTAGAGCTCGATCT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
act引物对扩增靶基因片段大小约为620bp。
所述肠毒素基因(ast)引物对的核酸序列为：
ast-F：5’-GTCAGCGACAGCTTCTTCAT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ast-R：5’-CGTCGTCAAACAGAAAGCC-3’，或者该序列的核酸互补序列；
ast引物对扩增靶基因片段大小为约350bp。
所述肠毒素基因(alt)引物对的核酸序列为：
alt-F：5’-CAAGCTGCCCTACTTCCTCT-3’，或者该序列的核酸互补序列；
alt-R：5’-CCACCGGTATCGAACTTGA-3’，或者该序列的核酸互补序列；
alt引物对扩增靶基因片段大小约为820bp。
所述溶血素基因(hlyA)引物对的核酸序列为：
hlyA-F：5’-ATCAGCGATGCCGAGTGTA-3’，或者该序列的核酸互补序列
hlyA-R：5’-TCCTCGTTGAGCTGGATACC-3’，或者该序列的核酸互补序列
hlyA引物对扩增靶基因片段大小约为220bp。
2)致病菌DNA模板制备方法
在步骤2)中，所述致病菌DNA模板制备方法可为：
①煮沸法：挑取单菌落至LB液体培养基，28～30℃，200rpm，培养10～12h；8000～12000rpm离心，收集菌体重悬于灭菌的双蒸馏水，95～100℃煮沸/裂解10min，8000～12000rpm离心，取上清，备用，或-20℃保存。
②其他常用基因组DNA提取试剂盒，所述其他常用基因组DNA提取试剂盒包括天根组织基因组DNA提取试剂盒等。
3)多重PCR反应体系与PCR扩增
在步骤3)中，所述多重PCR反应体系与PCR扩增的具体方法可为：
①多重PCR扩增的反应体系为：
第1套mPCR反应体系：
第2套mPCR反应体系：
10×PCR buffer mixture：150～220mM Tris-HCl(pH 8.0～8.5),150～250Mm KCl，50～150mM(NH4)2SO4,0～20mM MgCl2；
dNTPs mixture：dATP、dGTP、dCTP各(8～20mM)，dTTP和dUTP各(5～15mM)；
②多重PCR扩增的扩增条件如下：
98℃预变性4min，98℃变性30s，58～60℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～35个循环后，然后再72℃温度延伸7min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。
4)多重PCR产物检测和结果判读
在步骤4)中，所述多重PCR产物检测和结果判读的具体方法可为：
①电泳：对步骤3)中得到的扩增产物进行凝胶电泳检测，1.2％的琼脂糖凝胶，电压为100～140V，电泳30～45min；
②结果判读：
第1套mPCR扩增结果，所述第1套mPCR为检测靶基因为gyrB\ahpA\epr\aer：
若约880bp处出现条带，表明样品中含gyrB基因，属于气单胞菌；
若约720bp处出现条带，表明样品中含有ahpA毒力基因；
若约460bp处出现条带，表明样品中含有epr毒力基因；
若约220bp处出现条带，表明样品中aer含有毒力基因；
若同时在上述不同相应位置出现条带，则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。
第2套mPCR扩增结果，所述第2套mPCR为检测靶基因为alt\act\ast\hlyA：
若约820bp处出现条带，表明样品中含有alt毒力基因；
若约620bp处出现条带，表明样品中含有act毒力基因；
若约350bp处出现条带，表明样品中含有ast毒力基因；
若约220bp处出现条带，表明样品中含有hlyA毒力基因。
若同时在上述不同相应位置出现条带，则表明该样品中含有多个相应的毒力基因。
本发明通过两个PCR反应，可高效、特异、灵敏地检测和鉴定出样品中是否存在气单胞菌，以及1～7种不等的毒力基因[包括气溶素(Aer)、溶血素(hlyA)、肠毒素(act、ast、alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)和热敏感性胞外蛋白酶(epr)等7种]的多重PCR检测方法。适于快速鉴定鱼类(尤其是鳗鲡)气单胞菌的致病菌株和普通菌株，可适用于鱼类(尤其是鳗鲡)气单胞菌病的分子辅助诊断，以及该类疾病的确诊。
