专利摘要

本发明涉及一种Viili中胞外多糖及其制备方法，Viili胞外多糖的提取主要包括酶解、脱蛋白、乙醇沉淀等步骤；胞外多糖的分离纯化主要包括离子交换层析及凝胶过滤层析。本发明还公开了一种Viili中胞外多糖的组成，主要由鼠李糖、阿拉伯、木糖、苷露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为：7.41∶15∶8.85∶1∶3.25∶1.25，该胞外多糖的单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在。本发明Viili胞外多糖的制备方法及产品适于作为脂质体纳米材料及功能性食品中的功能因子，有利于某些特殊药物载体材料及新型功能食品开发。

说明书

技术领域

本发明属于乳制品深加工领域，涉及一种胞外多糖的提取方法，尤其一种Viili胞外多糖及其制备方法。

背景技术

胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或荚膜多糖，易与菌体分离。微生物多糖不仅可以作为胶凝剂、保鲜剂、乳化剂、成膜剂等添加剂用于食品和制药行业来改变产品的黏度和硬度，而且还具有抗氧化、抗衰老、增强免疫以及降胆固醇等多种功能。因此，这些多糖成为具有特定生理活性物质的重要来源，开发和利用这些具有特定生理功能的胞外多糖已经成为药物研究和功能食品生产的前沿领域之

Viili是一种起源于北欧的传统发酵乳制品，又叫Vilia，Filia，是芬兰的一种民俗食品，质地黏稠，与我国传统的酸乳相似，呈丝状，味美，微甜，风味独特。Viili中含有细菌、酵母菌和丝状真菌等多种微生物。Viili独特的黏稠性被认为是由其中乳酸菌产生的胞外多糖所致，据报道，Viili胞外多糖能降低小鼠血液中胆固醇的水平，也具有由B淋巴细胞有丝分裂活动刺激所介导的抗癌特性。此外，Viili胞外多糖还具有促进益生菌与肠黏膜的吸附等重要生理活性。

目前，有关胞外多糖的专利报道多集中在真菌多糖和部分细菌多糖，没有关于Viili酸乳中胞外多糖的专利。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种单糖种类多、纯度高、易溶于水的Viili胞外多糖及其制备方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种Viili中胞外多糖的制备方法，方法步骤如下：

(1)发酵：纯牛乳灭菌，按1％～3％接种量接种Viili，将接种后的牛乳置于25-35℃培养箱中，培养15～17h后取出，置于4℃冰箱中4～8h，得到发酵乳；

(2)等电点法除酪蛋白：用饱和NaOH溶液调发酵乳的pH至8.0，离心、取上清液，再用HCl调节上清液pH至4.6，再离心，再调上清液的pH至7.5；

(3)酶解：在上述上清液中加入1/6总体积的胰酶液，胰酶液浓度为2-5g/L，水浴下酶解2-3h，3000r/min，离心15min，得到酶解液；

(4)脱蛋白：以酶解液∶氯仿∶正丁醇＝30∶8∶1进行蛋白质沉淀1-3h，离心，去除沉淀，得到的滤液中无游离蛋白；

(5)乙醇沉淀：将步骤(4)所得滤液预冷，加入5～6倍体积的预冷无水乙醇，置于1-5℃冰箱中沉淀40-55h，本步骤中多糖呈絮状沉淀析出，取沉淀；

(6)透析：将经过步骤(5)得到的沉淀用截留14kDa分子量的透析袋在超纯水中透析25-30h，得沉淀物，在低于50℃下进行真空干燥，得到Viili胞外粗多糖。

而且，所述Viili胞外粗多糖还经过以下步骤：

离子交换柱层析：将Viili胞外粗多糖用5mL蒸馏水溶解，上DEAE纤维素柱，每管4mL分管收集，洗脱步骤如下：

①使用去离子水洗脱DEAE纤维素柱，得到一种胞外多糖组分V-I，出现在第6～40管中，最高吸收峰OD值达到0.76，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来；

②使用0.1mol/L的NaHCO₃洗脱DEAE纤维素柱，得到两种多糖组分V-II、V-III，分别出现在第6～10管、第21～40管中，其最高峰OD值分别为0.45和0.12，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来；

③使用0.1mol/L的NaOH洗脱DEAE纤维素柱，得到一种胞外多糖组分V-IV，出现在第20～32管中，其最高峰OD值为0.07，当洗脱超过2h后没有明显的多糖成分被洗脱下来。

