专利摘要

本发明公开了一种嗜盐古生菌产胞外蛋白酶的培养基，涉及微生物发酵领域。单因素试验筛选嗜盐古生菌产胞外蛋白酶的最适碳源和最适氮源，以葡萄糖、蛋白胨、氯化钠作为响应面优化的基本因素，对试验因素进行Box‑Behnken试验设计，最优方案为：葡萄糖浓度1.1g/L，蛋白胨浓度0.9g/L，氯化钠浓度235.8g/L；其他成分为：甲酸钠浓度0.25g/L，醋酸钠浓度2.5g/L，丙酮酸钠浓度2.5g/L，KCl浓度5.4g/L，CaCl2浓度0.29g/L，NH4Cl浓度0.27g/L，MgSO4·7H2O浓度20.0g/L，pH7.0。菌株的胞外蛋白酶活力为19.86U/mL，比优化前提高了136％。

权利要求

1.一种嗜盐古生菌产胞外蛋白酶的培养基，其特征在于其组成为：

葡萄糖浓度1.1g/L；蛋白胨浓度0.9g/L；氯化钠浓度235.8g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl2：0.29g/L；NH4Cl：0.27g/L；MgSO4·7H2O：20.0g/L；pH 7.0；

按照下述步骤进行制备：

(1)利用单因素试验筛选碳源类物质，培养基分别采用酵母提取物、葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖为碳源，初始浓度设定为1g/L，筛选出最适碳源后，再在其浓度范围0-3.5g/L内确定出最适浓度为1g/L；

(2)利用单因素试验筛选氮源类物质，培养基分别采用亚硝酸钠、明胶、蛋白胨、鱼粉蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和氯化铵为氮源，初始浓度设定为1g/L，筛选出最适氮源后，再在其浓度范围0-3.5g/L内确定出最适浓度为1g/L；

(3)利用单因素试验确定最适氯化钠浓度。培养基中氯化钠浓度设定范围：100-2501g/L，得出最适浓度为220g/L；

(4)在单因素试验基础上，利用Box-Behnken试验设计，对嗜盐古生菌的产酶培养基进一步优化，得出最优方案为：葡萄糖浓度1.1g/L；蛋白胨浓度0.9g/L；氯化钠浓度235.8g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl2：0.29g/L；NH4Cl：0.27g/L；MgSO4·7H2O：20.0g/L；pH 7.0。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种嗜盐古生菌产胞外蛋白酶的领域。

背景技术

胞外蛋白酶是嗜盐古生菌生长繁殖过程中分泌的主要代谢产物。由于嗜盐古生菌独特的生长机制，其胞外蛋白酶也具有较强的耐盐性，且在高盐条件下也可以完成催化反应，因而可以应用到许多高盐条件下的催化反应中。蛋白酶在工业生产中的需求量极大，如何获得大量的有实用价值的蛋白酶是许多优秀学者所探讨的问题。研究发现从微生物中获得蛋白酶不仅方便易得，获得的量可观，并且微生物中的蛋白酶是可再生的，因此得到了人们越来越多的重视。国内外有大量关于蛋白酶的报道，嗜盐古生菌的胞外蛋白酶由于其独特的耐盐机制，近些年被开发利用到各个行业。

发明内容

针对现有技术中有关嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.产胞外蛋白酶培养基优化的研究较少的技术现状，本发明为了提供一种采用响应面法提高嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.产胞外蛋白酶能力的方法，采用响应面法优化了嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.产胞外蛋白酶的培养基，以期提高胞外蛋白酶的产量，为该菌株的产胞外蛋白酶工业化生产奠定基础。

一种嗜盐古生菌产胞外蛋白酶培养基，其组成为：酵母提取物：0.5g/L；蛋白胨F403：0.5g/L；NaCl：180g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。

优选其组成为：葡萄糖浓度1.1g/L；蛋白胨浓度0.9g/L；氯化钠浓度235.8g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。