本发明以气单胞菌属内基因序列高度保守的管家基因(gyrB)为靶基因，可用于确定所检测样品中是否含有气单胞菌。进一步比较分析了鳗鲡源致病性气单胞菌中最重要的7个毒力基因的基因组序列，即气溶素(Aer)、溶血素(hlyA)、肠毒素(act、ast、alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)和热敏感性胞外蛋白酶(epr)，筛选出具有不同基因特征、特异性强、区分度高的片段作为靶基因片段，结合多重PCR对产物片段大小区别的要求，以及引物退火温度的兼容性和扩增效率等因素，设计了2套四重PCR，利用该试剂可实现同时检测鳗鲡源致病性气单胞菌7种毒力基因；最后，经过优化反应体系，以及实验可靠性验证等工作，确定了本发明的多重PCR检测技术。本发明不仅具有普通单重PCR技术鉴定致病性菌株毒力基因的能力，而且具有单重PCR所无法比拟的优点，如检测时间短、试剂成本低以及初步比较不同毒力基因的表达量等。本发明特别适用于鳗鲡源致病性气单胞菌的检测该方法，也可适于其他动物的致病性气单胞菌该7种毒力基因检测。
与现有的技术相比，本发明的突出技术效果如下：
本发明只需要提取一次样品的DNA，进行两管PCR反应，即可高敏感性、高特异性地检测和鉴定出样品中是否含有气单胞菌、该气单胞菌是否为致病性菌株、菌株中含有Aer，ahp，epr，act，ast，alt，hlyA等7个毒力基因中的哪几个、以及该菌株中不同毒力基因的相对量等。
本发明的多重PCR检测法，根据气单胞菌的管家基因及7个毒力基因的特征性基因序列做了靶序列，结合引物的扩增效率，以及兼顾基因的种属差异，优化组合，经过实验验证，优选了其中八对PCR引物，组合成两套四重PCR反应体系。与普通PCR方法相比，本发明具有成本低、操作便捷、检测所需时间短、可直观比较多种毒力基因的含量，适于气单胞菌的致病菌株和正常菌株的鉴定和检测，涵盖了水生动物致病性气单胞菌几乎全部的胞外毒素基因。
本发明适用于水产动物养殖全过程监控，适用于不同样品类型，包括水体、底泥、养殖动物(不同发育阶段，不同组织/器官)以及水产品等，监控其是否含有气单胞菌、以及是普通或致病性气单胞菌、并可鉴定致病性气单胞菌所含的毒力基因种类、及相对表达量。
附图说明
图1为8个靶基因的单重PCR扩增的电泳图谱。在图1中，A为第1套体系中4个靶基因(gyrB\ahpA\epr\aer)单重PCR扩增结果；B为第2套体系中4个靶基因(alt\act\ast\hlyA)单重PCR扩增结果。
图2为引物比例对多重PCR扩增影响的电泳图谱。在图2中，以8个靶基因PCR产物混合物为模板(靶基因拷贝数约为2×105copy/μL)，在不同引物浓度比例下，多重扩增的不同效果。其中，A为第1套反应体系中靶基因(gyrB\ahpA\epr\Aer)不同引物浓度对4重PCR扩增效果的影响。引物浓度(gyrB:ahpA:epr:aer)分别为：泳道1为0.6:0.4:0.3:0.2；泳道2为0.4:0.3:0.3:0.2；泳道3为0.4:0.3:0.2:0.2；泳道4为0.4:0.2:0.2:0.2；泳道5为0.3:0.3:0.2:0.2；泳道6为0.3:0.2:0.2:0.2；泳道7为0.2:0.2:0.2:0.2。单位为μM。结果显示：不同引物浓度比对多重PCR扩增效率影响不大。后续选择泳道4的引物浓度0.4:0.2:0.2:0.2作为后续研究。B为第2套反应体系中靶基因(alt\act\ast\hlyA)不同引物浓度对4重PCR扩增效果的影响。引物浓度比(alt:act:ast:hlyA)分别为：泳道1为0.8:0.6:0.4:0.2；泳道2为0.6:0.6:0.4:0.2；泳道3为0.4:0.4:0.4:0.2；泳道4为0.2:0.2:0.2:0.2；泳道5为1.0:0.6:0.2:0.2；泳道6为1.0:0.4:0.3:0.2；泳道7为0.8:0.6:0.4:0.2；泳道8为0.8:0.6:0.3:0.2。单位为μM。结果显示：不同引物浓度对扩增效率影响比较大。后续选择泳道3的引物浓度0.4:0.4:0.4:0.2作为后续研究。
