专利摘要

本发明涉及一种利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的方法及试剂盒，步骤如下：(1)提取蓖麻种子基因组DNA：(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板进行AP-PCR扩增，引物见序列1；(3)对步骤(2)获得的AP-PCR扩增产物进行凝胶电泳；(4)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板进行RMAPD扩增，引物见序列2和序列3；(5)对步骤(4)获得的RMAPD扩增进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(6)将未知品种的条带与已知品种数据库进行比对，判断蓖麻种子的品种。本方法采用自主开发的试剂盒和实验室常规的PCR技术与电泳技术，从取样到检测完成只需7h左右，且周年都可以进行。简单易行、快速灵敏、结果准确。

说明书

技术领域

本发明属于油料作物种子筛选与鉴定领域，尤其是一种利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的方法及试剂盒。

背景技术

蓖麻(Ricinus communis L.)为大戟科蓖麻属双子叶一年生或多年生草本植物，是世界十大油料作物之一，具有显著的种植价值与工业价值。蓖麻种植遍布世界各地，其中以印度、中国及巴西等国家种植面积最为广泛。蓖麻品种繁多，截止到2011年11月，我国蓖麻种植资源数据库保存有1430个蓖麻品种，随着育种技术的进步，新蓖麻品种也不断涌现。品种的繁多给品种鉴定工作带来一定困难。目前，常用来进行种质资源鉴定的方法主要有形态学鉴定、同工酶标记与分子标记技术，其中种子形态鉴定是根据种子的外部形态特征，借助放大镜、解剖镜等进行观察，与标准样品或鉴定图片及有关资料进行比较，判别真假种子。该法简单、快速、方便、直观，但准确性不高。同工酶标记是利用品种之间同工酶的进化差异而对品种进行鉴定，但其鉴别效果在某些作物尤其是在蓖麻品种鉴定上并不显著，存在蓖麻品种间亲缘较近及传统鉴定方法中分级标准不统一、准确性低、费时费力等缺陷。常规的田间种植鉴定，培养幼苗需3w左右，在此期间，影响因素较多，因而结果准确性低。

分子标记技术不受环境条件、发育时期、器官种类等的限制，从基因组水平上揭示其遗传变异的程度，可在早期进行新品种的鉴定。但目前常用的分子标记具有各自的优缺点，因此，如何根据研究材料和研究目标选择最佳分子标记种类至关重要。目前，已有国内外学者运用AFLP、SSR、ISSR、SNP、RAPD、SRAP等分子标记对来自世界各地不同品种的蓖麻进行了基因多样性的研究，并获得了一系列的遗传指纹图谱。但这些分子标记遇到的共同问题都是基因组多样性较低，一方面是蓖麻本身基因型较少，另一方面与各种分子标记各自的缺陷有关。

AP-PCR是通过随意设计或选择一个非特异性引物，在不严格条件下，使引物与模板DNA中许多序列产生错配与复性，再以严格条件进行正常PCR扩增。扩增结束后通过凝胶电泳分离，比较不同来源基因指纹图谱，反映出待分析基因组的特征。AP-PCR预先不需要知道模板具体情况，模板需求量少，质量要求低，具有快速、灵敏、通用性好等特点，目前，该技术已成功用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物种类及中药材鉴别等各领域。

随机微卫星扩增多态DNA(RMAPD)是2005年蓝贤勇等在RAPD与微卫星(SSR)的基础上发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。RMAPD是一种新型的分子标记，是RAPD的延伸，经证明，该技术与RAPD并不相同，其在扩增程序、扩增引物以及重复性方面都有别于RAPD与SSR。重复性试验结果表明，微卫星标记的重复性最好；RMAPD标记次之；RAPD标记最差。目前，国内已经将其运用在花生、水稻、兰花等作物的种质资源鉴定上，并取得了良好的鉴定效果。可见，这种方法在群体遗传结构和亲缘关系分析以及标记辅助选择等动植物遗传育种领域具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速、准确、低成本、适于小型种子工作站及相关检验部门操作的利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的方法及试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的方法，步骤如下：

