专利摘要

一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法和其应用，先将鮰鱼皮用碱溶液除去碱溶性蛋白，再利用正己烷进行脱脂，然后用乳酸溶液提取胶原蛋白，透析后冷冻干燥，即可获得胶原蛋白，将得到的胶原蛋白用蛋白酶在适宜酶解条件下进行水解，酶解产物冻干后，即得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。本发明所得到的鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有良好的活性，其清除DPPH自由基的IC50为0.53-0.86mg/mL，清除羟自由基能力的IC50为0.72-0.91mg/mL，螯合Fe2+能力的IC50为1.01-1.35mg/mL。

权利要求

1.一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于由以下步骤制得：先将鮰鱼皮用碱溶液除去碱溶性蛋白，再利用正己烷进行脱脂，然后用乳酸溶液提取胶原蛋白，透析后冷冻干燥，即可获得鮰鱼皮胶原蛋白，将得到的胶原蛋白用蛋白酶在适宜酶解条件下进行水解，酶解产物冻干后，即得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

2.权利要求1所述的一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于：鮰鱼皮胶原蛋白的制备步骤：将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比40－60mL/g处理2－3h，用蒸馏水洗至中性，按照液料比30mL/g加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.3－0.5mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度40－50℃，提取时间7－11h，液料比40－60mL/g，提取结束后的提取液在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥后，得到胶原蛋白；鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备步骤：将所提取的胶原蛋白配制成2％－3％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至7.5－9.5，用蛋白酶在40℃－50℃下，酶解60－120min，加酶量为2000－4000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

3.根据权利要求2所述的一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于：选用的蛋白酶为诺维信食品级alcalase2.4L。

4.根据权利要求2所述的一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于：将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比40mL/g处理2h，用蒸馏水洗至中性，加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.3mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度40℃，提取时间7h，液料比40mL/g，提取结束后在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，将冻干的胶原蛋白配制成2％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至7.5，用蛋白酶alcalase在40℃酶解60min，加酶量为2000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

5.权利要求1所述鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽在制备清除自由基药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及食品生物化学领域，可作为功能性添加剂用于食品、化妆品和药物，具体涉及一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法和其应用。

背景技术

人类许多慢性疾病如癌症、冠状动脉心脏病和老年痴呆症等都与自由基有关，食品中的自由基通常采用人工合成的抗氧化剂清除，对人类健康具有一定的危害，而来源于食源蛋白中的抗氧化肽则具有绿色、安全和高效等特性，适宜作为人类保健的抗氧化剂使用。

来自于动物组织中的胶原蛋白被报道具有极高的抗氧化活性，这主要与胶原蛋白中包含了大量高活性的抗氧化肽有关，目前已有中国专利关于胶原蛋白抗氧化肽活性及其制备方法的报道，如：中国发明专利CN101824071A（申请公布号）中公开了一种源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途，从胶原蛋白中开发出了2～5个氨基酸的抗氧化肽，这些肽活性高，且易被消化道直接吸收。现有文献报道的胶原蛋白大都来自哺乳动物组织，而关于鱼类组织的较少，特别是关于鱼皮胶原蛋白的研究少之又少。随着我国渔业产业规模的扩大，伴随着大量副产物产生，这些副产物的深加工是目前水产加工业面临的紧迫问题，其中，鱼皮作为水产加工中的大宗副产物，一直处于待开发状态。现有研究表明，鱼皮含有大量的胶原蛋白，且胶原蛋白制备较动物组织的方便和简单，深受科研工作者喜爱。现已有中国专利报道，如：中国发明专利CN102242172A（申请公布号）中公开了一种从鱼皮中提取鱼胶原蛋白的方法，通过加入蛋白酶提取胶原蛋白，其分子量在3000Da以下；中国发明专利CN101607993A（公开号）中公开了一种斑点叉尾鮰鱼皮胶原蛋白的提取工艺，通过加入木瓜蛋白酶提取胶原蛋白。然而，这些专利报道的胶原蛋白制备实质则为制备胶原蛋白肽。本发明采用碱除杂和乳酸浸提的方法获取大分子量的胶原蛋白，然后通过筛选的蛋白酶制备抗氧化肽。另外，目前关于鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的研究尚未见报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法和其应用。

技术方案：一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，由以下步骤制得：先将鮰鱼皮用碱溶液除去碱溶性蛋白，再利用正己烷进行脱脂，然后用乳酸溶液提取胶原蛋白，透析后冷冻干燥，即可获得鮰鱼皮胶原蛋白，将得到的胶原蛋白用蛋白酶在适宜酶解条件下进行水解，酶解产物冻干后，即得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

所述的一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，鮰鱼皮胶原蛋白的制备步骤：将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比40－60mL/g处理2－3h，用蒸馏水洗至中性，按照液料比30mL/g加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.3－0.5mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度40－50℃，提取时间7－11h，液料比40－60mL/g，提取结束后的提取液在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥后，得到胶原蛋白；鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备步骤：将所提取的胶原蛋白配制成2％－3％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至7.5－9.5，用蛋白酶在40℃－50℃下，酶解60－120min，加酶量为2000－4000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