图3为退火温度优化的电泳图谱。在图3中，1～6：退火温度依次为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃(第1套反应体系)；7～12：退火温度依次为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃(第2套反应体系)。结果显示：不同退火温度对第1套反应体系多重PCR扩增的影响大于第2套反应体系。综合考虑，选择最佳退火温度为59℃。
图4为多重PCR灵敏度测定的电泳图谱。在图4中，将8个靶基因PCR产物的混合物，进行10倍梯度稀释作为模板(靶基因拷贝数调整到2×108～2×101copy/μL)。结果显示：第1套反应体系灵敏度为2×102copy/μL(A)；第2套反应体系灵敏度为2×101copy/μL(B)。
图5为多重PCR特异性检测的电泳图谱。在图5中，泳道1～10分别是鳗鲡源的不同种气单胞菌(分别为B1001，B1002，GIMI.172，B1003，B1201，B1004，B1101，B1202，CGMCC1.2205和B1005)，经多重PCR扩增后的产物电泳图谱；泳道11～15是不同致病性菌株混合物(分别为B1002&GIMI.172，GIMI.172&B1003，B1003&B1201，B1201&B1004，B1101&B1202)；泳道16是8株非气单胞菌(ATCC6538，ATCC9027，ATCC13883，B1401，B1501，B1502，B1503，B1601)的多重PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤：
步骤1：菌株的培养
保种菌株，划线接种于LB平板，28℃过夜培养，挑取单菌落移接到1mL液体LB培养基中，过夜培养(约10～12h)。
步骤2：基因组DNA模板的提取
①利用天根DNA试剂盒抽提基因组DNA；
或②挑取单菌落至LB液体培养基，28～30℃，200rpm，培养10～12h；8000～12000rpm离心，收集菌体重悬于灭菌的双蒸馏水，95～100℃煮沸/裂解10min，8000～12000rpm离心，取上清-20℃保存备用；
或③利用天根组织基因组DNA提取试剂盒，具体参照试剂盒说明书，提取各种组织样本。
步骤3：引物设计
对NBCI数据库中气单胞菌基因组数据库进行多重比对，结合毒力基因的核苷酸序列，通过BLAST多重比对，筛选出不同气单胞菌中该基因的高度保守区域，利用DNAMAN软件设计并优化引物。根据多重PCR检测原理，设计不同片段小大的靶基因扩增引物对。
步骤4：单重PCR扩增方法的建立
首先通过单基因特异性PCR，探索每对引物组扩增对应基因片段的反应体系和反应条件。通过DNA提取试剂盒分别提取实验室保种的18株病原菌基因组DNA，作为各自引物组的扩增模板。通过优化退火温度、引物浓度等反应条件，确定各个靶基因的最佳扩增条件。
PCR反应条件：98℃预变性5min，98℃变性30s，56～61℃退火30～40s，72℃延伸30～60s，进行30～35个循环后，然后72℃终延伸10min。凝胶电泳检测，筛选出扩增成功的引物对。
结果显示：这8个基因在10株不同气单胞菌菌株中的分布不同，从嗜水气单胞菌B1001中同时扩增出了这8个靶基因。而非气单胞菌均没有任何扩增。同时发现，这8个靶基因均可以在56～62℃，引物浓度为0.1～0.8μM，在28～32个扩增循环均可有效扩增预期大小的靶基因片段，扩增效果无明显差异。
步骤5：重组质粒的构建
以B1001基因组为模板，以上述8对引物进行单重PCR扩增，胶回收PCR产物，与PMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌，构建重组质粒。提取阳性质粒，调整靶基因浓度约1×109copy/μL，建立多重PCR检测方法，研究其最佳反应条件。
步骤6：多重PCR反应体系和反应条件优化试验
在单基因特异性PCR反应的基础上，以B1001为基因组模板或以各个靶基因的阳性质粒为模板，调整靶基因浓度约1×109copy/μL，根据不同靶基因片段大小差异，组合成2套mPCR引物组合：第1套mPCR(检测靶基因gyrB\ahpA\epr\Aer)；第2套mPCR(检测靶基因alt\act\ast\hlyA)。
