专利摘要

本发明涉及一种具有高效胆固醇降解能力的红曲霉M3菌株，其特征在于：属于(Monascus sp.)红曲霉，其保藏编号：CGMCC No.4618，保藏日期：2011年03月07日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京。本发明通过对红曲霉M3菌株胆固醇降解特性的研究，得到对胆固醇降解率较高的红曲霉菌株，为红曲霉降解胆固醇的研究奠定基础，对筛选其它降解胆固醇微生物具有指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，尤其涉及一种具有高效胆固醇降解能力的红曲霉M3菌株。

背景技术

胆固醇又称胆甾醇，是人体必须的营养成分，是质膜、内质网、线粒体、高尔基体等细胞器的组成成分之一，与膜的通透性密切相关，也是体内许多激素的合成原料和前提物质，在体液免疫、神经传导和物质代谢中均发挥着重要的生理作用。若体内的胆固醇含量过低，机体对异物的清除能力将大大下降，从而导致致癌机率的上升；胆固醇在体内脱去C-7及C-8上的氢形成7-脱氢胆固醇，而7-脱氢胆固醇多存在于皮肤内，经紫外线照射可转变为维生素D3，主要用于调节钙、磷代谢，维持骨骼的正常生长发育；有助于血管壁的修复与保持完整。当血清胆固醇含量较低时，血管壁会变脆弱，有可能引起脑出血；在人体内，胆固醇还能形成胆酸，促进脂肪的消化。

胆固醇在体内分为高密度胆固醇和低密度胆固醇两种。高密度胆固醇对血管有保护作用，但低密度胆固醇如果偏高，患冠心病的危险因素会增加。低密度胆固醇也是导致心脑血管疾病即动脉粥样硬化的元凶，它能使血管变得狭窄或者阻塞，当其过量时会导致高胆固醇血症，对机体产生不利影响。研究还发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症与高胆固醇血症密切相关。

研究和利用具有降解胆固醇功能的微生物及其酶或活性物质以降低食品和人体血清中的胆固醇已受到广泛关注。红曲霉(Monasus sp.)是我国传统的药、食两用真菌，已广泛用于各种食品制造。研究表明，红曲霉的次生代谢产物--Monacolin K对胆固醇的生物合成有抑制作用。在胆固醇合成途径中，甲基二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是控制胆固醇合成速度的关键酶，而Monacolin K对该酶具有特异性抑制作用，通过底物竞争，使HMG-CoA无法正常与HMG-CoA还原酶结合生成下游产物--甲羟戊酸，从而抑制胆固醇合成，减少机体内胆固醇含量。目前尚未发现有关红曲霉菌直接降解胆固醇的报道。发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高效胆固醇降解能力的红曲霉M3菌株，本发明提供的红曲霉M3菌株代谢产物中具有较高的胆固醇降解特性，在其发酵产物中检测出的胆固醇氧化酶是自然界中催化胆固醇氧化所需的酶。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的优点和积极效果如下：

1.本发明提供的红曲霉M3菌株在降解胆固醇时随着接种量的增加，胆固醇降解率也随之上升；当接种量达到8％时，其胆固醇降解率达到74.93％。

2.本发明提供的红曲霉M3菌株对胆固醇的降解率会随发酵时间延长而提高，培养8～10d，M3菌株对胆固醇降解率不断提高，10d后对胆固醇降解率趋于稳定。

3.本发明提供的红曲霉M3菌株在胆固醇浓度较低时，会随胆固醇浓度的升高而对胆固醇的降解率也升高；当胆固醇浓度为0.5mg/mL时，对胆固醇降解率最高，当胆固醇浓度高于此浓度时，M3菌株对胆固醇的降解率呈下降趋势。

4.本发明提供的红曲霉M3菌株还可以进一步诱导驯化，通过胆固醇降解试验对比，诱导驯化后的菌株对胆固醇的降解率较诱导前提高11％。

5.本发明通过对红曲霉M3菌株的胆固醇降解特性的研究，得到对胆固醇降解率较高的红曲霉菌株，为红曲霉菌降解胆固醇的研究奠定基础，对筛选其它降解胆固醇微生物具有指导意义。