利用上述一种嗜盐古生菌产胞外蛋白酶培养基生产蛋白酶的方法，按照下述步骤进行：

(1)利用单因素试验筛选碳源类物质，培养基分别采用酵母提取物、葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖为碳源，初始浓度设定为1g/L，筛选出最适碳源后，再在其浓度范围0-3.5g/L内确定出最适浓度为1g/L。

(2)利用单因素试验筛选氮源类物质，培养基分别采用亚硝酸钠、明胶、蛋白胨F403、鱼粉蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和氯化铵为氮源，初始浓度设定为1g/L，筛选出最适氮源后，再在其浓度范围0-3.5g/L内确定出最适浓度为1g/L。

(3)利用单因素试验确定最适氯化钠浓度。培养基中氯化钠浓度设定范围：100-2501g/L，得出最适浓度为220g/L。

(4)在单因素试验基础上，利用Box-Behnken试验设计，对嗜盐古生菌的产酶培养基进一步优化，得出最优方案为：葡萄糖浓度1.1g/L；蛋白胨F403浓度0.9g/L；氯化钠浓度235.8g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。

本发明在原始培养基的基础上通过单因素试验筛选了嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.产胞外蛋白酶的最适碳源和氮源，并确定了最适碳源和最适氮源的最适浓度，以及氯化钠最适浓度。最终以葡萄糖、蛋白胨F403、氯化钠作为响应面优化的基本因素，以单因素试验中得到的最适浓度为中心点，利用Design-expert 8.0.6对试验因素进行Box-Behnken试验设计。按照设计方案进行试验后，得出最优方案为：葡萄糖浓度1.1g/L，蛋白胨F403浓度0.9g/L，氯化钠浓度235.8g/L，甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO₄·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。在此培养基条件下，菌株的胞外蛋白酶活力为19.86U/mL，比优化前提高了136％。说明优化后的培养基可显著提高嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.产胞外蛋白酶的能力，此结果为工业化生产胞外蛋白酶奠定了基础。

附图说明

图1表示的是当氯化钠浓度为220g/L时，葡萄糖浓度与蛋白胨F403浓度之间的交互作用对菌株产胞外蛋白酶能力的影响。

图2表示的是当蛋白胨F403浓度为1g/L时，葡萄糖浓度与氯化钠浓度之间的交互作用对菌株产胞外蛋白酶能力的影响。

图3表示的是当葡萄糖浓度为1g/L时，蛋白胨F403浓度与氯化钠浓度之间的交互作用对菌株产胞外蛋白酶能力的影响。

具体实施方式

菌种：产胞外蛋白酶的嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号为CGMCC 1.10122。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

培养基：酵母提取物：0.5g/L；蛋白胨F403：0.5g/L；NaCl：180g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。

摇瓶培养：以2％的接种量将活化后的菌株接种到培养基中，在37℃，160rpm/min条件下培养5天。本发明中选用的所有材料、试剂和仪器设备都为本领域所熟知的,但不限制本发明的实施。

胞外蛋白酶活力的测定

参考ZBX 66030-87，用福林酚法测定蛋白酶活力。将酶液用相应的缓冲液稀释2倍，取4支干净的试管，标号0，1，2，3。在每一支试管中准确加入1mL酶液，然后向0号管中加入2mL0.4mol/L的TCA，在水温60℃下，将酶液和2％酪蛋白分别预热5min,然后向每一支试管里准确加入1mL酪蛋白，在60℃下反应20min后，立即向试管中加入0.4mol/L的TCA 2mL以终止反应。在室温下静置10min后，5000r/min离心15min，接着分别取1mL的反应液于干净的试管中，加入5mL 0.4mol/L的碳酸钠，1mL福林酚，40℃下显色20min后，以0管为空白，在波长680nm处测定吸光度。

酶活力单位定义为1mL的酶液在特定的温度，特定的pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以U表示。