(1)提取蓖麻种子基因组DNA：

(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板进行AP-PCR扩增，引物见序列1；

(3)对步骤(2)获得的AP-PCR扩增产物进行凝胶电泳；

(4)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板进行RMAPD扩增，引物见序列2和序列3；

(5)对步骤(4)获得的RMAPD扩增进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(6)将未知品种的电泳条带与已知品种数据库进行比对，判断蓖麻种子品种的真实性。

而且，所述AP-PCR扩增的体系和程序如下：

体系：在25μL扩增体系中，含2×Easy Tap PCR Super Mix 12.5μL，50mM MgCl₂ 1μL，10mM引物序列1 1μL，模板DNA 20ng，用超纯水补足剩余体积至25μL；

扩增程序：两个循环94℃5min，35℃5min，72℃5min，

40个循环94℃1min，50℃1min，72℃2min，

72℃2min，最后72℃10min。

而且，所述RMAPD扩增的体系和程序如下：

在25μL RMAPD体系中：含2×Easy Tap PCR Super Mix 12.5μL，10mM引物序列1和10mM引物序列3各1μL，模板DNA 20ng，超纯水补足至总体积25.0μL；

PCR程序：95℃预变性4min，40个循环，94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸45s→94℃变性30s→36℃退火60s→72℃延伸90s→72℃延伸10min；

而且，所述聚丙烯酰胺凝胶的配置方法为：按分离胶、浓缩胶配方配胶；安装灌制凝胶的玻璃板，取分离胶，将各成分混匀，灌胶至适宜高度，上部立即加满去离子水隔离空气，待分离胶聚合后，除去去离子水；混匀浓缩胶各成分，加至分离胶上，插入齿梳，待浓缩胶聚合；

所述分离胶配方为30％丙烯酰胺28mL、10×TBE 10mL、超纯水71.7mL、40％过硫酸铵200μL、TEMED100μL，总体积100mL；

所述浓缩胶配方为30％丙烯酰胺4mL、10×TBE 0.8mL、超纯水34.96mL、40％过硫酸铵160μL、TEMED 80μL，总体积100mL；

而且，所述分离胶聚合的时间为20min；浓缩胶的聚合时间为30min。

而且，所述步骤(6)的步骤为：根据AP-PCR与RMAPD的扩增产物条带有无分别赋值，有带记为1，无带记为0；将得到的数值进行记录并合并；将已知品种记录至已建立的数据库。

一种利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的试剂盒，包括盒体、3个塑料瓶子与7个1.5mL离心管，其中3个瓶子中分别含有2×Easy Tap PCR SuperMix 5mL、10×TBE缓冲液200mL、TEMED 15mL，7个1.5mL离心管中分别含有40％过硫酸铵1mL、MgCl₂1mL、显色剂、GoldView Ⅰ100μL、10mM引物序列1 300μL、10mM引物序列2 300μL、10mM引物序列3 300μL。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明采用AP-PCR及RMAPD双分子标记法筛选与鉴定蓖麻种子品种真实性与纯度，本方法将实验室常规的PCR技术与电泳技术相结合，从取样到检测完成只需7h左右，且周年都可以进行，简单易行、快速灵敏、结果准确。

2.本发明利用AP-PCR及RMAP D分子标记法筛选与鉴定蓖麻种子品种，仅对蓖麻遗传物质DNA进行检测，无需大田鉴定，与其他实验室技术相比，可大大提高鉴定准确性，节约成本，仅为传统表型鉴定成本的十分之一左右，检测方便、重复性好。

3.本发明所提供的利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的试剂盒，将检测引物与相关试剂组合在一起，操作方便，检测结果稳定可靠，结合常规的分子生物学设备，按提供的操作程序进行实际检测，易于实现标准化，对几十份样品进行检测，其检测时间仅需7-8h，提高了检测效率与标准化程度。

附图说明

图1为本发明的蓖麻DNA的提取结果；

图2为本发明的AP-PCR分子标记扩增图谱，其中，M为DNA分子量标准，1～31为蓖麻测试品种，其中10为待测品种，其他品种为国内已知的30个蓖麻品种；

图3为本发明的RMAPD分子标记扩增图谱；其中，M为DNA分子量标准，1～31为蓖麻测试品种，其中10为待测品种，其他品种为国内外已知的30个蓖麻品种。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的实施例做进一步详述；需要说明的是：本实施例是描述性的，不是限定性的，不能以此来限定本实用新型的保护范围。