附图说明：

图1为本发明红曲霉M3菌株的菌落形态；

图2为本发明红曲霉M3菌株在发酵周期内对胆固醇降解率变化曲线；

图3为本发明不同接种量的红曲霉M3菌株对胆固醇降解率；

图4为本发明M3菌株对不同浓度胆固醇降解率的影响；

图5为本发明红曲霉M3菌株在发酵前期、中期及后期的发酵液GC-MS分析结果；

图6为胆固醇GC-MS分析图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种具有高效胆固醇降解能力的红曲霉M3菌株，为红曲霉(Monascus sp.)，其保藏编号：CGMCC No.4618，保藏日期：2011年03月07日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京，其形态学特征在于：在显微镜下观察菌丝间有横隔，可以通过产生有性孢子囊产生子囊孢子的方式进行有性生殖，成熟后子囊孢子从孢子囊中散开，也可以通过分生孢子进行无性生殖，有性孢子着生在菌丝上形成分生孢子链，孢子链较直，在PDA培养基上30℃培养10d，菌丝呈粉红或浅红色。

红曲霉M3的筛选过程如下：

红曲霉菌株来源是天津科技大学食品生物技术实验室保藏菌种，筛选培养基为PDAO-CHOL选择培养基。将红曲霉菌株接种于筛选培养基中，32℃ 180r/min摇床中发酵10-14d，通过测定发酵周期内对胆固醇降解率的变化；确定不同接种量的红曲霉菌株对培养基中胆固醇降解能力的差异；确定胆固醇浓度对红曲霉菌株降解特性的影响以及定向诱导实验等筛选方法，得到具有较强降解胆固醇的能力的菌株，命名为红曲霉M3。根据饭冢广和林庆福的红曲霉分类检索表，确定红曲霉M3为蛛网状红曲菌(M.araneosus sp.M3)。

一、本发明中红曲霉M3菌株的性质

(一)培养基配方

1.菌种保藏培养基配方(每1000mL含)：可溶性淀粉50g，麦芽糖40g，蛋白胨30g，琼脂20g。

2.固体平板培养基配方(每1000mL含)：可溶性淀粉50g，麦芽糖40g，蛋白胨30g，琼脂20g。

3.种子培养基配方(每1000mL含)：大米粉30g，KH₂PO₄ 2.5g，NaNO₃ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g；用乳酸调pH至4.5左右。

4.PDAO-CHOL选择培养基配方：在PDA培养基中，分别加入不同质量的胆固醇，使胆固醇胶束溶液浓度分别为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL。

5.发酵培养基的成分(每1000mL含)：大米粉100g，豆粉5g，NaNO₃ 2g；用乳酸调pH至5.5左右。

以上培养基的灭菌条件为121℃，20min。

(二)菌株培养方法

1.本发明红曲霉M3菌株保存于4℃冰箱中，用保藏培养基进行菌种活化传代，每4周转接一次；菌种使用前需要活化。

2.将新鲜的菌种斜面加入5mL无菌蒸馏水，用孢子铲将斜面中的孢子刮下，制成菌悬液，加入种子培养基中，37℃ 180r/min培养30h，得到种子液。

3.向直径为9cm的培养皿中加入20mL固体平板培养基，将上述菌悬液5μL加到平板的正中央，待菌液干燥后转入培养箱中，37℃培养10d。

4.100mL三角瓶中装有30mL的发酵培养基，根据实验的具体内容，接入不同百分比的种子液，32℃，180r/min摇床中发酵10-14d。

(三)胆固醇降解特性

1.测定红曲霉M3菌株在发酵周期内对胆固醇降解率的变化

从发酵第5d开始，每隔24h进行取样，每次随机抽取三个平行样，通过对发酵过程中培养基中胆固醇含量的动态变化，研究红曲霉生长情况及其对胆固醇的降解率。

图2为红曲霉M3菌株在发酵周期内对胆固醇的降解情况。从图2可以看出，胆固醇降解率随时间延长而提高。试验发现，培养8～10d，M3菌株胆固醇降解率迅速提高，10d后对胆固醇降解率趋于稳定。因此，确定M3菌株培养时间为10d。

2.不同接种量的红曲霉M3菌株对培养基中胆固醇降解率的差异

发酵至第10d时，测定培养基中胆固醇的剩余量，计算胆固醇的降解率。

图3为不同接种量的M3菌株对胆固醇降解的情况。由图3可以看出，随着接种量的增加，胆固醇降解率也随之上升；当接种量达到8％时，降解率达到最高值，接种量大于8％时由于红曲霉生长所需营养物质有限，且菌体过多导致菌丝团，影响发酵通气量，影响菌体生长，对胆固醇的降解率降低。在接种量为8％时，其胆固醇降解率达74.93％。

