专利摘要

本发明涉及一种洋葱提取物的制备方法及在延长线虫寿命中的应用，制备方法为提取物制备，经多次提取、纯化、浓缩，得到洋葱提取物。本发明制备的洋葱提取物对延长线虫寿命效果明显，发现30μg/mL洋葱提取物(含槲皮素80％以上)能显著延长秀丽线虫的寿命和最大寿命，优于维生素E的作用效果，能显著提高线虫SOD、CAT表达量和热激实验的存活率。

说明书

技术领域

本发明属于食品、医药技术领域，尤其是一种洋葱提取物的制备方法及在延长线虫寿命中的应用以及包括洋葱提取的食品。

背景技术

洋葱是一种集营养、医疗和保健于一身的特色蔬菜，在欧美被誉为“蔬菜皇后”。洋葱中含有挥发油、黄酮等众多活性物质，具有消炎抑菌、预防慢性支气管炎、治疗浮肿、腹泻、祛痰、利尿、降血糖和预防心血管疾病等生理功能。对洋葱的深入研究将会为延缓衰老、抗氧化、降血糖、降血脂、抗血栓、抗癌等天然药物的开发利用提供新的材料，为人类健康做贡献。

长期以来，科学家们对衰老机理众说纷纭；在众多衰老学说中，以自由基学说最受重视，目前人们普遍认为：衰老主要是由于身体的正常防卫及修复机能衰退导致的。根据衰老的自由基理论，在正常生物体新陈代谢过程中产生的活性氧自由基(ROS)，尤其是超氧阴离子自由基(O_2-)是引起衰老以及与衰老相关疾病的主要原因之一。

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans，简称线虫)，作为研究体内抗衰老作用的模式动物有许多优点，如易培养、繁殖快；以整体为对象，实验规模容易放大、线虫身体透明；与其寿命相关的遗传和环境背景较清晰等特点，适合进行衰老干预效果的评价和机制研究，将其与我国的中药、传统食品及天然产物进行结合，使其成为功能/保健食品开发的工具是当务之急。中草药成分极其复杂，各种生物碱类、甙类、酮类等天然小分子化合物，其生物活性鉴定完全可以利用低成本高效率的线虫作为评价模型。

目前，在有关洋葱的专利报道中多集中于洋葱精油及洋葱食谱研究上，尚未发现关于洋葱黄酮类提取物对线虫寿命影响方面的专利。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种纯度高、制备方法简单的洋葱提取物的制备方法及在其延长线虫寿命中的应用以及包括洋葱提取的食品。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种洋葱提取物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取洋葱、切碎、烘干、粉碎、过60-80目筛，得洋葱干燥粉末；

(2)按洋葱粉末与萃取剂比为1∶15-20g/mL回流提取2-3次，浸提温度65-75℃，浸提2-4h，在浸提过程中，每隔0.5h间歇搅拌原料2-3次，每次3-5min，提取后滤出提取液并合并；

(3)将提取液浓缩至总体积的5％--15％，活性炭脱色，过滤；先用2-3倍体积的石油醚萃取，再用2-3倍体积乙酸乙酯萃取2-5次，合并滤液，浓缩，干燥至粉末；

(4)用60-70倍粉末体积的硫酸水溶液进行回流水解1.5--2h，浓缩，将得到的浓缩料液泵入聚酰胺吸附柱上，以1mL/min上样流速，吸附30min，用3-5倍体积的蒸馏水洗涤去除杂质；用75％--85％乙醇洗脱，洗脱流速1mL/min，收集乙醇洗脱液；减压浓缩，得到洋葱提取物。

而且，所述萃取剂为：乙醇。

而且，所述硫酸水溶液的浓度为3％(v/v)。

而且，所述洋葱提取物中槲皮素的纯度为80％--95％。

洋葱提取物在延长线虫寿命中的应用。

一种食品，其特征在于：食品包括洋葱提取物。

而且，所述食品包括食品、保健品、饮品和食品添加剂。本发明的优点和积极效果如下：

1.本发明制备的洋葱提取物对线虫寿命有较大影响，其中30μg/mL洋葱提取物(含槲皮素80％以上)能显著延长秀丽线虫寿命和最大寿命，能显著提高线虫SOD、CAT表达量和热激实验的存活率，优于维生素E的作用效果。

2.本发明提供一种纯度高、制备方法简单的洋葱提取物的制备方法，提取物经冻干形成洋葱提取物冻干粉，经HPLC检测，主要成分为槲皮素且纯度达到80％-95％。

3.本发明制备的洋葱提取物可以制备成延缓衰老药物、保健品或食品添加剂，可制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等多种形式，制成的产品包括药物、食品或保健品及其配料等，用途广泛。

附图说明：

图1为本发明不同浓度的洋葱提取物对线虫平均寿命影响的柱形图；

图2为本发明实施例1制备的线虫生存曲线图；

图3为本发明洋葱提取物对线虫SOD表达量的影响；

图4为本发明洋葱提取物对线虫CAT表达量的影响；

图5为本发明洋葱提取物对线虫存活率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一、洋葱提取物的制备方法，步骤如下：