本发明的主要原理是：通过对20个AP-PCR引物及84对RMAPD引物进行筛选，得到条带清晰、多态性高的最佳引物组合，并由相关生物技术公司进行合成。经AP-PCR及RMAPD对分别蓖麻品种基因组的不同部位进行标记，再进行联合分析得到已知品种图谱，进而对未知品种进行真实性与纯度鉴定。

本例所述的蓖麻品种均为国内外常见商业品种，编号依次为1～31，其中编号10为待测品种。

一种利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的方法，步骤如下：

1.30个已知蓖麻品种及待测品种基因组DNA提取

提取蓖麻种子DNA，采用CTAB法或者其他提取方法提取均可，要求的DNA纯度较高，完整性较好，将所有品种DNA的浓度统一稀释到50ng/μL。

2.AP-PCR实验

在25μL的扩增体系中，含2×Easy Tap PCR Super Mix 12.5μL，50mM MgCl₂ 1μL，10mM引物1(5`-TACGGTGGCGGAGCGCAGCA-3`)1μL，模板DNA 20ng，用超纯水补足剩余体积。

扩增程序：两个循环(94℃5min，35℃5min，72℃5min)预变性，40个循环(94℃1min，50℃1min，72℃2min)，72℃2min，最后72℃10min。

3.AP-PCR扩增产物的凝胶电泳分析

配制3％的琼脂糖凝胶，使用微波炉将凝胶融化至清澈透明时，冷却至60℃，按5μL/100mL加入GoldView I，混匀，室温冷却凝固。取1μL DNA与5μL 6×Loading buffer(30mM EDTA，0.05％溴酚蓝、36％甘油，0.05％二甲苯蓝)混合后进行电泳，至溴酚蓝到达凝胶的三分之二位置处停止电泳，用凝胶系统进行观察、照相；

4.RMAPD实验

在25μL RMAPD体系中，含2×Easy Tap PCR Super Mix 12.5μL，10mM引物2(5`-ATAATAATAATAATAATA-3`)1μL，10mM引物3(5`-CAGCACCCAC-3`)1μL，模板DNA 20ng，超纯水补足至总体积25.0μL。

PCR程序：95℃预变性4min→40个循环(94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸45s→94℃变性30s→36℃退火60s→72℃延伸90s)→72℃延伸10min；程序结束后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳

按照分离胶的配方(30％丙烯酰胺28mL、10×TBE 10mL、超纯水71.7mL、40％过硫酸铵200μL、TEMED100μL，总体积100mL)配制分离胶，聚合时间为20min左右；按照浓缩胶配方(30％丙烯酰胺4mL、10×TBE 0.8mL、超纯水34.96mL、40％过硫酸铵160μL、TEMED 80μL，总体积100mL)配制浓缩胶，聚合时间为30min左右。

安装灌制凝胶的玻璃板，将分离胶各组分混匀，灌胶至胶板五分之四高度处，上部立即加1mL正丁醇隔离空气，待分离胶聚合后，除去正丁醇。混匀浓缩胶各成分，加至分离胶上，插入齿梳，待30min后浓缩胶即可聚合。拔除齿梳，备用；取10μL样品点样，30mA电流恒流电泳。用5u/100mL的Goldview Ⅰ染色30min，在凝胶成像系统下观察，照相。

6.条带处理与数据分析

根据AP-PCR与RMAPD的扩增产物条带有无分别赋值，有带记为1，无带记为0。将得到的数值进行记录并合并。

7.已知品种数据库的建立及待测品种图谱

根据凝胶电泳结果(见图2与图3)，建立除待测蓖麻品种之外的已知蓖麻品种数据库(见表1)，将待测品种(编号10)与其进行比对，可准确检测出待测品种数据与编号9一致，进而确定该未知品种为与编号9的品种一致。