建立多重PCR检测方法，优化反应条件。
①引物浓度的优化
根据多重PCR扩增原理，在多重PCR扩增过程中存在着扩增效率的差异，理论上讲扩增片段越长扩增效率越差。为此，优化了引物终浓度，即从0.2，0.3，0.4，0.6，0.8(μM)。结果显示：不同引物浓度对2套反应体系的扩增效率影响不同，其中，第1套反应体系的扩增效率影响不大，而对第2套的扩增效率影响较大(图1)。综合本发明其他相关的研究结果，选择gyrB：ahpA：epr：aer为0.4：0.2：0.2：0.2(μM)和alt：act：ast：hlyA为0.4：0.4：0.4：0.2(μM)为最佳引物浓度比。
②退火温度的优化
引物比例对多重PCR扩增影响的电泳图谱参见图2。
在单重PCR扩增体系中，8对引物中每一对均可在退火温度为56～61℃时，有效扩增目的产物，因此，拟以上述最佳优化后的引物浓度，对多重PCR进行退火温度的优化。结果显示：第1套反应体系的退火温度为56～60℃时，4对引物的扩增效果均较好，尤其59℃扩增效果最好(图3)；而第2套反应体系的退火温度为56～61℃时，扩增效果无明显差异。综合今后的应用前景和实际，选择两套反应体系的退火温度均为59℃。
步骤7：敏感性试验
回收8个靶基因的扩增产物，混合后进行10倍梯度稀释作为模板(调整混合物中每个靶基因拷贝数依次为2×108～2×101copy/μL)。结果显示：第1套反应体系灵敏度为2×102copy/μL；第2套反应体系灵敏度为2×101copy/μL(图4)。
步骤8：特异性试验
以18株试验菌株(本发明所用病原菌信息参见表1)为研究对象，检测两套反应体系的多重PCR扩增的特异性。
表1
结果显示：分别以10株气单胞菌单独为模板，采用2套反应体系进行多重PCR扩增，其结果与单重PCR的结果一致(图5中的A)；以菌株混合模板进行多重PCR扩增，结果显示：气单胞菌混合模板，均可有效扩增出预期所有毒力基因，与单重PCR结果一致；非-气单胞菌混合模板，多重PCR结果显示，均无明显条带出现，表明无非-特异性扩增现象，其结果与单独以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等非气单胞菌属的病原菌为模板的PCR扩增结果一致(图5中的B)。上述结果说明这2套反应体系特异性良好。
步骤9：人工感染试验后的样本检测
保种菌株嗜水气单胞菌B1001，划线接种于LB平板，28℃过夜培养，挑取单菌落LB液体培养基16～18h，参照国家标准(GB/T4789.2-2003)进行细菌计数，将菌液浓度调整为2×108cfu/mL，接着进行10倍梯度稀释后，人工感染日本鳗鲡，鳗鲡规格(80±10)g，腹腔感染，分别在12h，24h，36h，48h。
1)取临床症状明显的鳗鲡6尾，解剖取病灶部位，分别取鳃、肝脏、肾脏等组织/器官。按照天根组织提取试剂盒方法提取组织DNA进行检测。结果显示：自12h开始就可以在鳃、肝脏、肾脏中检测B1001菌株的各个毒力基因。
2)取健康相同鳗鲡中相同组织按上述方法制的的DNA模板为阴性模板。检测结果为阴性。
步骤10：临床检测
组织样本：于福建省诏安某养鳗场分别取表观正常与有明显发病症状(鳍条发红，红头，肝肿大充血)的鳗鲡分别为10尾和3尾(取样时，发病鳗鲡少)，分别取其肝脏、肾脏等组织器官。按照步骤9中的方法进行检测。结果显示：表观正常的鳗鲡中仅有1尾检测了ast和hlyA毒力基因，其他尾均没有检测到上述毒力基因；在3尾具有症状的鳗鲡肝脏和肾脏部位，则同时检测到了aerA、ahpA、epr和ast和hlyA等5个毒力基因。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 气单胞菌(aeromonasspp)
<400> 1
aagcagattg gcgacagcac 20
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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一种可同时检测气单胞菌7个毒力基因的多重PCR方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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