计算公式为：

U：蛋白酶活力，U/mL

A：样品的平均吸光值

K：吸光常数

20：酶反应时间，min

n:酶液稀释倍数。

对比例：

以2％的比例将活化完成的嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.接种到200mL的培养基中(酵母提取物：0.5g/L；蛋白胨F403：0.5g/L；NaCl：180g/L；甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0)，将培养液置于的恒温摇床培养箱中(37℃，160r/min)进行培养，每天在无菌超净台内吸取出菌液，在波长600nm处利用紫外可见分光光度计测定菌液的吸光值，空白对照为纯培养基。同时取出一部分菌液进行离心(9000r/min，15min，4℃)以除去细胞，所得的上清液即作为酶液备用。嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.在此培养基条件下培养5天后其胞外蛋白酶产量为8.4U/mL。

实施例1：提高嗜盐古生菌产胞外蛋白酶能力的方法

通过单因素实验从几种常见的碳源类物质、氮源类物质中选出最适合菌株产胞外蛋白酶的碳源和氮源，然后再确定出菌株产酶的最适氯化钠浓度。在单因素实验基础上以葡萄糖、蛋白胨F403、氯化钠作为响应面优化的基本因素，以单因素试验中得到的最适浓度为中心点，利用软件，以胞外蛋白酶活力为响应值，对培养基的组成成分进行了优化,得出菌株产胞外蛋白酶的条件。

在37℃，160rpm/min条件下，将菌株培养5天，培养基的碳源和氮源分别从几种物质中进行筛选，初始浓度均设为1g/L。筛选出最适碳源和氮源后，在浓度为0～3.5g/L范围内确定各自的最适浓度。氯化钠浓度范围设为100～2501g/L g/L，培养基中的其他物质和含量为：甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。本发明提供一种采用响应面法提高嗜盐古生菌产胞外蛋白酶能力的方法，在37℃，160rpm/min条件下，将菌株培养5天，培养基中的葡萄糖浓度1.1g/L，蛋白胨F403浓度0.9g/L，氯化钠浓度235.8g/L，培养基中的其他物质如上描述。在此条件下菌株的胞外蛋白酶活力达到了19.86U/mL，比优化前的胞外蛋白酶产量8.4U/mL提高了136％，从而表明了上述因素对菌株产胞外蛋白酶能力的影响最大，使用响应面法优化发酵培养基可显著提高嗜盐古生菌产胞外蛋白酶的能力，此结果为工业化生产胞外蛋白酶奠定了基础。

实施例2：嗜盐古生菌产胞外蛋白酶条件的优化

1嗜盐古生菌产胞外蛋白酶条件的优化

(1)单因素试验:

培养基分别采用酵母提取物、葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖为碳源，初始浓度设定为1g/L，得出最适碳源后，其浓度设定范围：0g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L，得出碳源的最适浓度。培养基分别采用亚硝酸钠、明胶、蛋白胨F403、鱼粉蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和氯化铵为氮源，初始浓度设定为1g/L，得出最适氮源后，其浓度设定范围：0g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L，得出氮源最适浓度。将培养基中的氯化钠浓度设定为10g/L，130g/L，160g/L，190g/L，220g/L，250g/L，得出最适氯化钠浓度。其他组分及含量甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。

(2)单因素试验结果:

碳源：检测结果表明，当以葡萄糖作为碳源时，菌株的胞外蛋白酶产量达到最高，因此葡萄糖是嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.产酶的最适碳源，当葡萄糖浓度在1g/L时，菌株的胞外蛋白酶产量达到了最高，因此菌株产胞外蛋白酶的最适葡萄糖浓度为1g/L。

氮源:检测结果表明：当以蛋白胨F403作为氮源时，菌株的胞外蛋白酶产量达到最高，因此蛋白胨F403是菌株的最适发酵氮源，当蛋白胨F403浓度达到1g/L时，菌株的胞外蛋白酶产量最高，因此，菌株产胞外蛋白酶的最适蛋白胨F403浓度为1g/L。

氯化钠：盐浓度低于100g/L时，菌株基本上不再生长。当培养液中的氯化钠浓度为220g/L时，菌株分泌胞外蛋白酶的含量是最高的，超过220g/L，蛋白酶活力被抑制，因此，220g/L的氯化钠浓度是极端嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.的产胞外蛋白酶的最适浓度。

实施例3：嗜盐古生菌产胞外蛋白酶条件的优化

1响应面试验:

以葡萄糖、蛋白胨F403、氯化钠作三个因素进行响应面试验设计，采用Design-expert软件进行试验设计、分析和培养条件的优化，Box-Behnken试验的设计因素和水平表见表1。以单因素试验中得到的各个因素的最适浓度作为中心水平，以胞外蛋白酶酶活为响应值，中心点试验重复4次，以估计试验误差。其他组分及含量甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0。

表1响应面分析因素与水平

2响应面试验

通过统计软件对试验结果的分析绘制响应面曲线图和等高线图,从曲线图中可以直观分析各因素之间的交互作用对响应值的影响。

3验证试验

按照响应面试验得到最优培养条件，进行培养基的配制，将活化后的菌株接种到灭菌后的培养基中，做3个平行试验，比较最终得到的胞外蛋白酶产量的值与响应面优化的理论预测值的误差，证响应面优化的可靠性。

4响应面试验结果

根据对表2中的试验数据进行回归分析得到拟合的全变量编码水平的二次回归方程为：蛋白酶活力U＝+20.87+1.86X₁-3.26X₂+3.45X₃+0.25X₁X₂-2.20X₁X₃+0.011X₂X₃-2.96X₁²-11.88X₂²-3.04X₃²

对试验结果进行统计分析,得到的方差结果见表3，所得模型的F＝13.68，p＝0.00012<0.001，是高度显著的。此模型的失拟值p＝0.0847＞0.05，说明失拟值相对于误差项是呈不显著的，因而模型选择合适。回归系数R²＝0.9462，说明该模型的拟合性较好，可用此模型来分析和预测极端嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.的最佳产胞外蛋白酶的培养条件。

表2 Box-Benhnken试验方案与结果

表3试验结果的方差分析

5响应面分析

葡萄糖、蛋白胨F403、氯化钠的交互曲线图见附图1，2，3。

附图1表示的是当氯化钠浓度为220g/L时，葡萄糖浓度与蛋白胨F403浓度之间的交互作用对菌株产胞外蛋白酶能力的影响，从附图中可以看出曲面图形的顶点落在中心位置，区域俯视图形越趋近椭圆形，说明葡萄糖浓度与蛋白胨F403浓度之间的交互作用很显著。

附图2表示的是当蛋白胨F403浓度为1g/L时，葡萄糖浓度与氯化钠浓度之间的交互作用对菌株产胞外蛋白酶能力的影响，从附图中可以看出曲面图形曲线比较平稳，而区域俯视图形也趋近于圆形，说明葡萄糖浓度与氯化钠浓度之间的交互作用不太显著。

附图3表示的是当葡萄糖浓度为1g/L时，蛋白胨F403浓度与氯化钠浓度之间的交互作用对菌株产胞外蛋白酶能力的影响，从附图中可以看出曲面图形曲线比较陡，区域俯视图形也趋近于椭圆形，说明蛋白胨F403浓度与氯化钠浓度之间的交互作用很显著。当蛋白胨F403过高时，会抑制嗜盐古生菌Halobacteriaceae sp.的产酶，原因可能是蛋白胨F403中的某种物质含量太多从而抑制了菌株的生长代谢。

6响应面结果的优化分析和条件验证

在试验因素的水平范围内，以胞外蛋白酶酶活力最高为指标,得出葡萄糖含量，蛋白胨F403含量，氯化钠含量三个因素的最优方案为：葡萄糖浓度1.1g/L，蛋白胨F403浓度0.g/L，氯化钠浓度235.8g/L，甲酸钠：0.25g/L；醋酸钠：2.5g/L；丙酮酸钠：2.5g/L；KCl：5.4g/L；CaCl₂：0.29g/L；NH₄Cl：0.27g/L；MgSO4·7H₂O：20.0g/L；pH 7.0，相应的响应面二次模型预测菌株产胞外蛋白酶酶活力为22.107U/mL，按照响应面结果提供的最优方案进行三次平行试验，最终得到的胞外蛋白酶酶活力为19.86U/mL，与预测值之间的误差在0.11％，说明响应面优化的参数是可行的。

一种嗜盐古生菌产胞外蛋白酶的培养基专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。