而且，所述Viili胞外粗多糖还经过以下步骤：

凝胶过滤层析：取含糖量最高的多糖V-I组分20mg用适量水溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，上Sephendex G-50柱，用去离子水平衡48h，恒流泵控制流速9mL/h，用同一去离子水洗脱，每管3mL分部收集，硫酸-苯酚法检测，收集洗脱峰部洗脱液，经真空浓缩、冷冻干燥获得白色粉状的胞外多糖纯品V-1，纯度大于99％。

一种Viili胞外多糖，其特征在于：由上述Viili胞外多糖的制备方法制备得到。

而且，所述Viili胞外多糖由鼠李糖、阿拉伯、木糖、苷露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为：7.41∶15∶8.85∶1∶3.25∶1.25。

而且，所述Viili胞外多糖的单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在。

而且，所述本Viili胞外多糖为纯白色或略带浅黄的粉末状固体，无味，无香气，易溶于水在热水中溶解度极大，不溶于丙酮和乙醇、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明制备的胞外多糖为纯白色或略带浅黄的粉末状固体，无味，无香气，易溶于水，特别是在热水中溶解度较大，其单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在，产品的纯度较高，基本不含有核酸、蛋白质及其他杂质成分。

2、本发明制备的Viili胞外多糖的主要成分包括鼠李糖、阿拉伯、木糖、苷露糖、葡萄糖以及半乳糖，其摩尔比为：7.41∶15∶8.85∶1∶3.25∶1.25，适于作为脂质体纳米材料及功能性食品中的功能因子，有利于某些特殊药物载体材料及新型功能食品开发。

附图说明

图1为本发明Viili胞外多糖在Sephendex-50凝胶柱上的洗脱曲线图；其中，纵坐标为洗脱液经过硫酸-苯酚比色法在n＝490nm处的光吸收值OD，横坐标为洗脱时间；

图2为本发明凝胶过滤后的Viili胞外多糖V-1紫外扫描图谱；

图3为本发明Viili胞外多糖V-1的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明的Viili胞外多糖是从商品Viili接种的发酵乳中得到。

一种Viili胞外多糖的制备方法，步骤如下：

(1)发酵：将500mL鲜牛乳经115℃瞬时灭菌后，接入10mL Viili，置于31℃培养箱中，培养16h，培养结束后取出置于4℃冰箱中8h；

(2)等电点法除酪蛋白：将冰箱中的酸乳取出，用饱和NaOH溶液调发酵乳的pH至8.0，4000r/min离心15min，取上清液、用HCl调节上清液pH至4.6，4000r/min离心15min，再调上清液的pH至7.5；

(3)酶解：加入1/6体积的胰酶液(购自Whatman公司)，浓度为3g/L，现配现用，40℃水浴酶解2.5h后，3000r/min，离心15min；

(4)脱蛋白：将酶解液酶解后去除蛋白，以酶解液∶氯仿∶正丁醇＝30∶8∶1进行蛋白质沉淀，离心，去除沉淀，得到的滤液中无游离蛋白；

(5)乙醇沉淀：将步骤(4)所得滤液预冷，加入5倍体积的预冷无水乙醇，置于4℃冰箱中沉淀48h，本步骤中多糖呈絮状沉淀析出，取沉淀；

(6)透析：将经过步骤(5)得到的沉淀用截留14kDa分子量的透析袋在超纯水中透析25-30h，得沉淀物，在低于50℃下进行真空干燥，得到Viili胞外粗多糖。经计算，1L Viili发酵乳可得到650.60mg胞外粗多糖，其纯度大于96％。

(7)离子交换柱层析：将Viili胞外粗多糖用5mL蒸馏水溶解，上DEAE纤维素(2.5×50cm)柱，每管4mL分管收集，洗脱步骤如下：

①使用去离子水洗脱得到一种胞外多糖组分V-I，出现在第6～40管中，最高吸收峰OD值达到0.76，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来；

②使用0.1mol/L的NaHCO₃洗脱，得到两种多糖组分V-II、V-III，分别出现在第6～10管、第21～40管中，其最高峰OD值分别为0.45和0.12，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来；

③使用0.1mol/L的NaOH洗脱得到一种胞外多糖组分V-IV，出现在第20～32管中，其最高峰OD值为0.07，当洗脱超过2h之后没有明显的多糖成分被洗脱下来。

(8)将V-I、V-II、V-III，V-IV这些组份分别集中收集起来，置于透析袋中4℃透析48h，冷冻干燥备用。

(9)凝胶过滤层析：取含糖量最高的多糖V-I组分20mg用适量水溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，上Sephendex G-50(1.6×60cm)柱，用去离子水平衡48h，恒流泵控制流速9mL/h，用同一去离子水洗脱，每管3mL分部收集，硫酸-苯酚法检测，收集洗脱峰部洗脱液(第13～50管)，经真空浓缩、冷冻干燥获得白色(或略带浅黄)粉状的胞外多糖纯品V-1，其纯度大于99％。