结果表明，本鉴定方法准确，而且具有快速、不受外界干扰等特点。

一种利用AP-PCR及RMAPD分子标记筛选与检测蓖麻种子真实性与纯度的试剂盒，包括盒体、3个塑料瓶与7个1.5mL离心管，其中3个瓶子中分别含有2×Easy Tap PCR SuperMix 5mL、10×TBE缓冲液200mL、TEMED 15mL，7个1.5mL离心管中分别包括40％过硫酸铵1mL、MgCl₂ 1mL、显色剂、GoldView Ⅰ100μL、10mM引物序列1 300μL、10mM引物序列2 300μL、10mM引物序列3 300μL。

试剂盒的使用方法及步骤为：

(1)已知蓖麻品种及待测蓖麻品种基因组DNA提取：采用CTAB法或者其他提取方法提取DNA均可，要求的DNA纯度较高，完整性较好，将所有品种DNA的浓度统一稀释到50ng/μL。

(2)AP-PCR实验：在25μL扩增体系中，含2×Easy Tap PCR Super Mix 12.5μL，50mM MgCl₂ 1μL，10mM引物序列1(5`-TACGGTGGCGGAGCGCAGCA-3`)1μL，模板DNA 20ng，用超纯水(需自备)补足剩余体积。扩增程序：两个循环(94℃5min，35℃5min，72℃5min)预变性，40个循环(94℃1min，50℃1min，72℃2min)，72℃2min，最后72℃10min。PCR产物用3％琼脂糖(需自备)检测，用试剂盒所配的Goldview Ⅰ进行染色。凝胶成像系统下观察，照相。

(3)RMAPD实验：在25μL RMAPD体系中，含2×Easy Tap PCR Super Mix 12.5μL，10mM引物序列2(5`-ATAATAATAATAATAATA-3`)1μL，10mM引物序列3(5`-CAGCACCCAC-3`)1μL，模板DNA 20ng，超纯水补足至总体积25μL。PCR程序：95℃预变性4min→40个循环(94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸45s→94℃变性30s→36℃退火60s→72℃延伸90s)→72℃延伸10min；程序结束后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离胶配方为30％丙烯酰胺(需自备，其中丙烯酰胺∶N，N′-甲叉双丙烯酰胺为29∶1)28mL、10×TBE 10mL、超纯水71.7mL、40％过硫酸铵200μL、TEMED100μL，总体积100mL，聚合时间为20min；浓缩胶配方为30％丙烯酰胺4mL、10×TBE 0.8mL、超纯水34.96mL、40％过硫酸铵160μL、TEMED 80μL，总体积100mL，聚合时间为30min。安装灌制凝胶的玻璃板，将分离胶各成分混匀，灌胶至胶板五分之四高度处，上部立即加1mL正丁醇隔离空气，待分离胶聚合后，除去正丁醇。混匀浓缩胶各成分，加至分离胶上，插入齿梳。待浓缩胶聚合，拔除齿梳，备用；取10μL样品点样，30mA电流恒流电泳。用5u/100mL的Goldview Ⅰ染色30min，在凝胶成像系统下观察，照相。

(4)条带处理与数据分析：根据AP-PCR与RMAPD的扩增产物条带有无分别赋值，有带记为1，无带记为0。将得到的数值进行记录并合并。

(5)已知蓖麻品种数据库的建立及待测蓖麻品种图谱：根据凝胶电泳结果，建立除待测品种之外的已知蓖麻品种数据库，将待测蓖麻品种与其进行比对，确定待测蓖麻品种。若比对结果与已知蓖麻品种数据库不一致，则需增加已知蓖麻品种数据库的品种数量，重新建立一个比已知蓖麻品种数据更大的图谱库，再按照本专利中的方法进行检测。

(6)真实性及纯度检测

任意选取所需检验蓖麻种子100粒，采用试剂盒及相同方法进行联合PCR反应，计算相似条带个数，计算公式为：品种纯度＝(相似条带蓖麻品种个数/100)×100％。

表1利用AP-PCR及RMAPD分子标记筛选与鉴定蓖麻种子真实性与纯度的方法的联合数据库

一种利用双分子标记鉴定蓖麻种子品种真实性的方法及试剂盒专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。