选用的蛋白酶为诺维信食品级alcalase2.4L。

具体制备步骤为：将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比40mL/g处理2h，用蒸馏水洗至中性，加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.3mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度40℃，提取时间7h，液料比40mL/g，提取结束后在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，将冻干的胶原蛋白配制成2％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至7.5，用蛋白酶alcalase在40℃酶解60min，加酶量为2000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

所述鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽在制备清除自由基药物中的应用。

有益效果：

1）首次利用鮰鱼皮制备胶原蛋白抗氧化肽，实现了鮰鱼皮资源的高效利用。

2）建立了鮰鱼皮胶原蛋白制备新方法。

3）鮰鱼皮为水产副产品，价格低，且来源广泛。

4）本发明所得到的鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽具有良好的活性，其清除DPPH自由基的IC₅₀为0.53-0.86mg/mL，清除羟自由基能力的IC₅₀为0.72-0.91mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为1.01-1.35mg/mL。

附图说明

图1制备鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

采用清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力和螯合亚铁离子能力评价鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的活性，方法如下：

1）清除DPPH自由基能力的测定

参考Amarowicz R等报道的方法（Amarowicz R,Naczk M,Shahidi F.Antioxidant activity of various fractions of non-tanin phenolics of canola hulls[J].J Agric Food Chem,2000,48:2755-2759），利用DPPH溶液在517nm下的变化来评价抗氧化活性，计算公式为：

K=[1－(A_i－A_j)/A₀]×100

式中K—DPPH自由基清除率，%；A₀—2mL0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液加2mL无水乙醇的吸光值；A_i—2mL0.04g/L的DPPH无水乙醇溶液加2mL样品的吸光值；A_j—2mL无水乙醇加2mL样品的吸光值。

2）清除羟自由基能力的测定

参考徐怀德等报道的方法（徐怀德，闫宁环，陈伟，等．黑莓原花青素超声波辅助提取优化及抗氧化性研究[J]．农业工程学报，2008,24(2):264-269．），按照下式计算羟自由基（·OH）的清除率：

Y=[1－(A'_i－A'_j)/A'₀]×100

式中Y—羟自由基的清除率，%；A'_i—样品参与反应的吸光值；A'₀—无样品参与反应的吸光值；A'_j—无水杨酸参与的样品反应的吸光值。

3）螯合Fe²⁺能力测定

根据Lee Y L等报道的方法（Lee Y L,Yen M T,Mau J L.Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus[J].Food Chemistry,2007,104:1-9），按照下式计算Fe²⁺的螯合率：

螯合率=（1－A"/A"₀）×100％

式中A"—样品参与反应的吸光值；A"₀—空白吸光值。

实施例1

将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比40mL/g处理2h，用蒸馏水洗至中性，加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.3mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度40℃，提取时间7h，液料比40mL/g，提取结束后在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，将冻干的胶原蛋白配制成2％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至7.5，用蛋白酶alcalase（诺维信食品级alcalase2.4L）在40℃酶解60min，加酶量为2000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。该抗氧化肽产品的抗氧化活性为：清除DPPH自由基的IC₅₀是0.86mg/mL，清除羟自由基能力的IC₅₀为0.91mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为1.35mg/mL。

实施例2

将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比50mL/g处理2.5h，用蒸馏水洗至中性，加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.4mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度45℃，提取时间9h，液料比50mL/g，提取结束后在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，将冻干的胶原蛋白配制成2.5％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至8.0，用蛋白酶alcalase（诺维信食品级alcalase2.4L）在45℃酶解90min，加酶量为3000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。该抗氧化肽产品的抗氧化活性为：清除DPPH自由基的IC₅₀是0.53mg/mL，清除羟自由基能力的IC₅₀为0.72mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为1.01mg/mL。

实施例3

将鮰鱼皮与0.1mol/L NaoH按照液料比60mL/g处理3h，用蒸馏水洗至中性，加入正己烷脱脂，脱脂后，用0.5mol/L乳酸溶液提取胶原蛋白，提取温度50℃，提取时间11h，液料比60mL/g，提取结束后在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，将冻干的胶原蛋白配制成3％（w/v，g/mL）的溶液，调pH至9.5，用蛋白酶alcalase（诺维信食品级alcalase2.4L）在50℃酶解120min，加酶量为4000U/g，酶解结束后，沸水浴灭酶，离心收集上清液，用真空浓缩，冷冻干燥后，得到鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。该抗氧化肽产品的抗氧化活性为：清除DPPH自由基的IC₅₀是0.79mg/mL，清除羟自由基能力的IC₅₀为0.83mg/mL，螯合Fe²⁺能力的IC₅₀为1.26mg/mL。

一种鮰鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法和其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。