将上述实施例中收集到胞外多糖纯品V-1做以下检测试验，下述检测方法中，如无特别说明，均为常规方法。

检测实验1：

以抽滤(Φ0.22μm)后的蒸馏水为空白对照，取实施例制备的胞外多糖纯品V-1适量，加水溶解，配制成2mg/mL样品待测液，室温，将抽滤后的溶液于190～500nm波长条件下紫外光谱扫描，检验多糖的纯度。

结果显示：结果表明，本发明的胞外多糖纯品中已基本不含有核酸、蛋白质及其他杂质成分。

检测实验2：

取上述实施例1胞外多糖纯品V-1干粉分别溶于蒸馏水、丙酮、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂中，配制成10.0mg/mL的溶液，观察试验结果。

结果显示：本发明的胞外多糖为纯白色(或略带浅黄)粉末状固体，无味，无香气，易溶于水，特别是热水中溶解度极大，不溶于丙酮、乙醇、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇等有机溶剂。

检测实验3：

称取150mg干燥的KBr，研磨至均匀粉末装到模具中，放到压片机压制成透明薄片，该片作为空白片；将实施例制备的胞外多糖纯品V-1 1mg与150mg干燥的KBr研细均匀，置于模具中，于油压机上压成透明薄片，即可用于红外光谱的测定。试样和KBr都应经干燥处理，研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响(测定4000-400cm^-1波长范围内EPS的红外吸收光谱，样品扫描次数16次，背景扫描次数16次，分辨率4.00cm^-1)。

结果显示：本发明的胞外多糖纯品V-1在3385cm^-1，2975cm^-1，1082cm^-1，1632cm^-1，1427cm^-1，1272cm^-1及1082cm^-1测得有吸收峰，说明样品在4000-400cm^-1区具有多糖类物质的一般吸收峰。Viili胞外多糖V-1的单糖残基以吡喃环和呋喃环的形式存在。

检测实验4：

取实施例制备的胞外多糖纯品V-1样品10mg于10mL离心管中，加入2mL三氟乙酸(TFA)，充氮气封管于120℃下油浴3h。减压蒸干水解液，加甲醇反复处理5次，以除尽三氟乙酸，真空干燥水解物，而后进行衍生化。准确称取10mg固体水解糖样、10mg盐酸羟胺和1mL无水吡啶，振荡混匀后于90℃下水浴反应30min并间歇振荡。取出后冷却至室温，加入1mL无水醋酸酐，于90℃下继续水浴反应30min进行乙酰化。取出后在冰浴中迅速冷却，加入1mL蒸馏水搅拌，用氯仿萃取3次，合并氯仿层，减压蒸干。样品再加入1mL氯仿重新溶解，用0.22μm有机微孔滤膜过滤，取0.5μL进行GC分析(条件为：采用DB-1701毛细管柱进行分离，经气相色谱分离条件研究，选择色谱条件：初温80℃，以10℃/min升至220℃(恒温30min)，进样口温度230℃，分流比为100∶1，程序升温初温80℃(恒温1min)，以10℃/min升至220℃(恒温30min)，检测器温度：250℃，气体流量：氢气40mL/min，空气400mL/min，氮气30mL/min)。

结果显示：本发明的胞外多糖V-1的糖链中含有6种单糖成分：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。各种单糖组成的摩尔比例为：鼠李糖、阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝7.41∶15∶8.85∶1∶3.25∶1.25。

检测实验5：

对Viili胞外多糖的功能性以秀丽隐杆线虫为动物模型进行检测。参见Lakowski B等的方法，秀丽线虫采用固体培养基进行培养。在20℃的培养条件下，同期化后至L4期的成虫(见同期化培养秀丽线虫的方法)转至各组相应的NGM实验培养板上，以该转移天数计为第0d，将实验板置于所需培养箱中进行培养，隔天计数秀丽线虫存活数目，直至线虫全部死亡。线虫死亡的标准为对刺激无任何反应或没有吞咽食物的动作。丢失的线虫或因爬到培养皿壁而死亡的线虫以及“虫袋”(worm bag)应从统计数据中排除。Viili EPS实验浓度分别为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL及400μg/mL。表1为20℃时不同浓度ViiliEPS对野生型秀丽线虫寿命的影响

表1

注：*p＜0.05，***p＜0.001。

结果显示：Viili胞外多糖在秀丽线虫的最适生长温度20℃下能够显著地延长线虫的平均寿命。

一种Viili胞外多糖及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。