(1)准确称取新鲜洋葱并洗净，切成丝状，在烘箱中烘干(55-65℃)，用粉碎机粉碎，过60-80目筛，得干燥粉末；

(2)将洋葱按原料与萃取剂(乙醇)之比为1∶15-20(g/ml)进行混合，回流提取2-3次，浸提温度65-75℃，浸提时间2-4h，在浸提过程中，每隔0.5h间歇搅拌原料2-3次，每次3-5min，提取过程结束后滤出料液并合并；

(3)将提取液放入旋转蒸发仪中减压浓缩，浓缩至总体积的10％，萃取剂回收再利用，活性炭脱色，过滤；先用石油醚萃取，除去脂溶性物质，再用乙酸乙酯萃取3次，合并滤液，浓缩后干燥至粉末；

(4)用60-70倍体积的3％(v/v)硫酸水溶液进行回流水解1.5-2h，再旋转蒸发，将得到的料液泵入聚酰胺吸附柱上，以1mL/min上样流速，吸附30min，用3-5倍体积的蒸馏水洗涤去除杂质；用80％乙醇洗脱，洗脱流速1mL/min，收集乙醇洗脱液；用旋转蒸发仪减压浓缩收集乙醇洗脱液，回收溶剂，得到洋葱提取物，将浓缩液冷冻干燥的洋葱提取物冻干粉；

(5)冷冻干燥后得到洋葱提取物冻干粉，经HPLC检测，主要成分为槲皮素，纯度达到80％-95％。

二、洋葱提取物在延长线虫寿命的应用

实验方法：参照文献(Lakowski B，Hekimi S.The genetics of caloric restriction inCaenorhabditis elegans，1998，95：13091-13096)等方法测定洋葱提取物对线虫寿命的影响。

寿命实验：将同期化后的线虫置于含或不含受试物的NGM板内，发育为L4期后的线虫转入相应浓度实验板中，此时记为寿命实验day 0；隔天观察线虫，并记录线虫生存、死亡及剔除出实验的条数。对线虫死亡判断标准：无移动及吞咽动作，轻触后仍无任何反应。剔除标准：①逃离至平皿壁或盖上而干死；②虫卵在体内孵化而成袋样虫；③钻入琼脂中。实验板中含12.5μg/mL 5-Fu及不同浓度受试物。DMSO在实验中终浓度＜1％。全部实验板置于20℃下培养。实验浓度分别为10μg/mL，30μg/mL，50μg/mL；对照组为维生素E。

统计学分析：实验均重复2-3次以上，采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析实验结果。

表1为20℃时不同浓度洋葱提取物对野生型秀丽线虫寿命延长统计表。

表1不同浓度洋葱提取物对野生型秀丽线虫寿命延长统计表(20℃)

注：^★最大寿命为群体最后生存10％的平均寿命，计算时四舍五入；与空白组比较：^*p＜0.01，^**p＜0.05；与VE组比较：^△p＜0.05

由表1可以看出，洋葱提取物能延长秀丽隐杆线虫的寿命，洋葱提取物与同剂量的维生素E相比，其寿命延长及抗氧化效果更为显著，两者相比有显著性差异(P＜0.05)

三、洋葱提取物对线虫SOD、CAT含量的影响

SOD、CAT含量的测定：在线虫培养基中加入相应药物，20℃培养48h，1200r/min离心2-5min收集线虫，弃去上清，虫体继续用预冷的M9缓冲液清洗3-5次以除去幼虫和附着在虫体和肠壁内的药物；用M9缓冲液将线虫定容到300μL，移入匀浆器中，在冰浴中进行匀浆。匀浆液定容至500μL，加入1％Chaps buffer至1mL，在冰浴中放置5min，4℃，10000r/min离心10min，收集上清液，4℃保存备用；再按照测定试剂盒(南京建成生物工程公司)说明书测定SOD、CAT含量。

实验结果如图3、图4所示，表明洋葱提取物显著提高线虫SOD、CAT表达量，具有良好的抗氧化和/或抗衰老效果。

四、线虫热激实验

实验方法：在正常培养条件下同期化培养线虫至L4期，将一定数量的雌雄同体野生型线虫挑取到线虫生长培养基NGM实验板中，NGM实验板分别为洋葱提取物组(浓度为30μg/mL)、VE对照组(浓度为25μg/mL)及空白组，将实验板放入35℃培养箱中培养。每隔1h记录线虫存活、死亡、剔除的数目，直至线虫全部死亡，死亡标准同寿命实验。实验重复2-3次，取平均值做为最后结果。

实验结果如图5所示，表明洋葱提取物具有抗氧化自由基的活性，可显著提高线虫的存活率，具有延长线虫寿命的作用，效果明显优于VE，并存在显著差异(p＜0.05)。

五、包括洋葱提取物的食品

本发明制备的洋葱提取物可以制备成延缓衰老药物、保健品或食品添加剂，可制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂等多种形式，制成的产品包括药物、食品或保健品及其配料等，用途广泛。

洋葱提取物的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。