3.胆固醇浓度对红曲霉M3菌株降解特性的影响

配制含有不同胆固醇浓度的PDA-CHOL培养基，接入8％的红曲霉M3菌株，发酵至第10d，测定培养基中胆固醇的剩余量，计算胆固醇的降解率。

图4为不同浓度胆固醇浓度对红曲霉M3菌株降解胆固醇的影响。从图4可以看出，当胆固醇浓度较低时，M3菌株随胆固醇浓度的升高而对胆固醇的降解率上升；当胆固醇浓度为0.5mg/mL时，对胆固醇降解率最高。当胆固醇浓度高于此浓度时，M3菌株的胆固醇降解率呈现下降趋势。这可能与高浓度胆固醇对微生物菌种的抑制作用有关。由试验可知，当胆固醇浓度较低时(小于0.5mg/mL)，菌体干重所受影响不大，但当胆固醇浓度过高时，胆固醇会抑制红曲霉生长导致菌体干重下降，表明菌株对胆固醇降解与其生长状态具有较为密切的关系。

4.定向诱导实验方法

将红曲霉M3菌株接种到含0.5mg/mL胆固醇的诱导培养基平板上，培养一定时间，制成菌悬液，再次接入含有0.65mg/mL胆固醇的选择培养基进行驯化。每驯化一次，胆固醇的浓度都要增加0.15mg/mL，5次驯化后，培养基中胆固醇含量达到1.1mg/mL，测定M3菌株在驯化前后对胆固醇降解率的变化。

定向诱导实验中M3菌株对胆固醇降解效果见表1。

表1诱导前后M3菌株对胆固醇降解率的影响

由表1可知，经定向诱导驯化后，菌株对胆固醇降解作用有一定的提高。诱导驯化后菌株对胆固醇的降解率较诱导前提高11％。

二、本发明中红曲霉M3菌株的代谢产物降解胆固醇的机理

(一)胆固醇氧化酶的测定

1.药品溶液配制

溶液I：4-氨基-安替比林1mmol/L；苯酚6mmol/L；磷酸钾缓冲液(pH＝7.5)25mmol/L；叠氮钠0.02％；辣根过氧化物酶7000U/L；

溶液II：过氧化氢2.584mmol/L；溶液C：胆固醇/异丙醇溶液(含Triton X-100，4.26％)0.826％；

溶液III：胆固醇/异丙醇溶液(含Triton X-100，4.26％)0.826％。

2.标准曲线的绘制

取溶液I  3mL于试管中，37℃保温3min；加入不同量溶液II，反应5min，在500nm处测定吸光度(A)。

3.测定酶活

取溶液I  3mL，溶液III  150μL于试管中，37℃保温3min，加入3mL发酵液，准确反应5min，于沸水中加热3min，冷却后，在500nm处测定吸光度(A)。

胆固醇氧化酶酶活的定义为：在37℃，pH＝7.5，1min内，催化1μmol胆固醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮所需的酶。根据酶活定义和过氧化氢浓度标准曲线方程，可以得出酶活的计算公式为：

酶活(U/L)＝0.013A₅₀₀×1000×V×K÷T×1000   (1)

其中，A：反应液吸光度；V：反应液体积(mL)；K：发酵液液稀释倍数(1/mL)；T：反应时间(min)。

4.经计算，红曲霉M3菌株发酵液中胆固醇氧化酶酶活力为150U/L，目前，还没有红曲霉代谢胆固醇氧化酶的报道。

(二)胆固醇还原酶的测定

1.发酵液前处理。使用二氯甲烷对发酵液进行萃取，脱水后稀释至适当浓度待测。

2.色谱条件。色谱柱：HP-5ms，30m×0.25mm×0.25μm；载气：高纯氦气；柱流速：1mL/min；检测器：质谱EI检测；进样口温度：260℃；进样方式：无分流进样；进样量：1μL；柱温条件：初始温度80℃保持3min，以5℃/min速度开始升温，达到285℃后保持14min。

3.质谱条件。离子源：四级杆离子源；质量扫描范围mPz：50amu～550amu；电离方式：EI；电子能源：70ev；接口温度：280℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；扫描方式：SIM；溶剂延迟：3min。

4.GC-MS分析。图5和图6分别为M3菌株发酵液及胆固醇的GC-MS分析图。由图5、图6可以看出，红曲霉M3菌株降解前期、中期、后期胆固醇含量的差异极大，降解中、后期胆固醇含量下降明显，发酵前后胆固醇含量的差异从另一方面证实了M3菌株具有较高的降解胆固醇能力。

由图5、表2并通过质谱分析可以看出，红曲霉M3菌株降解后培养液中的少量物质均为具有苯环结构的芳香族未知大分子物质，而并非文献中报道的胆固醇经胆固醇还原酶作用的降解产物为粪甾醇、类固醇、胆甾酮等物质。通过质谱分析，发酵液中并无粪甾醇成分，从而推断出发酵过程中红曲霉M3菌株没有胆固醇还原酶生成。

表2胆固醇的特征离子量

具有高效胆固醇降解能力的红曲霉M3菌株专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。